全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2012-01-11
作者简介 : 孙敏 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 海洋油污染处理 ; E-mail: sun_nwsuaf@163.com
通讯作者 : 沈先荣 , 男 , 研究员 , 博士生导师 , 研究方向 : 海洋生物 ; E-mail: xianrong_sh@yahoo.com
高效柴油降解菌 Acinetobacter sp. W3分离鉴定及
降解酶基因扩增分析
孙敏1 沈先荣2 侯登勇2 施展2 罗群2 何颖2
（1 第二军医大学，上海 200433; 2 海军医学研究所，上海 200433）
摘 要： 从柴油污染的海水样品中分离高效柴油降解细菌，分析菌株对柴油的降解能力及降解酶基因，为海洋柴油污染的
生物修复奠定基础。选取浙江定海港柴油污染的海水样品，进行降解菌的富集培养；采用常规方法分离筛选高效柴油降解菌。利
用革兰氏染色、形态学观察、生理生化鉴定及 16S rDNA分析等方法对降解菌株进行种属鉴定。采用紫外吸收法测定菌株对柴油
的降解率。采用 PCR方法、核酸序列测定和比对，对其降解酶基因进行扩增分析。筛选出一株高效降解菌，形态学观察及生理生
化鉴定初步确定为不动杆菌。16S rDNA序列分析及比对结果表明，其 16S rDNA序列与威尼斯不动杆菌（Acinetobacter venetianus）
属的序列同源性达到 99.7%，命名为不动杆菌 W3（Acinetobacter sp. W3），该菌对柴油的 7 d降解率达到 84.7%。PCR方法从
Acinetobacter sp. W3菌株中的基因组 DNA和质粒 DNA上扩增到了大小为 540 bp的烷烃羟化酶基因 alkB和 864 bp的 CYP153A部
分 DNA片段，分别与 Acinetobacter venetianus 1-D-2的 alkB和 Acinetobacter sp. OC4、Acinetobacter sp. EB104的 CYP153具有 99% 和
98 %的同源性。从定海港口柴油污染海水分离得到一株高效柴油降解菌 Acinetobacter sp. W3，该菌属于不动杆菌属，含有烷烃降
解酶基因，能高效降解柴油污染物，有望应用于海水柴油污染的生物修复。
关键词： 柴油降解菌 alkB CYP153A 柴油污染 生物修复
Isolation，Identification of Alkane-degrading Bacteria Strain
Acinetobacter sp. W3 and Alkane Hydroxylase Genes Analysis
Sun Min1 Shen Xianrong 2 Hou Dengyong 2 Shi Zhan 2 Luo Qun 2 He Ying2
（1Second Military Medical University, Shanghai 200433; 2Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433）
Abstract: It was to isolate and identify high efficiency diesel-degrading bacteria from diesel polluted sea water, and analyze the degrading
ability and alkane hydroxylase genes of the diesel-degrading bacteria. Enrichment and isolation of diesel-degrading bacteria from sea water
sample from Dinghai port were carried out. One bacteria strain with high efficiency degradability was separated and selected to be further study.
The general characteristics were decided by the physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence. PCR method was used to analyze
the alkane hydroxylase genes in separated bacteria. Results showed that the bacterium was tentatively classified as Acinetobacter sp. according
to its physiological and biochemical characteristics. 16S rDNA sequencing result confirmed that it belonging to Acinetobacter sp, thus it was
named as Acinetobacter sp. W3. The degrading ratio of Acinetobacter sp. W3 reached 84.7% at 7th day. PCR results showed that Acinetobacter
sp. W3 harbored both alkB and CYP153A genes in genomic DNA and plasmid DNA. The partical of these two genes, 540 bp of alkB and 864 bp
of CYP153A, showed 99% identification to the alkB of Acinetobacter venetianus 1-D-2, and 98% identification to the CYP153 of Acinetobacter
sp. OC4 and Acinetobacter sp. EB104, respectively. It proved that Acinetobater sp. W3 has the potential to be used in bioremediation of diesel
polluted sea water.
