全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
自 1993 年 第 一 次 出 现 有 关 荧 光 定 量 PCR 技
术的记录，1996 年 ABI（Applied Biosystems） 公 司
使 荧 光 定 量 PCR（real-time fluomgenetic quantitative
PCR，FQ-PCR）技术商业化，并制造出第一台荧光
定量 PCR 仪，迄今因该技术较以往核酸定量研究方
法，如 Nothern blotting、RNase-protection、Semiquan-
titative RT-PCR 等，具有灵敏度高、特异性和可靠性
好、自动化程度高、具实时性和准确性等特点，所
以目前广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领
域［1-4］。实时荧光定量 PCR 是在 PCR 定性技术基础
上发展起来的核酸定量技术。它是通过在 PCR 反应
体系中加入荧光基团（探针类和染料类），利用每个
收稿日期 ：2012-07-09
基金项目 ：沈阳市科技计划（F11-264-1-11，F12-152-9-00），国家科技重大专项重大新药创制项目（2012ZX09102301-013）
作者简介 ：刘彦礼，男，博士，研究方向 ：分子生物学及免疫学 ；E-mail ：skywave001@yahoo.com.cn
通讯作者 ：徐明恺，男，博士，副研究员，研究方向 ：超级抗原蛋白的结构改造及其药效学 ；E-mail ：mkxu@iae.ac.cn
动力学模型在荧光定量 PCR 数据处理中的优势
刘彦礼1，2  李旭1  苏振成1  徐明恺1  张惠文1
（1. 中国科学院沈阳应用生态研究所，沈阳 110016 ；2. 中国科学院研究生院，北京 100039）
摘 要 ： 近年来荧光定量 PCR 技术凭借其基因定量的优势而得到了广泛应用，上游技术的发展保障了原始数据的精确性，
但定量结果的可靠性仍取决于 PCR 扩增效率和所采用的数据处理模型，基于不同数学模型对原始数据处理后的结果会有较大差异。
试验通过对样品进行 5 倍梯度稀释后获得相应梯度的荧光定量 PCR 原始数据，并应用 2 －△△ Ct 法、相对标准曲线法和动力学模型
处理原始数据，所得定量结果（x
-
±s）依次为 1.76±0.70、0.89±0.14 和 0.99975±0.06，与理论值 1 比较表明，动力学模型在定量
结果的可靠性、方便性及经费节约方面都具有良好应用前景。
关键词 ： 荧光定量 PCR 2 －△△ Ct 法 相对标准曲线法 动力学模型
Advantages of the Dynamic Model in Real-time PCR Data Processing
Liu Yanli1，2 Li Xu1 Su Zhencheng1 Xu Mingkai1 Zhang Huiwen1
（1. Institute of Applied Ecology，Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110016 ；2. Graduate University of Chinese
Academy of Sciences，Beijing 100039）
Abstract:  In recent years, Real-time PCR with its advantages in the quantitation of gene is widely used, the development of equipment
ensure the accuracy of raw data, however the reliability of quantitative result highly depends on the PCR efficiency and the mathematical model
on which the quantitative methods are based, The quantitative result processed with different mathematical models will be quite different. In
this paper, the sample was 5-fold diluted for gaining the raw data of quantitative PCR, and the same raw data was processed by three kinds of
mathematical models, including 2 －△△ Ct model, relative standard curve model, dynamic model. And the results demonstrate the dynamic model
has a good prospect.
