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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
伤寒沙门菌是一种重要的人类病原菌，且已成
为原核生物基因表达调控研究的模式菌之一［1，2］。
收稿日期 ： 2014-02-25
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31000076），中国博士后科学基金项目（2013M531278），江苏省博士后科研资助计划项目（1202011B），
江苏大学大学生科研立项资助项目（12A123，13A239）
作者简介 ：朱云霞，女，硕士研究生，研究方向 ：病原菌分子致病机制 ；E-mail ：zhuyunxia3032@163.com
通讯作者 ：张海方，男，博士，副教授，研究方向 ：分子细菌学 ；E-mail ：haifangzhang@sina.com
伤寒沙门菌线性质粒 pBSSB1 的 p17 基因的
生物学功能分析
朱云霞1  吴佳1  龚明玉1  侯书宁1  张绮思1  陈敏洁1  张海方1，2
（1. 江苏大学 基础医学与医学技术学院 医学生物化学系，镇江 212013 ；2. 苏州大学 附属第二医院 检验科，苏州 215004）
摘 要 ： H ：z66 阳性伤寒沙门菌含有一特有的介导鞭毛单向相变换的线性质粒 pBSSB1，其上第 17 号基因（p17）编码一未
知功能蛋白（P17）。利用 λ-Red 系统制备 p17 基因缺陷变异株，测定变异株和野生株的生长曲线，比较其生长差异，同时通过半
固体 LB 培养基进行动力试验比较其动力差异。利用 PCR 技术扩增获得 p17 基因，构建其重组表达载体 pET28a（+）-p17，通过镍
柱纯化目的蛋白 P17-His6，纯化后蛋白作为抗原免疫兔子以制备多克隆抗体。结果显示，制备了 p17 基因缺陷变异株，变异株的
生长明显迟缓于野生株（P<0.05），变异株的动力明显减弱。构建了重组表达载体 pET28a（+）-p17，纯化获得了高纯度的目的蛋
白 P17-His6 并制得相应的多克隆抗体。
关键词 ： 伤寒沙门菌 线性质粒 pBSSB1 p17
A Preliminary Study on the Biological Function of a Gene p17 Located
on a Linear Plasmid pBSSB1 of Salmonella enterica serovar Typhi
Zhu Yunxia1 Wu Jia1 Gong Mingyu1 Hou Shuning1 Zhang Qisi1 Chen Minjie1 Zhang Haifang1，2
（1. Department of Biochemistry and Molecular Biology，School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang
212013 ；2. Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou 215004）
Abstract: pBSSB1 is a linear plasmid which mediates the flagellar phase variation in H ：z66 positive Salmonella enterica serovar Typhi
（S. Typhi）. The gene named p17 is located on pBSSB1 and it encodes the protein P17 whose function is unknown. The p17 deleted mutant of
S. Typhi was prepared through the λ-Red recombination system. The growth curves of wild type and p17 mutant strain were detected to compare
their growth ability. The motility of wild type and p17 mutant strains was compared through the experiments on the semi-solid LB plates. The
specific primers were designed to amplify the gene p17 by PCR. The amplicon was inserted into the expression vector pET28a（+）to construct
recombinant vector pET28a（+）-p17, which was then transferred to E. coli BL21（DE3）to be expressed. The recombinant protein P17-His6
was purified with Ni-TED packed column and was used as immunogen to prepare the rabbit anti-P17 polyclonal antibody. The results showed
that p17 deleted mutant of S. Typhi was constructed successfully. It was showed that the growth of p17 mutant strain was significantly slower
compared with the wild type strain（P<0.05）. The motility of p17 mutant strain was decreased obviously compared to the wild type strain. The
gene p17 of S. Typhi was inserted into the vector pET-28a（+）and was expressed in E. coli BL21（DE3）. The rabbit anti-P17 polyclonal
antibody was prepared.