Key words: Diesel oil degrading bacteria alkB gene CYP153A gene Diesel oil pollution Bioremediation
柴油是运输业重要的动力燃料。近年来，在海 洋运输过程中，柴油燃料的使用和含油废水的排放
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期160
钠（300℃烘 1 h，冷却后装瓶备用），硫酸，二氯
甲烷（色谱纯）等购自国药集团公司 ；革兰氏染色
试剂盒，细菌微量生化反应管，细菌基因组及质粒
DNA 小量抽提试剂盒，PCR 扩增试剂盒等购自美国
Fermentas 公司。
1.1.2 培养基 LB 培养基：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，
NaCl 10 g，pH7.0，蒸馏水 1 000 mL，若配制固体培
养基需另加入15 g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20 min。
人工海水培养基（MMC）： NaCl 24 g，MgSO4·7H2O 7.0
g，NH4NO3 1.0 g， KCl 0.7 g， KH2PO4 2.0 g， Na2HPO4 3.0
g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.4，加适量微量元素液后
过滤除菌。微量元素液 ：CaCl2 2 mg/L，FeCl3·6H2O
50 mg/L，CuSO4 0.5 mg/L，MnSO4·H2O 0.5 mg/L，
ZnSO4·7H2O 10 mg/L。油培养基 ：人工海水培养基
（MMC）灭菌后加入含适量经单独灭菌的柴油。
1.1.3 引物 所有引物都委托上海生工工程有限公
司合成。16S rDNA 扩增通用引物；AlkB 和 CYP153A
的 PCR 引物序列采用的是这两个基因的保守序
列，引物序列如下。AlkB 引物（F: 5-AAYACNGCN-
CAYGARCTNGGVCAYAA-3; R:5-GCRTGRTG-
RTCHGARTGNCGYTG-3）；CYP153A 引 物（F: 5-T
GTCGGTTGAAATGTTCATYGCNMTGGAYCC-3；R:
5-TGCAGTTCGGCAAGGCGGTDCCSRYRCAVCKRT
G-3）。
1.2 方法
1.2.1 柴油降解菌的分离纯化 取采集的水样10 mL
加于含 1%（V/V）柴油的 100 mL MMC 中。在 28℃，
200 r/min 的条件下振荡培养 5 d 后，取 10 mL 培养
液转入新鲜培养基中，同样条件继续培养富集。一
共 6 个循环，每次培养基中原油浓度按 1%，2%，3%，
4%，5%，6% 梯度增加。培养 30 d 后，将培养液
10 倍倍比稀释，涂 LB 平板，于 30℃恒温培养箱中
培养 2 d。挑取平板上的菌落，用 LB 平板进行多次
划线纯化，纯化后菌株以 20% 甘油保存于 -20℃。
1.2.2 柴油降解菌株的筛选 将分离纯化的细菌分
别接种于 5 mL LB 液体培养基中，200 r/min，35℃
下振荡培养 12 h，至菌悬液 OD600 值为 0.8-1.0，然
后将 0.5 mL 培养液分别加入 50 mL 含 1%（V/V）柴
油浓度的 MMC 中，设空白对照，200 r/min，30℃下
导致港口海域的柴油污染日益严重。柴油的组分以
中长链烷烃为主，在环境中长期滞留，对海洋生物
及环境有长期的毒性危害。因此，对港口海域柴油
污染的治理亟需加强。海洋油污染治理有物理机械
法、化学处理法和生物降解法。物理方法使用围油
栏，吸油材料等，方法相对简单、安全、有效适，
用于突发溢油的回收并控制溢油的扩散；化学方法
使用消油剂，凝油剂，化学燃烧等快速除油。物理
方法主要适用于溢油初期大量油污染的治理，但对
于港口相对较低浓度的油污染，则处理效果不大 ；
化学方法容易引起二次污染，尤其是某些消油剂的
化学毒性比油的毒性还大，故此这两种方法不适用
于港口油污染的长期处理。生物降解法是将能降解
柴油的微生物投放到受污染海域，对其进行降解的
污染治理方法。该方法可以对大面积的污染环境进
行治理，具有高效、经济、安全及无二次污染等优
