全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
豆状囊尾蚴是带科（Taeniidae）带属（Taenia）
的豆状带绦虫（Taenia pisiformis）的中绦期蚴虫，常
寄生于家兔等啮齿动物的肝脏、大网膜、肠系膜和
腹腔内引起其豆状囊尾蚴病［1］。当终末宿主（如犬、
狼、狐等）吞食了感染豆状囊尾蚴的中间宿主组织
后，豆状囊尾蚴在其小肠中发育为豆状带绦虫［2］。
该病呈世界性分布［3-5］，我国各地均有发生［6］。该
病的流行，不仅对公共卫生及兔肉食品安全构成严
收稿日期 ：2013-12-17
基金项目 ：甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2010-01），甘肃省科技支撑计划项目（1104NKCA082）
作者简介 ：韩乐乐，女，硕士研究生，研究方向 ：兽医公共卫生学 ；E-mail ：835247336@qq.com
通讯作者 ：孙晓林，教授，硕士生导师，研究方向 ：兽医公共卫生学 ；E-mail ：sunxl@gsau.edu.cn
兔豆状囊尾蚴 TpRS1 基因的克隆及其序列分析
韩乐乐  李作磊  苟惠天  孙晓林
（甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）
摘 要 ： 旨在研究兔豆状囊尾蚴 TpRS1 的功能，根据 GenBank 中猪带绦虫 RS1 cDNA 序列设计引物，以豆状囊尾蚴总 RNA
为模板，利用 RT-PCR 技术首次克隆到兔豆状囊尾蚴 TpRS1 的完整开放阅读框序列，并利用生物信息学软件对该基因及其编码蛋
白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和抗原位点等方面进行了预测和分析。结果表明，兔豆状囊尾蚴 TpRS1 的 cDNA
序列为 275 bp 的基因片段，该序列含有一个由 258 个核苷酸组成的开放阅读框，编码 85 个氨基酸。其编码蛋白疏水性，分子质量
为 9.6 kD，理论等电点为 9.07。TpRS1 二级结构中 α 螺旋占 70.59%，β 折叠占 5.88%，其余 23.53% 为无规卷曲，TpRS1 没有信号
肽序列，同源性分析表明与其他带科绦虫的一致性在 72% 以上，系统进化分析表明与泡状带绦虫处于同一进化分支。
关键词 ： 豆状囊尾蚴 TpRS1 基因 克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of TpRS1 Gene from
Cysticercus pisiformis
Han Lele Li Zuolei Gou Huitian Sun Xiaolin
（College of Veterinery Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）
Abstract:  To study the function of TpRS1 gene from Cysticercus pisiformis, the open reading frame（ORF）cDNA sequence of TpRS1
gene was cloned by RT-PCR from C. pisiformis total RNA with primers derived from Taenia solium RS1 gene sequence in the GenBank database.
Biochemical properties, secondary structure, signal, hydrophobicity and antigenicity in TpRS1 protein were predicted by bioinformatics tools. The
results indicated that TpRS1 cDNA sequence contained an ORF of 258 nucleotides and the deduced protein consisted of 85 amino acids with the
theoretical molecular weight of 9.6 kD and isoelectric point of 9.07. Analysis of secondary structure revealed 70.59% and 5.88% of α-helix and
β-strands, respectively, and others were loop. The signal peptide sequence of TpRS1 were not identified. TpRS1 protein sequence showed more
than 72% identity with other Taenia spp.. Phylogenetic analysis indicated that TpRS1 located in the same clade with Taenia hydatigena.