Key words: Salmonella enterica serovar Typhi Linear plasmid pBSSB1 p17
pBSSB1 是 H∶z66 阳性伤寒沙门菌所特有的一线性
质粒，该质粒是肠杆菌科中目前为止发现的首个线
2014年第10期 169朱云霞等：伤寒沙门菌线性质粒 pBSSB1 的 p17基因的生物学功能分析
性质粒，其介导了 H∶z66 阳性伤寒沙门菌鞭毛的
单向相变换［3-6］。pBSSB1 全长 27 kb，共编码 33 个
基因，其中包括二相鞭毛素编码基因 fljBz66 和 fljA 样
基 因［3，7，8］。Baker 等［3］ 报 道 pBSSB1 可 能 的 双 向
复制起始点位于该质粒编码的第 17 号基因（p17）
的上游。基因 p17 经生物信息学分析和预测，其编
码蛋白 P17 含有特征性同源序列，该序列存在于参
与调控 DNA 复制等生物学功能的 DNA 结合蛋白如
ParA 和 Soj 等 蛋 白 中［9］。 另 外， 蛋 白 P17 具 有 与
RepABC 质粒编码的 RepA 蛋白同源的 ATP 酶结构
域［10］。但目前为止，关于基因 p17 的确切生物学功
能还不甚清楚。
本研究通过制备 p17 基因缺陷变异株，测定
缺陷株和野生株的生长曲线，对 p17 基因可能的生
物学功能进行初步探讨 ；另外，通过原核表达蛋白
P17，并制备其相应的多克隆抗体，利用免疫印迹技
术检测抗体的特异性以及 p17 基因的表达情况，旨
为深入研究 p17 基因的生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 伤寒沙门菌 GIFU10007 由日本
岐阜大学医学院微生物室惠赠 ；质粒 pKD46（温度
敏感型，含有受阿拉伯糖启动子调控的 gam，bet 和
exo 基因，Apr）由北京军事医学科学院微生物流行
病研究所惠赠 ；质粒 pET28a（+）、E. coli DH5α、E.
coli BL21（DE3）等均由本室保存。
1.1.2 主要试剂和仪器 DNA 聚合酶 pfu、DNA 聚
合 酶 rTaq、 限 制 性 核 酸 内 切 酶 Nco I、Xho I、T4
DNA 连接酶均购自宝生物工程有限公司（大连，
TaKaRa）， 质 粒 提 取 试 剂 购 自 Axygen 公 司。 其 他
试 剂 均 为 进 口 或 国 产 分 析 纯。Gene Pulsero Ⅱ 电
转 化 仪（Bio-Rad）， 核 酸 紫 外 检 测 仪（Eppendorf
Biophotometer），PCR 仪（AB I 2720）， 蛋 白 电 泳
仪（Bio-Rad）， 凝 胶 成 像 系 统（Gene Genius BIO
IMAGING SYSTEM），蛋白电泳仪（Bio-Rad），离心机，
超声破碎仪。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据线性质粒 pBSSB1 的序列和
pET28a（+）的序列信息，设计基因 p17 缺陷株制备、
缺陷株验证及构建 p17 编码蛋白 P17 的重组表达载
体 pET28a（+）-p17 等引物。制备 p17 基因缺陷株
引物设计 ：p17 基因的 ORF 全长 641 bp，分别设计
两对引物 L1-Kl/R1-Kr 和 L2/R2，扩增含有长度为 79
bp 的 p17ORF 上下游同源臂的卡那霉素抗性基因片
段，用来敲除 p17 全部的 ORF。p17 缺陷株验证引
物 V-L/V-R 设计 ：V-L 来自基因序列中上游同源臂
外侧一段 16 bp 的序列，V-R 来自卡那霉素抗性基
因中一段 16 bp 的序列。重组表达载体 pET28a（+）-
p17 引物设计 ：在 p17 基因上下游设计引物 PA/PB，