Key words:  Quantitative PCR 2 －△△ Ct model Relative standard curve model Dynamic model
循环末对荧光信号积累的捕捉来实时监测整个 PCR
进程，从而建立起荧光量与初始模板量的对应关系，
最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方
法［5］。对于荧光定量 PCR 数据分析方法包括绝对定
量和相对定量两种。前者是应用精确定量的标准品，
构建标准曲线，以此来定量未知样品中初始基因拷
贝数。虽然该方法能够直接得到目的基因的拷贝数，
且具有稳定、直观等优点，但是其数据可靠的前提
是得到精确定量的标准品，鉴于目前核酸定量技术
的不足，标准品的制备无统一标准，所以数据缺乏
可比性 ；而且标准品与试验样品扩增效率的差异也
影响了该方法应用 ；再者绝对定量也不适合高通量
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期158
的定量分析。而相对定量在一定程度上弥补了绝对
定量的不足，其是指在测定目的基因的同时测定一
内源性稳定表达内参基因，通过比较处理前后的目
的基因相对于内参基因归一化的比值，来衡量目的
基因在处理前后的表达差异，并不需要确定目的基
因具体的拷贝数。尽管相对定量存在着一定的缺点，
但其仍是目前处理荧光定量数据的主流方法，尤其
是定量 mRNA 拷贝数［6］。本试验在用上述 3 种方
法就行处理数据的过程中，假定未稀释样品为对照
（control），不同的稀释梯度的样品为处理（sample），
理论上目的基因 IL-10 的变化率为 1。最终通过比较
不同方法计算的结果与理论值的差异进行分析，旨
在探讨动力学模型在定量结果的可靠性、方便性及
经费节约方面的应用前景。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂和仪器 Taq DNA 聚合酶、SYBR
Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）购自大连宝
生物工程有限公司 ；ABI 7000 型实时荧光定量 PCR
扩增仪为美国 ABI 公司生产 ；Univeral Hood SN-75S
型紫外凝胶成像系统为美国 Bio-Rad 公司生产。
1.1.2 试 验 样 品 本 试 验 所 应 用 的 内 参 基 因
（β-actin）与目的基因（IL-10）的 cDNA 由本课题组
通过反转录得到，并对得到的 cDNA 进行 5 倍的梯
度稀释。
1.2 方法
1.2.1 荧光定量 PCR 反应条件确定 利用体外转录
生成的 cDNA 作为模板，从多次重复性试验中发现，
该检测方法最适反应总体积 25 μL，其中模板 1 μL ；
最适的引物浓度为 0.4 μmol/L，其余组分浓度依据
试剂盒使用说明。最适循环参数为 ：95℃ 30 s ；之
后 95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 31 s，40 个循环 ；最终
72℃ 5 min。PCR 反应完成后以 60℃为起点做产物
的熔解曲线。β-actin 特异性引物（F ：5-TGGAATC-
CTGTGGCATCCATGAAAC-3，R：5-TAAAACGCAG-
CTCAGTAACAGTCCG-3）与 IL-10 的特异性引物（F：
5-ACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGCA-3，R ：5-
CTATGCAGTTGATGAAGATGTCAAA-3），扩增片段
大小分别为 348 bp 和 237 bp［7］，由华大基因合成。
1.2.2 相对定量方法
1.2.2.1 2 －△△ Ct 法 该方法是传统的处理荧光定量
数据的方法，其通过假设目标基因与内参基因扩增
效 率 相 等 且 均 为 100%， 即 Etarget=Eref = 1
［8］， 这 样
大大简化了试验数据的处理过程，其数学模型基于
PCR 指数扩增的公式 ：
Xn = X0 ×（1 + E）
n
其中 Xn 是循环数为 n 时基因的拷贝数，X0 为
初始基因拷贝数，E 为基因的扩增效率，Ct 代表目
标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，因此
XCt-target = X0-target ×（1 + Etarget）
Ct-target =Ktarget
其中 XCt-target 为目标基因达到设定阈值时的拷贝
数，X0-target 为目标基因初始拷贝数，Ct-target 为目标
基因扩增到设定阈值时的循环数，对于目标基因和
内参基因来说，达到阈值时其基因拷贝数固定，所
以 Ktarget 为常数，同理 ：
XCt-ref = X0-ref ×（1 + Eref）
Ct-ref = Kref
因为 Etarget=E ref = 1，所以 Ktarget/Kref 得 ：
Ktarget / Kref =［X0-target ×（1 + Etarget）
Ct-target ］/［X0-ref
×（1+ Eref）
Ct-ref］
= X0-target