Key words:  Cysticercus pisiformis TpRS1 gene Cloning Sequence analysis
重威胁，而且给养殖业的发展造成严重影响。
目前，带科绦虫免疫诊断抗原的研究主要集中
在一些低分子量抗原方面［7-10］。研究证明，在带科
绦虫囊尾蚴病诊断中具有较好应用价值，如 10、14
和 18 kD 等抗原都属于 8 kD 基因家族成员，只是糖
基化修饰程度的差异而形成大小不同的蛋白分子。
Ferrer 等［7，11］对 8 kD 抗原家族基因进行研究发现，
Ts8ku 糖蛋白显示出良好的免疫反应性，在猪囊尾
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期132
蚴病诊断方面具有较高的应用价值。Sako 等［12］使
用多房棘球蚴 Em18 重组抗原建立的免疫层析检测
方法敏感性和特异性均达到 94% 以上。Yong 等［13］
对猪带绦虫 RS1 基因进行研究，发现其能够与宿主
的脂肪酸结合从而获得能源，有助于绦虫在宿主体
内寄生，然而这种结合作用同时会受到 RS1 抗原的
特异性抗体的抑制作用。Lee 等［14］通过研究猪带绦
虫的 150 kD 疏水性结合蛋白（HLBP）调节脂肪酸
吸收的机制，结果表明 HLBP 调节宿主脂肪酸的吸
收可能是寄生虫生存的关键因素。迄今为止，国内
外对有关豆状囊尾蚴（Cysticercus pisiformis）免疫学
诊断方面的研究工作尚少，仅有 1992 年倪泽成等对
其粗提抗原进行研究的初步报道，但粗提抗原在纯
化方法上的缺陷限制了其推广应用［7］。
本研究初次以低分子量抗原 RS1 为靶基因，通
过对 GenBank 中登录的猪带科绦虫 RS1 基因序列进
行比对，选择保守区设计引物，进行 RT-PCR，克隆
到具有完整开放阅读框（ORF）的 cDNA 分子 RS1，
旨在通过对目的基因及其编码的蛋白结构和特征进
行全面的生物信息学分析，为该基因的克隆表达及
免疫学特性的初步研究提供理论依据，从而为其生
物学功能研究及在免疫诊断与疫苗方面的应用奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 虫株与菌株 豆状囊尾蚴采自人工感染兔的
大网膜等处 ；无菌生理盐水冲洗 3-4 次，-70℃保存
备用。E. coli JM109 由本实验室保存。pMD18-T 克
隆载体购自大连宝生物工程有限公司。
1.1.2 主要试剂 Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司 ；
RNA simple Total RNA Kit、TIANgel Midi Purification
Kit 和质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技（北京）
有限公司 ；Taq DNA 聚合酶、DL2000 Marker 购自北
京康润诚业生物科技有限公司 ；其他常规试剂为进
口或国产分析纯产品。
1.2 方法
1.2.1 兔 豆 状 囊 尾 蚴 TpRS1 基 因 的 克 隆 根 据
GenBank 中登录的猪带绦虫 TSOL RS1 基因序列（登
录号 DQ8650721），用 Oligo 软件设计一对引物，上
游 引 物 ：5-ATGCGTGCCTACATTGTGCTT-3 ；下 游
引物：5-GCATGAAAGTTGACAAGTTAAGCAG-3，引
物由上海生工生物工程有限公司合成。按照 Trizol 试
剂说明抽提兔豆状囊尾蚴总 RNA。将提取的总 RNA
按照 RNA simple Total RNA Kit 说明合成 cDNA，用上
下游引物进行 PCR 扩增。反应程序为 ：94℃ 4 min ；
94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，35 个循环 ；72℃
10 min。取 5 μL PCR 产物，于 1.5% 琼脂糖凝胶中
电泳，检测扩增片段的长度。电泳检测后目的基因
按 TIANgel Midi Purification Kit 试剂盒操作说明回收
纯化。将纯化后的 PCR 产物与 pMD18-T 克隆载体于
4℃连接过夜，将连接产物转化至 E. coli JM109 感受
态细胞中，并涂布于 Amp+ LB 固体平板，37℃培养
14-16 h，鉴定为阳性克隆送测序公司测序。
1.2.2 兔 豆 状 囊 尾 蚴 TpRS1 基 因 的 ORF 序 列 分
析 在 http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/g orf/gorf.html 上
利用 ORF finder 软件确定兔豆状囊尾蚴基因 TpRS1
完整的 ORF 序列，并推导编码蛋白的氨基酸序列。
1.2.3 兔豆状囊尾蚴 TpRS1 基因的生物信息学分析
1.2.3.1 基本理化性质分析 利用 Protparam（http：//
expasy.org/tools/protparam.html）计算蛋白质的理论分
子质量、理论等电点、氨基酸组成等。利用 ProtSc-
ale（http ：//expasy.org/tools/protscale.html）分析蛋白
质亲、疏水性。
1.2.3.2 信 号 肽 和 跨 膜 区 分 析 利 用 SignalP3.0
（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 预 测 蛋 白
质的信号肽位点。应用 TMHMM Serverv.2.0（http ：//
www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 在 线 分 析 程 序 预
测跨膜区域。
1.2.3.3 二级结构和功能预测 应用 Predictprotein
（http ：//www.predictprotein.org） 对蛋白二级结构及
抗原表位作进一步分析。应用 MotifScan（http：//hits.
isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN）预测蛋白糖基化位点。
1.2.3.4 同源性比较及系统进化分析 用 BlastP 软
件对兔豆状囊尾蚴 TpRS1 氨基酸序列与 GenBank 中
其他带科绦虫的同源性进行比对。运用 MEGA5 中的
Maximum parsimony（MP）法软件构建系统进化树并
2014年第7期 133韩乐乐等 ：兔豆状囊尾蚴 TpRS1 基因的克隆及其序列分析
进行分析。
2 结果
2.1 兔豆状囊尾蚴TpRS1基因的克隆
以提取的兔豆状囊尾蚴总 RNA 为模板进行 RT-
PCR 扩增，经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳观察，在约 250
bp 出现特异性条带（图 1），与理论预测值大小相符。
白状态稳定。
2.3.2 TpRS1 基因编码蛋白的疏水性 / 亲水性预测
和分析 运用 ProtScale 工具对兔豆状囊尾蚴 TpRS1
基因编码蛋白进行亲水性和疏水性分析。依据氨基
酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规
律可知 ：兔豆状囊尾蚴 TpRS1 基因编码蛋白多肽链
第 22 位 Pro 具有最低的分值 -1.600 和最强的亲水性；
第 87 位 Cys 具有最高的分值 3.133 和最强的疏水性。
平均亲水性为 -0.021，表明该蛋白可能是一个疏水
性蛋白（图３）。该结果与 DNASTAR 软件分析结果
基本一致。
M ：DL2000 Marker ；1 ：TpRS1 基因 PCR 产物鉴定
图 1 PCR 产物鉴定
图 2 TpRS1 的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
图 4 TpRS1 基因编码蛋白的信号肽分析
图 3 TpRS1 基因编码蛋白疏水性分析
2000
bp
M 1
1000
750
500
250
100
2.2 兔豆状囊尾蚴TpRS1基因的ORF序列分析
使 用 NCBI 的 ORF Finder 程 序 对 克 隆 的 兔
TpRS1 基因序列进行开放性阅读框分析并推测其氨
基酸序列，结果（图 2）显示，TpRS1 含有长度为
258 bp 的开放阅读框，含有起始密码子 ATG 和终止
密码子 TAA，编码 85 个氨基酸。
50
95
140
185
230
275
2.3 兔豆状囊尾蚴TpRS1蛋白的生物信息学分析
2.3.1 理化性质 TpRS1 所编码的 85 个氨基酸残基
组成的多肽的理论分子质量为 9.6 kD，理论等电点
为 9.07，原子组成是 C431H710N110O122S6。该蛋白质由
19 种氨基酸组成，其中 Lys 含量最丰富，不含 Gln，
负电荷残基（Asp+Glu）12 个，正电荷残基（Arg+Lys）
15 个。脂肪系数为 95.29，在溶液中的不稳定指数
（Instability index）为 37.58，低于阈值 40，表明该蛋
10
2.01.51.00.500.5Score 1.52.53.02.01.0
20 30 40 50 60 70 80
Position
2.3.3 信 号 肽 和 跨 膜 区 分 析 用 SignalP 3.0 对
TpRS1 基 因 编 码 蛋 白 进 行 信 号 肽 分 析， 结 果 表
明 该 蛋 白 不 存 在 信 号 肽， 不 属 于 分 泌 蛋 白。 用
TMHMM2.0 分析跨膜结构发现此编码蛋白所有氨基
酸部分位于膜表面，部分位于膜内（图 4），证实
TpRS1 基因编码蛋白是一种跨膜蛋白。
0
0.2
50
transmembrane inside
outside
100 150 200 250
0.4
pr
ob
ab
ili
ty
0.6
0.8
1.0
1.2
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期134
2.3.4 二级结构及其蛋白功能的预测 预测结果（图
5）显示，该蛋白的二级结构中 α 螺旋占 70.59%，β
折叠占 5.88%，其余 23.53% 为无规卷曲，属于混合
型二级结构。该蛋白基序无 N-糖基化位点。抗原位
点预测显示，其氨基酸序列的 2、44、45、66、72
和 76 位为抗原表位（图 6）。
2.3.5 TpRS1 蛋 白 的 同 源 性 比 对 及 系 统 进 化 分
析 在 GenBank 进 行 Blast 查 询 发 现，TpRS1 为 尚
未报道的新序列。通过与 GenBank 中登录的其他带
科绦虫的氨基酸序列进行同源性分析显示，TpRS1
编码的氨基酸序列与泡状带绦虫（ACI42356）的
氨 基 酸 序 列 相 似 性 最 高 达 到 77% ；与 猪 带 绦 虫
（AEP03198）、多头带绦虫（ACI42323）及细粒棘球
Ｈ ：α 螺旋 ；Ｅ ：β 折叠
图 5 TpRS1 二级结构的模拟图
图 6 TpRS1 抗原位点的预测
T. pisiformis ：豆状囊尾蚴 ；T. hydatigena ：泡状带绦虫 ；T. solium ：猪带绦虫 ；T. multiceps ：多头带绦虫 ；E. granulosus ：细粒棘球蚴
图 7 TpRS1 推测的氨基酸序列与其他带科绦虫的同源性分析
图 8 MP 法构建的 TpRS1 基因系统进化树
5 10 20 30 40 50 60 70 8075655545352515