点［1］，已逐步被应用到海洋油污染的治理工作中。
海洋油污染的生物修复主要依靠微生物对石
油烃的生物降解作用来实现的，所以，高效降解
菌的分离和筛选是生物修复技术关键问题之一。
目前，国内外的研究内容主要集中在筛选能降解
石油的海洋细菌方面，如降解直链和支链烷烃的
食烷菌属 Alcanivorax［2］，降解芳烃类的解环菌属
Cycloclasticus［3］，降解脂肪烃类的 Oleiphilus［4］和
Oleispira［5］ 等，而有关柴油降解菌的研究报道还比
较少。由于柴油的主要成分是烷烃，所以近年来，
关于细菌降解烷烃的机理及其相关主要降解酶的研
究成为热点［6］。
本研究从柴油污染的港口海域分离、筛选高效
柴油降解菌，并对获得的一株高效柴油降解菌 W3
进行生理生化特性的鉴定。在实验室中测量菌株 W3
对柴油的降解效率，并对其含有的重要的烷烃羟化
酶基因进行扩增分析，为柴油污染海水的生物修复
奠定一定的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品及试剂 含柴油海水样品取自浙江省舟
山市定海港 ；市售船用柴油（密度 832 g/L），石油
醚 （沸程为 60-90℃，透光率大于 90%），无水硫酸
2012年第6期 161孙敏等 ：高效柴油降解菌 Acinetobacter sp. W3 分离鉴定及降解酶基因扩增分析
振荡培养 3 d 后，取培养基测定 OD600。选取生长能
力较强的菌株 W3 作进一步研究。
1.2.3 菌株 W3 的生理生化鉴定 参照《常见细菌
系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌手册》，对分离到的
高效柴油降解菌进行初步的形态观察和生理生化鉴
定，初步鉴定到属。
1.2.4 菌株 W3 的 16S rDNA 序列分析 采用试剂盒
提取并纯化柴油降解菌的基因组总 DNA。以总 DNA
为模板，对 16S rDNA 保守序列进行 PCR 扩增获得
目的基因片段，产物送上海生物工程中心进行测序。
将测定得到的 Acinetobacter sp. W3 菌株 16S rDNA
的基因序列通过 Eztaxon server version 2.1［7］与其中核
酸数据库进行比对分析（http://147.47.212.35:8080），
相 似 的 序 列 进 行 多 重 匹 配 排 列 分 析（clustalx
2.0）［8］，使用 Bioedit 软件［9］对多重匹配排列分析
好的序列进行裁切，然后用 Mega 4［10］分析软件中
的 Neighbor-Joining［11］方法构建系统发育树。
1.2.5 柴油降解效率测定 取保存菌种，LB 平板划
线，30℃恒温培养过夜，挑取单克隆，接种于 5 mL
LB 培养基中，于 30℃，200 r/min 的摇床培养 8 h。
吸取 0.5 mL 活化后的菌液至 1.5 mL EP 管中，在
3 000 r/min 条件下离心 5 min，弃上清 ；用 0.5 mL 的
MMC 培养基悬浮沉淀，再次在 3 000 r/min 条件下离
心 5 min，重复洗涤菌体一次。将沉淀菌体用 0.5 mL
MMC 培养基悬浮后，以 3% 的比例接种于含 1% 柴
油的 MMC（pH7.5）培养基中，于 30℃条件下，200
r/min 的摇床培养 7 d。每天以石油醚萃取 MMC 培养
基中残余的柴油，采用紫外分光光度法测定柴油含
量，计算降解率。
1.2.6 菌株 W3 中降解酶基因片段的扩增分析 将
菌株在 LB 培养基中培养后提取基因组 DNA 和质粒
DNA，分别以基因组 DNA 和质粒 DNA 为模板，用
设计的两对引物进行 PCR 扩增，PCR 反应体系（总
体积 25 μL）：10×Buffer 2.5 μL，dNTP （2.5 mmol/L）
2 μL，Mg2+ 2 μL，引物 F（10 pmol/μL）1 μL，引物
R（10 pmol/μL）1 μL，Ex Taq 酶（2 U/μL）0.2 μL，
DNA模板1 μL， 去离子水16.3 μL。PCR扩增的条件：
95℃ 5 min，94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，32 个
循环 ；72℃ 5 min。PCR 产物以 1% 琼脂糖凝胶电泳