在 5 端分别加上 Nco I 及 Xho I 酶切位点用以酶切后
连接 pET28a（+）载体。引物均由上海生工生物技
术服务有限公司合成，序列如表 1 所示 。
表 1 引物序列
引物名称 引物序列（5-3） 用途
L1-Kl ATGTTCATGAGTGATTCCATGAAATTTCTTTATAA ACATCGGTCTGACGCTCAGTGGA 缺陷株制备
R1-Kr CATATCATCAAGCCATGAATTTTTTTTCTTTGCTCAT AAGTTTCGGCCTATTGGTTAA 缺陷株制备
L2 GTATATTATAGCATGTTGGCAATAGCTGACGGCAATAAAATGTTCATGAGTGATTCCAT 缺陷株制备
R2 ATTAAAAGCAGTTTCAACCGCAATCTTTTGAAAAGATTGCATATCATCAAGCCATGAAT 缺陷株制备
V-L CGTTAGTTCCGAATCC 缺陷株验证
V-R ATGGCTCATAACACCC 缺陷株验证
PA（Nco I） GACCATGGATATGTTAGGGGGTTTTATG 蛋白载体构建
PB（Xho I） ATCTCGAGTGCCTTCTCTTTTGCTTT 蛋白载体构建
1.2.2 感 受 态 细 胞 的 制 备 及 Red 重 组 功 能 的 诱
导 将编码 Red 重组系统的质粒 pKD46 电转至伤寒
沙门菌 GIFU10007 中，筛选阳性克隆，作为下一步
转化的宿主菌，即 007-pKD46。挑取 007-pKD46 单
菌落接种于 2 mL LB 培养基中 37℃、250 r/min 振摇
过夜 ；然后 1∶100 转接至 20 mL 等渗 LB 培养基中，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期170
37℃、250 r/min 振荡培养至对数早期（OD600 ：0.4）；
加入 L-阿拉伯糖（终浓度为 1 mmol/L），诱导 1 h 后
冰上静置 30 min，离心弃上清 ；沉淀用预冷的灭菌
水漂洗 3 次，再用 4 mL 预冷的 10% 甘油洗 1 次，
最后用 80 μL 预冷的 10% 甘油悬浮，每 40 μL 分装
于 EP 管中放于冰上备用。
1.2.3 基因 p17 缺陷株的制备 在参考文献［11］
的基础上稍作改动，主要步骤如下 ：以环状质粒
pET28a（Kanr）为模板，用特异性引物 L1-Kl/R1-Kr
扩增出带有 p17 基因上下游同源臂的卡那霉素抗性
基因片段 F1。然后以第 1 轮 PCR 产物为模板，用
L2/R2 做引物扩增出延长了同源臂的片段 F2。用酚-
氯仿抽提纯化 PCR 产物 F2。将 007-pKD46 的感受
态细胞、电极杯和 PCR 产物均放于冰上，保持低
温状态。打开电转仪，调节参数 ：电阻 200 Ω，电
容 25 μF，电压 2.0 kV。取 2 μg PCR 产物 F2 加入 40
μL 感受态细胞中，轻轻混匀，转入电极杯中，迅速
放到电转仪上，启动电击。听到“滴”声后，取出
电极杯，加入 1 mL 37℃预温的 LB 液体培养基轻轻
混匀，转移至 EP 管中，置于 37℃金属浴 1 h。然后
25℃、4 000 r/min，离心 10 min，弃去 900 μL 上清液，
将剩余液体重悬细菌后涂布于含有卡那霉素的 LB
平板 37℃过夜，挑取长出的若干菌落通过验证引物
V-L/V-R 进行 PCR 筛选，阳性转化子最后经测序确
认，即为 p17 基因缺陷株，命名为 Δp17。
1.2.4 生 长 曲 线 测 定 分 别 挑 取 伤 寒 沙 门 菌
GIFU10007 和 Δp17 单 菌 落 于 2 mL LB 培 养 基 中，
37℃、250 r/min 振荡培养过夜 ；过夜细菌以 1∶100