/ X0-ref × 2
△ Ct
= S × 2
△ Ct
其中 X0-target
/ X0-ref 代表经过内参基因归一化处
理的初始目标基因拷贝数的比值，用 S 表示 ；△ Ct
表示目标基因和内参基因 Ct 值的差异，△ Ct = Ct-
target － Ct-ref ；Ktarget / Kref 为一常数，设为 K，对公
式进行变形得 ：
S = K × 2 －△ Ct
因此用处理后样品的 S sample 除以处理前样品的
S control 得到 ：
S sample / S control = K × 2
－△ Ct-sample
/ K × 2
－△ Ct-control
= 2 －△△ Ct
公式中的－△△ Ct = △ Ct sample －△ Ct control
1.2.2.2 双标准曲线法 该方法应用上述准备好的
梯度稀释 cDNA 分别做出目的基因与管家基因的标
准曲线，然后从各自的标准曲线上求出初始模板量，
经管家基因归一化处理后，求出目的基因的相对含
量［9，10］。其也基于 PCR 指数扩增的公式 ：
Xn = X0 ×（1 + E）
n
其中 Xn 是循环数为 n 时基因的拷贝数，X0 为
2013年第2期 159刘彦礼等 ：动力学模型在荧光定量 PCR 数据处理中的优势
初始基因拷贝数，E 为基因的扩增效率，当荧光值
达到阈值时其数学公式表示如下 ：
XCt = X0 ×（1 + E）
Ct
两边同时取对数 ：log XCt = Ct×log（1 + E）+ log X0，
变形得 ：
Ct = － log X0/log（1+E）＋ log XCt/log（1+ E）
由于达到阈值时，XCt 和 E 为常数，所以设
a = － 1/ log（1 + E）；b = log XCt/log（1 + E）
则公式转化为线性方程 ：
Ct = a×log X0 ＋ b
由此构建出基因初始拷贝数与 Ct 的线性关系。
从而通过求出未知样本内目标基因的 Ct 值即可求出
目标基因的相对初始拷贝数。通过上述模型，我们
进行目标基因的相对定量 ：
Ct（target-control）= a（target）log X（target-control）＋ b（target）
Ct（ref-control）= a（ref）log X（ref-control）＋ b（ref）
Ct（target-sample）=a（target）log X（target- sample）＋ b（target）
Ct（ref-sample）= a（ref）log X（ref- sample）＋ b（ref）
由以上公式可以求出 X（target-control）（处理前样品
中目标基因的相对初始拷贝数）、X（ref-control）、X（target-sample）
和 X（ref-sample），归一化处理表示目的基因在处理前后
的表达差异率 Ratio 为 ：
Ratio =［X（target-sample）/ X（ref-sample）］/［X（target-control）/
X（ref-control）］
将 a = － 1 / log（1 + E）；b = log XCt / log（1 + E）
带入公式后，整理得 ：
Ratio =（1+Etarget）
△ Ct（control-sample）/（1+Eref）
△ Ct（control-sample）
若 假 设 上 述 公 式 Etarget=Eref = 1， 则 ratio =
2 －△△ Ct，其中－△△ Ct = △ Ct target －△ Ct ref，因此可
以将 2 －△△ Ct 法作为双标准曲线法的一个特例。
1.2.2.3 基于动力学的相对定量方法 通过上述两
种计算方法的比较，可以明确基因的扩增效率对后
期数据处理的影响，并且这种影响通过指数形式进
行放大。上述两种计算方法假定 PCR 反应在指数扩
增期时效率相等，但实际情况却是在制备样品 cDNA
的过程中，已经将不同浓度的盐、酚、氯仿、乙醇
等带入到样品中，这些有毒物质将不同程度的抑制
酶的活性，使实际的扩增效率低于理想值 ；并且在
样品的梯度稀释过程中，这些有毒物质也被稀释，
因此减少了对酶的抑制，这就造成了梯度稀释样品
本身的扩增效率就不一致，从而使通过双标准曲线
法得到的值与真实值有差异［11］。针对这种情况，近
年来许多文献［12-16］提出通过模拟荧光定量 PCR 仪
所给出的样品扩增曲线建立荧光量与 Ct 值之间的直
线或曲线，以此来获得反应的扩增效率或基因初始
拷贝数，并且设计出一系列方便试验人员进行试验
的模型和软件。该模型假定在单一 PCR 扩增反应的
指数期内期扩增效率恒定，建立荧光量的对数值与
Ct 值之间的线性关系，从而获得反应扩增效率，经
管家基因归一化处理后得到目的基因在处理前后的
表达差异。其模型与双标准曲线法相似，但不是通
过对样品梯度稀释获得标准曲线间接获得扩增效率，
而是利用每个梯度样品的真实扩增曲线来获得我们
需要的荧光量和与之对应的 Ct 值，从而直接得出该
梯度 PCR 反应的扩增效率。Ramakers 等［8］在此基
础上设计出软件 LinRegPCR 以为广大研究者提供方
便。由假设可知 ：
Fn = F0 ×（1 + E）
n
其中 Fn 是循环数为 n 时基因扩增产物的荧光量，