鉴定。产物送上海生物工程中心进行测序，序列用
BLAST 软件在 GenBank 中进行序列比对分析。
2 结果
2.1 柴油降解菌的分离纯化结果
经过分离纯化，获得 5 株能在以柴油为唯一
碳源的培养基中生长菌株，分别命名为 W1-W5，
测定各菌株在含油培养基中培养 3 d 后的 OD600 值
（图 1），选取生长速度较快的一株 W3 进一步研究。
图 1 五株降解菌在含油培养基中培养 3 d后的 OD600值
2.2 菌株W3的生理生化及16S rDNA鉴定
W3 菌株的形态学和生理生化特征结果表明，
W3 菌株为革兰氏阴性、具有严格好氧特征，氧化酶
阴性、过氧化氢酶阳性、不利用 D-葡萄糖、D-木糖、L-
阿拉伯糖、D-核糖，能利用柠檬酸钠作为唯一的碳源，
并能利用硝酸钾和硫酸铵作为唯一氮源、不需要生
长因子和具有在 37℃生长和 44 ℃不生长等特点。
菌体形态学表明 W3 菌株在幼龄期细胞呈杆状，
大小为（0.9-1.1）μm×（1.2-1.9）μm。在静止期呈
球状，一般呈单个或成对，不形成芽孢 ；革兰氏阴
性（图 2）。因此，初步确定 W3 为不动杆菌（Acine-
tobacter sp.）。
2.3 W3菌株的系统发育分析
对 W3 菌株的 16S rDNA 测序。菌株的系统发育
分析结果（图 3）表明，W3 菌株与威尼斯不动杆菌
（Acinetobacter venetianus RAG-1T）的序列相似性为
99.7%，并在系统发育树上属于同一簇（cluster），由
此可确定该菌株属于不动杆菌属（Acinetobacter），并
最接近于威尼斯不动杆菌（Acinetobacter venetia-
nus）［12］，因此将 W3 菌株命名为 Acinetobacter sp. W3。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期162
A. 幼龄 ；B. 老龄 ；C. 菌落形态
图 2 W3菌株的菌体形态
图 3 Acinetobacter sp. W3菌株与不动杆菌属（Acinetobacter）中近缘种的模式菌株的 16S rDNA序列的无根系统发育树
2012年第6期 163孙敏等 ：高效柴油降解菌 Acinetobacter sp. W3 分离鉴定及降解酶基因扩增分析
2.4 Acinetobacter sp. W3对柴油的降解率
将 Acinetobacter sp. W3 菌株接种在 LB 培养基中
活化培养后，以 3% 的比例接种到 100 mL 含柴油 1%
的 MMC（pH 7.5）培养基中，于 30℃，200 r/min 条
件下培养。每天测定其降解率（3 个复瓶，1 个对
照），绘制降解曲线。结果如图 4 所示，Acinetobacter
sp. W3 的降解率逐天上升，到第 7 天的时候已经达
到 84.7%。
2.5 Acinetobacter sp.W3烷烃羟化酶基因alkB和CY-
P153A的扩增分析
采用简并引物，进行 PCR 扩增反应，从菌株
Acinetobacter sp. W3 的基因组 DNA 和质粒 DNA 上分
别获得了大小为 540 bp 的烷烃羟化酶基因 alkB 和
864 bp 的 CYP153A 烷烃羟化酶基因 DNA 片段（图
5）。经序列分析表明，分别以基因组 DNA 和质粒
DNA 为模板扩增的 alkB 片段和 CYP153A 片段序列
一致，且 alkB 片段与 Acinetobacter venetianus 1-D-2
的 alkB 同 源 性 达 到 99%（ 图 6），CYP153A 片 段
与 Acinetobacter sp. OC4 和 Acinetobacter sp. EB104 的
图 4 Acinetobacter sp. W3的柴油降解曲线
M. DNA marker；1 Acinetobacter sp. W3基因组DNA的 alkB基因扩
增片段； 2. Acinetobacter sp. W3 质粒 DNA 的 alkB 基因扩增片段；
3. Acinetobacter sp. W3 基因组 DNA 的 CYP153A 基因扩增片段 ；
4. Acinetobacter sp. W3 质粒 DNA 中的 CYP153A 基因扩增片段
图 5 Acinetobacter sp. W3中 alkB基因和 CYP153A