转接于新鲜等渗（pH 7.0）LB 培养液中（野生株和
缺陷株的 OD600 值一致），37℃、250 r/min 振荡培养，
每隔 1 h 用分光光度计检测 OD600 值并记录，直至
12 h。试验经 3 次生物学重复后，以 OD600 值为纵坐
标，培养时间为横坐标制作生长曲线，比较野生株
和 p17 缺陷株的生长情况。
1.2.5 动力试验 分别挑取伤寒沙门菌 GIFU10007
和 Δp17 单菌落进行四区划线，用灭菌后的牙签挑
取划线后的大小均匀的野生株和 Δp17 单菌落接种于
0.3% 的半固体 LB 培养板上，置于 37℃培养箱中培
养 18 h 后观察结果。
1.2.6 重组载体的构建与鉴定 参考文献［12］的
方法，用 DNA 胶回收试剂盒回收 PCR 产物，Nco Ⅰ
和 Xho Ⅰ 同 时 双 酶 切 PCR 回 收 产 物 和 表 达 载 体
pET28a（+），酶切产物用酚 / 氯仿抽提、乙醇沉淀
纯化后，用 T4 DNA 连接酶 4℃过夜连接，连接产物
用热激法转化至大肠杆菌 DH5α。挑取若干连接产物
转化菌单菌落，分别增菌于含有卡那霉素的 LB 平
板上，37℃培养 6 h 后，收集上述菌体于 30 μL 双蒸
水中，加等体积的酚 / 氯仿漩涡震荡，离心取上清
15 μL 上样，1 % 琼脂糖凝胶电泳观察质粒大小，筛
选可疑的阳性克隆质粒。提取可疑的阳性克隆质粒，
采用双酶切和 PCR 方法鉴定阳性克隆，再通过 DNA
测序分析最终确认。阳性克隆质粒热激法转化至 E.
coli BL21（DE3）。
1.2.7 P17 蛋 白 的 表 达 挑 取 新 鲜 的 含 重 组 质 粒
pET28a（+）-p17 的大肠杆菌 BL21（DE3）单菌落
及含空质粒 pET28a（+）的对照大肠杆菌 BL21（DE3）
单菌落分别置于 2 mL LB 培养液中（卡那霉素终浓
度 50 μg/mL），37℃振摇过夜，次日以 1∶100 加入
20 mL LB 培养液中 37℃振摇 2-3 h 后长至 OD600nm 为
0.5-0.8，加入 IPTG 至终浓度分别为 0.1 mmol/L，于
20℃继续振摇 5 h 进行诱导，离心取沉淀，4℃超声
破碎后离心取上清液进行 SDS-PAGE。
1.2.8 P17 蛋白的纯化 在上述表达的优化条件下
用 1 000 mL LB 培养基大批量诱导培养，离心收集
菌体后，用 PBS（pH7.2）洗涤 3 次，按照每克菌（湿重）
加入 15 mL 过柱缓冲液的比例重悬菌体，超声破碎
后离心收集上清液。以 15 mL/h 流速上样于 Ni 柱中
之后用 20 倍柱体积的洗涤缓冲液冲洗 Ni 柱，移除
未结合的蛋白 ；用洗脱缓冲液洗脱结合于 Ni 柱的蛋
白。收集洗脱液，加入到处理后的透析袋中进行透析，
透析后的蛋白取出离心取上清，并进行 SDS-PAGE。
1.2.9 兔抗 P17 蛋白的多克隆抗体的制备 首次免
疫取上述纯化获得的目的蛋白 P17 与弗氏完全佐剂
1∶1 乳化，按每只兔 50 μg/mL 抗原剂量，于背部皮
下多点注射共计 1 mL 的方式进行免疫，之后每隔 1
周用弗氏不完全佐剂与纯化获得的目的蛋白 P17 以
1∶1 乳化，共免疫 5 次，末次免疫 1 周后颈动脉取
血制备抗血清。抗血清经初步纯化后获得兔抗 P17
蛋白的多克隆抗体，分装后于 -80℃保存备用。用抗
体与伤寒沙门菌 GIFU10007 全菌蛋白进行 Western-
2014年第10期 171朱云霞等：伤寒沙门菌线性质粒 pBSSB1 的 p17基因的生物学功能分析
blotting 以检测抗体的特异性，具体方法见参考文
献［12］。
1.2.10 统计学分析 数据分析采用 SPSS 16.0 统计
软件。多组间均数比较采用单因素方差分析，以 P ＜