1 85
10 20 30 40 50
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
T. pisiformis MR A Y I V L L T L T V F V V A V S A E E P KME D VMK S L K KG ME C I H K F F N E D P L G K K
T. hydatigena . . V . . . . . A . S . . . . . . . . . . Q . P . . . I . . I . . . . . . . Y . . . Y . . . . . . R
T. solium . . . . . L . . A . S . . . . . . . . . . T . P . . . V . N I . . . . . V V Y . . . Y . . . . . . .
T. multiceps . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . A . P V . . V . . I . N . I . F V . . . . . . . . . . . .
E. granulosus . . . . . . . . A . S . . . . . . . . . . T . P . . . V . N I . . . . . V V Y . . . Y . . . . . . .
60 70 80
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
T. pisiformis MT E L A K AWA D S V L E A R S K V R A K L A E Y I K T L K S E A A
T. hydatigena I L Q . . . D . K E . M . . . . G . . . . S . . . . . . . . . . . . D
T. solium I A Q . . . D . K E AM . . . . . . . . . S . . . . . R G . . N . . .
T. multiceps I A Q . . . D . K E AMV . . . G . . . . A . . . . . R G . . N . . .
E. granulosus I A Q . . . D . K E AM . . . . . . . . . S . . . . . R G . . N . . .
T. hydatigena ACI32109
T. pisiformis
T. multiceps ACI42323
T. solium AEP03202
T. solium AEP03201
T. solium AF158184
T. solium AAQ16679
T. solium BAB18643
T. hydatigena ACI42356
T. solium AEP03198
T. solium AEP03199
T. solium ABI23956
T. solium BAB18646
T. solium BAB18645
T. hydatigena ACI32108
E. granulosus ACI32106
31
53
46
49
39
87
99
81
59
100
80
100
96
蚴（AC132106）的序列相似性都为 72%（图 7）。
根据 BLAST 比对结果，以细粒棘球蚴作为外
群，选取部分绦虫的氨基酸序列构建系统进化树，
TpRS1 与泡状带绦虫氨基酸序列同源性最高（图 8）。
3 讨论
豆状囊尾蚴病作为家兔的一种重要的寄生虫病，
国内广泛流行，但相关研究尚少。目前，主要根据
流行病学、临床症状及实验室检查等方面对豆状囊
尾蚴病进行综合诊断［15］。免疫学诊断方面的研究并
不多。免疫诊断依赖于高特异性的抗原。本试验选
取低分子量抗原基因 RS1 进行克隆，首次克隆兔豆
状囊尾蚴 TpRS1 基因，并最终成功构建了该基因的
重组质粒，为获得兔豆状囊尾蚴 TpRS1 抗原蛋白奠
2014年第7期 135韩乐乐等 ：兔豆状囊尾蚴 TpRS1 基因的克隆及其序列分析
定了基础。在 GenBank 进行 Blast 查询，发现该基
因核苷酸序列的 ORF 与猪带绦虫 RS1 的相同，均
为 258 bp，含有起始密码子和终止密码子均为 ATG
和 TAA，提示 RS1 基因可能由同一个祖先基因进化
而来。
生物信息学是目前生物学领域发展最为迅速的
学科，利用已建立的技术平台和大量的数据库体系，
可以迅速准确地预测目的基因或蛋白质的特性、定
位以及功能等关键信息。本试验从跨膜区分析、亲
水疏水性分析、信号肽分析、抗原位点及二级结构
分析对该蛋白的性质功能作出系统预测，TpRS1 编
码的氨基酸序列与泡状带绦虫的氨基酸序列最相似，
同源性达 77% ；与猪带绦虫、多头带绦虫及细粒棘
球蚴也有很高的同源性，都为 72%。且与物种进化
的结果相一致，反映了 RS1 基因编码产物在不同物
种结构上的稳定性对生物体的功能重要性。预测发
现其没有信号肽序列，说明该蛋白可能为包涵体表
达蛋白，从而为蛋白质表达后蛋白的获得部分提供
了依据。该蛋白为跨膜蛋白，有一定的跨膜区，这
些区段一般会形成 α 螺旋，穿越细胞膜脂质双层结
构而将该膜蛋白定位于细胞膜上，这与该蛋白二级
结构中主要为 α 螺旋的预测结果一致。在机体内疏
水性残基一般埋在蛋白内部，而亲水性残基位于表