基因 PCR扩增结果
CYP153A 具有 98 % 的同源性（图 7）。
图 6 alkB基因扩增片段的序列测定及 BLAST分析结果
3 讨论
自 20 世纪 90 年代以来，由于生物修复技术的
发展和研究成果所展示的生物技术的生命力，使生
物修复技术在石油污染治理方面逐渐成为核心技术，
成为当今石油污染去除的主要途径。微生物修复石
油污染主要有两种形式，一是加入具有高效降解能
力的菌株 ；二是改变环境，促进微生物代谢能力。
国内目前的研究主要集中在石油降解菌的分离与鉴
定方面。
众多研究表明不动杆菌属 Acinetobacter sp. 的菌
株在石油烃类降解的过程起着重要的作用［13］。本
试验从柴油污染严重的定海港口海域富集、分离
的 5 株柴油降解菌中，降解效率最高的 W3 菌株经
鉴定后也是不动杆菌属（Acinetobacter sp.）。该菌株
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期164
在实验室培养条件下，7 d 对柴油的降解率达到了
84.7%。国内一些实验室报道的其他不动杆菌属降解
效率相对较低。郑金秀等［14］报道的不动杆菌 w1 10
d 的降解率达到 74.34% ；苏莹等［15］分离的不动杆
菌 HB-1 6 d 的降解率达 54.74%。因此，本试验分离
获得的不动杆菌 Acinetobacter sp. W3 是一株相对高
效的可降解柴油的不动杆菌。当然也不能排除各实
验室条件的不同对菌株降解效率的影响。
在微生物降解烷烃的过程中，将其末端单加
氧化，使其转化为可溶性的醇是降解的第一步，催
化这一步反应的酶是烃羟化酶（alkane hydroxygena-
se）［16］。烷烃羟化酶主要有两种，分别是细胞膜结
合的烷烃羟化酶 AlkB 和胞浆内可溶性烷烃羟化
酶 CYP153A。 AlkB 烷烃羟化酶最早发现于菌株
Pseudomonas putida Gpo1 中［17］。CYP153A 则由 Maier
等［18］ 首次从菌株 Acinetobacter calcoaceticus EB104
中克隆获得。本试验从降解菌株 Acinetobacter sp.W3
的基因组和质粒 DNA 中都扩增出了 AlkB 和 CYP-
153A，说明在基因组和质粒中都有烷烃降解酶基因，
基因组中的降解酶基因保证了菌株降解能力的稳定
性，质粒中的降解酶基因使菌株能把降解能力传递
到其他菌株。许多高效烷烃降解菌株含有多个烷烃
羟化酶，据 Schneiker 等［19］报道，菌株 Alcanivorax
borkumensis SK2 是一株高效烷烃降解菌，其基因组
中存在多个烷烃羟化酶基因，包括两个 alkB 基因和
一个 CYP153A 基因。这 3 种酶可分别利用不同碳链
长度的烷烃，使该菌株能有效利用多种烷烃，对其
进行降解。这种多个烷烃羟化酶基因存在于同一株
降解菌中的现象可能对提高菌株的降解效率有帮助。
图 7 CYP153A基因扩增片段的序列测定及 BLAST结果
本试验从菌株 Acinetobacter sp.W3 中扩增出了 AlkB
和 CYP153A 这两种烷烃降解酶基因片段，可能就是
该菌株具有较强的柴油（主要成分是烷烃）降解能
力的原因。
4 结论
（1） 从定海港口柴油污染海水分离得到一株高
效柴油降解菌 W3，该菌属于不动杆菌属（Acinetobater
sp.），其对柴油的 7 d 降解率达到 84.7%。 （2） PCR
方法从 Acinetobacter sp. W3 菌株中的基因组 DNA 和
质粒 DNA 上扩增到了大小为 540 bp 的烷烃羟化酶
基因 alkB 和 864 bp 的 CYP153A 部分 DNA 片段，分
别与 Acinetobacter venetianus 1-D-2 的 alkB 和 Acineto-
bacter sp. OC4、Acinetobacter sp. EB104 的 CYP153 具
有 99% 和 98 % 的同源性。 （3） 多个烷烃降解酶基
因的存在，可能是 Acinetobacter sp. W3 菌株高效降
解柴油的原因之一，有望将该菌种应用于海水柴油
污染的生物修复。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）