F0 为初始基因的荧光量，E 为基因的扩增效率。当
荧光值达到阈值时数学公式表示如下 ：
FCt = F0 ×（1 + E）
Ct
两边同时取对数 ：log FCt = Ct×log（1 + E）+log F0
变形得 ：Ct = log FCt/log（1 + E）－ log F0/ log（1 + E）
因为是单一反应模板量恒定，所以 log F0 为一
常数，且 E 值恒定。
若设 a = 1/ log（1 + E）；b = log F0/ log（1 + E），
则公式简化为 ：
Ct = a × log FCt － b
当在扩增的指数期，通过取一系列的荧光值以
及与之对应的 Ct 值，线性拟合求出 E 值后，带入公式：
Ratio =（1+Etarget）
△ Ct（control-sample）/（1+Eref）
△ Ct（control-sample）
通过 Ratio 值反应出目的基因在处理前后的表
达差异。
2 结果
2.1 荧光定量PCR操作特异性与重复性检验
试验通过荧光定量 PCR 给出的熔解链曲线（图
1），并辅助以琼脂糖凝胶电泳验证该方法的特异性
（图 2），从图 1 中熔解链曲线只有单一的峰以及图 2
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期160
0.45
0.35
0.25
0.15
0.05
0.10
0.20
0.30
0.40
00.05
70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90
Temperature℃
D
er
iv
e
at
iv
e
IL-10
β-actin
1 2 M
图 1 β-actin 和 IL-10 熔解链曲线
1 ：β-actin（348 bp）；2 ：IL-10（237 bp）；M ：DNA Marker DL2000
图 2 荧光定量 PCR 仪扩增结果
中琼脂糖凝胶电泳跑出的单一条带，这些都很好的
说明了所采用引物的高特异性 ；同时通过对同一样
品在 3 个时间点，每个时间点上做 3 个重复以验证
方法的可重复性和稳定性，通过特异性和重复性检
验很好地保障了试验数据的可靠性。
2.2 梯度稀释样品荧光定量结果
对于样品 cDNA 进行 5 倍梯度稀释后，每个梯
度 3 个重复，测得相应 β-actin 和 IL-10 的平均 Ct 值
如表 1 所示。
2.3 三种相对定量方法结果
2.3.1 2 －△△ Ct 法定量结果 由表 3 数据通过 2 －△△ Ct
方法计算出目的基因 IL-10 通过内参基因 β-actin 归
一化处理后变化率如表 2 所示。
2.3.2 双标准曲线法定量结果 由表 3 数据构建
表 1 荧光定量 5 倍梯度稀释后样品的数据
Sample
Undiluted sample
（control）
5-fold Dilution
（sample1）
25-fold Dilution
（sample2）
125-fold Dilution
（sample3）
625-fold Dilution
（sample4）
Ct（β-actin） 15.23 ± 0.15 18.27 ± 0.13 22.2 ± 0.14 25.67 ± 0.13 28.75 ± 0.16
Ct（IL-10） 16.26 ± 0.17 19.47 ± 0.15 22.74 ± 0.19 25.41 ± 0.17 28.65 ± 0.14
表 2 2 －△△ Ct 法定量结果
Sample △ Ct －△△ Ct 2—△△ Ct
Undiluted sample（control） 1.03
5-fold Dilution（sample1） 1.2 -0.17 0.8888
25-fold Dilution（sample2） 0.54 0.59 1.5052
125-fold Dilution（sample3） -0.26 1.29 2.4453
625-fold Dilution（sample4） -0.1 1.13 2.1886
β-actin 和 IL-10 的标准曲线（图 3），利用线性拟合
得到的斜率计算出 Eβ-actin = 0.5959，EIL-10 = 0.6886 ；
通过前述公式计算出目的基因 IL-10 经内参基因
β-actin 归一化处理后变化率如表 3 所示。
2.3.3 基于动力学的相对定量方法结果 根据动力
学相对定量方法原理，在 β-actin 和 IL-10 扩增曲线
表 3 双标准曲线法定量结果
的直线部分（图 4-a）随机采集 5 个点，获得与之对
应的荧光量与 Ct 值，线性拟合得到相应的扩增效率
（图 4-b），通过相应公式得出目的基因 IL-10 经内参
基因 β-actin 归一化处理后变化（表 4）。
3 讨论
3 种模型处理数据的结果见表 5。理论上同一样
品梯度稀释后，其作为样品的各个梯度中目的基因
经表达差异率（Ratio）和经内参基因归一化处理后
5-fold Dilution（sample1） 25-fold Dilution（sample2） 125-fold Dilution（sample3） 625-fold Dilution（sample4）
Target △ Ct（control － sample） -3.21 -6.48 -9.15 -12.39