0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 伤寒沙门菌pBSSB1-17基因缺陷变异株的制备
如图 1 所示，PCR 扩增得到 1 165 bp 的 F1 片段，
以 F1 片段为模板，PCR 扩增获得含同源臂的 1 243
bp 的片段 F2 ；将 F2 片段电击转化入含有 pKD46 的
伤寒沙门菌野生株感受态细胞中，在含卡那霉素（终
浓度为 50 μg/mL）的 LB 平板筛选到了阳性克隆，
用 V-L/V-R 作引物通过 PCR 验证 8 个阳性克隆，均
获得了 272 bp 的 DNA 片段，与预期结果一致，证
明 p17 基因缺陷株制备成功，命名为 Δp17。
表明 Δp17 的生长能力明显迟缓于野生株（P<0.05），
提示 p17 基因可能参与调控细菌的生长。
2000
bp
M F1
bp
1000
1165
A
2000
bp
MF2
bp
1000
1243
B
500
bp
M1 2 3 4 5 6 7 8
bp
250
100
1243
C
A ：第 1 轮 PCR 产 物 的 电 泳 分 析（M ：DL2000 DNA 标 准 参 照 物，F1 ：
1 165 bp）；B ：第 2 轮 PCR 产物的电泳分析（M ：DL2000 DNA 标准参照物，
F2 ：1 243 bp）；C ：缺陷株制备后 PCR 验证的电泳分析（M ：DL2000 DNA
标准参照物，1-8 ：验证片段 271 bp）
图 1 伤寒沙门菌 pBSSB1 的 p17 基因缺陷变异株的制备
2.2 p17基因缺陷株生长特性分析
p17 基因缺陷株和伤寒沙门菌 GIFU10007 野生
株在普通培养条件下的生长曲线如图 2 所示，结果
0.8
1.0O
D
60
0 1.2
䟾⭏Ṛ
p17㕪䲧Ṛ
1.4
1.6
1.8
2.0
0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 4 5 6ᰦ䰤h7 8 9 10 11 123
图 2 伤寒沙门菌 GIFU10007 野生株和 p17 基因缺陷株的
生长曲线
2.3 野生株和缺陷株的动力比较
伤寒沙门菌 GIFU10007 野生株和 p17 基因缺陷
株在 0.3% 的半固体培养基上的动力比较如图 3 所示，
p17 基因缺失后其动力明显减弱，说明 p17 基因参与
调控细菌的动力。
Δp17
䟾⭏Ṛ
图 3 伤寒沙门菌 GIFU10007 野生株和 p17 基因缺陷株的
动力图
2.4 伤寒沙门菌P17蛋白表达载体的构建
如图 4 所示，PCR 扩增获得了与预期大小相符
的 646 bp 的 p17 基因片段。该片段经 Nco Ⅰ和 Xho
Ⅰ双酶切后克隆到表达载体 pET28a（＋）上，将重
组质粒 pET28a（＋）-p17 转化至大肠杆菌 DH5α 得
到了阳性克隆 。提取阳性克隆的质粒，经 Nco I 和
Xho Ⅰ双酶切获得约 646 bp 的片段，大小与 PCR 产
物一致，证明 P17 蛋白表达载体构建成功。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期172
2.5 P17-His6重组蛋白的表达与纯化
在 最 佳 的 条 件 即 20℃，IPTG 终 浓 度 为 0.1
mmol/L 进行诱导 5 h，上清经 Ni 柱纯化获得 P17-
His6 蛋白，结果如图 5 所示。
是环状结构这一传统观点［14］。
线性质粒 pBSSB1 介导 H∶z66 阳性伤寒沙门菌
的鞭毛单向相变换，该质粒全长 27 kb，共编码 33
个基因，其表达特性已由本实验室报道，特别是其
中二相鞭毛素编码基因 fljBz66 和 fljA 样基因功能已
明确［3-8，15，16］。另外，我们发现 Fis 蛋白可以影响
pBSSB1 的稳定性［17］。通过对其序列比对分析和 GC
含量偏移分析发现，紧邻基因 p17 的上游可能是该
质粒的一个双向复制起始位点。基因 p17 编码蛋白
（P17），具有 ParA 和 Soj 蛋白的高度同源结构域序
列。研究表明，ParA 和 Soj 蛋白参与许多质粒、噬
菌体和细菌基因组染色体 DNA 的复制和分配［9］。另
外，P17 具有与 RepABC 质粒编码的 RepA 蛋白同源
的 ATP 酶结构域，在 17 号基因的编码区上游含有
GANTC 序列，该序列是 RepABC 质粒编码的 repABC
操纵子所具有的特征性序列［10］。另外，Zhang 等［18］
在研究链霉菌属线性质粒 pFRL1 时发现编码的 rlr
基因可以帮助启动该质粒的复制，由于 rlr 基因也紧
邻线性质粒 pFRL1 的复制起始区，我们推测线性质
粒 pBSSB1 编码的 17 号基因可能和链霉菌线性质粒
pFRL1 的 rlr 基因具有类似的功能。但是，P17 蛋白
在伤寒沙门菌中发挥作用的分子机制还有待于深入
研究。
4 结论
本研究首次制备了伤寒沙门菌 pBSSB1 的 p17
基因缺陷株，发现缺陷株的生长明显迟缓于野生
株，且 p17 基因缺失后细菌的动力明显减弱，这提
示基因 p17 可能具有调控细菌的生长和动力等功能 ；
另外，克隆表达了基因 p17，纯化获得了重组蛋白
P17-His6 及其多克隆抗体，为进一步深入研究基因
p17 的生物学功能及其作用机制奠定了坚实的基础。
参 考 文 献
［1］Everest P, Wain J, Roberts M, et al. The molecular mechanisms of
severe typhoid fever［J］. Trends Microbiol, 2001, 9（7）：316-
图 4 重组表达载体 ET28a（+）-p17 的鉴定
750
500
646
bp
M 1 2
bp
27
36
50
90
118
20
P17-His6
kD
M 1 2 3 4 5 6 7
bp
M ：标准分子量蛋白 ；1 ：空质粒转化菌全菌蛋白 ；2 ：空质粒转化菌上清 ；
3 ：空质粒转化菌沉淀 ； 4 ：重组表达菌全菌蛋白 ；5 ：重组表达菌上清 ；6 ：
重组表达菌沉淀 ；7 ：Ni 柱纯化的 P17-His6
图 5 重组蛋白 P17-His6 的表达与纯化
2.6 兔抗P17-His6多克隆抗体的鉴定及应用
将重组蛋白 P17-His6 免疫兔子制备了兔抗 P17
的多克隆抗血清，纯化后的多克隆抗体与伤寒沙门
菌 GIFU10007 野生株和 p17 基因缺陷株的全菌蛋白
经 Western blotting 鉴定，如图 6 所示，在缺陷株中
未鉴定到 p17 基因的编码蛋白 P17，说明所制备的
抗体与抗原反应的特异性良好，同时也说明 p17 基
因在正常生长条件下有一定的表达，提示该基因具
有一定的生物学功能。
3 讨论
质粒是指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色
体以外的 DNA 分子，它们能为宿主提供抗药性等一
些额外的功能［13］。绝大多数的细菌质粒都是闭合环
状 DNA 分子，1979 年在娄彻霉菌中发现了第一例
原核生物线性质粒，该发现纠正了所有细菌质粒都
1 2 3 ⴞⲴᶑᑖ
1 ：p17 缺陷株 ；2，3 ： S. Typhi GIFU 10007 野生株
图 6 抗体特异性的免疫印迹鉴定
2014年第10期 173朱云霞等：伤寒沙门菌线性质粒 pBSSB1 的 p17基因的生物学功能分析
320.
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（责任编辑 李楠）