Ref △ Ct（control － sample） -3.04 -6.97 -10.44 -13.52
（1+Etarget）
△ Ct（control-sample）
0.7705064 0.872119 1.090207 0.842519
（1+Eref）
△ Ct（control-sample）
2013年第2期 161刘彦礼等 ：动力学模型在荧光定量 PCR 数据处理中的优势
相对于对照应为常数 1。相同的原始数据通过 3 种
模型处理后的定量结果与理论值比较，从均值、方
差以及变异系数方面都说明动力学方法要优于双标
准曲线法和 2 －△△ Ct 法。动力学方法与双标准曲线
法计算出内参基因与目的基因的扩增效率均小于 1，
这与实际 PCR 过程的动力学相符，也直接说明了
2- △△ Ct 法本身的前提条件就存在着不足，而且动力
学方法所计算得到的每个梯度扩增效率随着稀释梯
度的增加也随之增加，进一步证明了模板制备中存
在的有毒物质在 PCR 反应过程中对酶活性的影响。
但因 2 －△△ Ct 法对假设的简化使得该方法只需一
个变量（Ct 值），即可快速获得结果 ；同时，目的基
因表达差异率越大该方法的可靠性就越高，故现在
图 3 β-actin 和 IL-10 的标准曲线
33
30
27
24
21
18
15
0 1X 2X 3X 4X
Logcopy numbers
C
t
β-actin R2=0.99772
IL-10 R2=0.99866
1.0e+004
1.0e+003
1.0e+002
1.0e+001
1.0e+000
1.0e+001
D
el
ta
R
n
liner part
β-actin
IL-10
Det
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Cycle Number
0.6 0.4 0.2 0.0 b
20.0
19.0
18.0
17.0
16.0
15.0
15.5
16.5
17.5
18.5
19.5
C
t
Log㦗ݹ䟿
β-actin
IL-10
b
a
R2=0.99539
R2=0.99397
图 4 β-actin 和 IL-10 的扩增曲线及直线部分线性拟合
表 4 动力学方法定量结果
5-fold Dilution（sample1） 25-fold Dilution（sample2） 125-fold Dilution（sample3） 625-fold Dilution（sample4）
Etarget 0.5312 0.5922 0.6322 0.6459
Eref 0.5401 0.5426 0.5480 0.5643
Target △ Ct（control-sample） -3.21 -6.48 -9.15 -12.39
Ref △ Ct（control-sample） -3.04 -6.97 -10.44 -13.52
（1+Etarget）
△ Ct（control-sample）
0.9469 1.0073 1.0823 0.9625
（1+Eref）
△ Ct（control-sample）
表 5 三种数学模型处理结果的比较
Models of relative quantitation 5-fold 25-fold 125-fold 625-fold x
-
±s CV（%）
2- △△ Ct 0.8888 1.5052 2.4453 2.1886 1.76±0.70 39.8
Relative standard curve 0.7705 0.8721 1.0902 0.8425 0.89±0.14 15.7
Dynamic model 0.9469 1.0073 1.0823 0.9625 0.99975±0.06 6
仍被广泛使用 ；双标准曲线法通过构建标准曲线获
得内参基因与目的基因的扩增效率，然而标准品稀
释的同时也稀释了抑制 PCR 反应的有毒物质，使由
该方法得到的扩增效率与真实值有一定误差，并且
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期162
通过这种方法所构建的标准曲线消耗了更多的定量
试剂，增加了试验成本，所以现在应用较少。随着
荧光定量上游技术的突破，试验所得原始数据的可
靠性越来越高，而动力学模型因以实时定量曲线为
基础通过线性拟合计算得到每一个基因的扩增效率，
所以通过模型有效的屏蔽了 PCR 反应过程中潜在的
影响因素，计算所得扩增效率的可靠性也随之越来
越高 ；同时因省去标准曲线来计算扩增效率，减少
了试剂的消耗，降低了试验成本，节省了有限的模
板 ；而且针对动力学模型使用过程中遇到的线性拟
合的问题，已经开发出多款供研究者利用的软件，
如 LinRegPCR。
4 结论
在荧光定量 PCR 相对定量的数据处理过程中，
通过实例对 3 种处理数据模型的精确性进行比较，
发现动力学模型 > 双标准曲线法 >2 －△△ Ct 法 ；此外
应用动力学模型在节约试验成本以及模板等方面的
优势也使其成为荧光定量研究领域中的一个热点，
围绕其开发的多款软件也表明该模型具有很大的发
展前景。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）