面，因此蛋白的亲水部位与蛋白的抗原位点有密切
的联系，最高亲水性区域常位于抗原决定簇内部或
其附近［16］。经亲水性与抗原表位的共同分析发现该
蛋白可能是一个疏水性蛋白，但有 6 处抗原位点，
由此揭秘出该蛋白具有强大的生物学功能，为进一
步对该基因的表达及生物学功能的研究奠定基础，
也为该蛋白的免疫诊断、疫苗方面的研究提供理论
依据。
4 结论
本研究成功克隆了兔豆状囊尾蚴 TpRS1 基因，
该基因序列含有一个由 258 个核苷酸组成的开放阅
读框，编码 85 个氨基酸。利用生物信息学软件，成
功预测并分析了 TpRS1 基因编码蛋白的基本理化性
质、疏水性、信号肽、二级结构、抗原位点及与其
他带科绦虫的同源性等。
参 考 文 献
［1］汪明 . 家畜寄生虫学［M］. 第 3 版 . 北京 ：中国农业出版社 ,
2003 ：117-118.
［2］Toral-Bastida E, Garza-Rodriguez A, Jimenez-Gonzalez DE, et al.
Development of Taenia pisiformis in golden hamster（Mesocricetus
auratus）［J］. Parasit Vectors, 2011, 4 ：147.
［3］Kyngdon CT, Gauci CG, Rolfe RA, et al. In vitro oncosphere-killing
assays to determine immunity to the larvae of Taenia pisiformis,
Taenia ovis, Taenia saginata, and Taenia solium［J］. J Parasitol,
2006, 92（2）：273-281.
［4］ 杨世广 , 汪志楷 , 施宝坤 . 豆状带绦虫的人工感染及其发育
史［J］. 中国兽医科技 , 1986, 16（6）：16-19.
［5］周永学 , 杜爱芳 , 张雪娟 , 等 . 我国兔豆状囊尾蚴病的研究进
展［J］. 中国养兔杂志 , 2006（1）：25-28.
［6］张守发 , 鞠玉琳 , 李学一 , 等 . 不同抗原在兔豆状囊尾蚴病血清
学诊断中的研究［J］. 延边大学农学学报 , 1994, 16（2）：98-
102, 108.
［7］Ferrer E, Bonay P, Cuevas MF, et al. Molecular cloning and
characterisation of Ts8B1, Ts8B2 and Ts8B3, three new members of
the Taenia solium metacestode 8 ku diagnostic antigen family［J］.
Mol Biochem Parasitol, 2007, 152（1）：90-100.
［8］Assana E, Kanobana K, Tume CB, et al. Isolation of a 14 ku antigen
from Taenia solium cyst fluid by HPLC and its evaluation in enzyme
linked immunosorbent assay for diagnosis of porcine cysticercosis
［J］. Res Vet Sci, 2007, 82（3）：370-376.
［9］Hancock K, Khan A, Williams FB, et al. Characterization of
the 8-kilodalton antigens of Taenia solium metacestodes and
evaluation of their use in an enzyme-linked immunosorbent assay for
serodiagnosis［J］. J Clin Microbiol, 2003, 41（6）：2577-2586.
［10］Dang Z, Watanabe J, Kajino K, et al. Molecular cloning and charac-
terization of a T24-like protein in Echinococcus multilocularis［J］.
Mol Biochem Parasitol, 2009, 168（1）：117-119.
［11］Ferrer E, Mart nez-Escribano JA, Barderas ME, et al. Peptide
epitopes of the Taenia solium antigen Ts8B2 are immunodominant
in human and porcine cysticercosis［J］. Mol Biochem Parasitol,
2009, 168（2）：168-171.
［12］Sako Y, Fukuda K, Kobayashi Y, et al. Development of an immuno-
chromatographic test to detect antibodies against recombinant Em18
for diagnosis of alveolar Echinococcosis［J］. J Clin Microbiol,
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期136
2009, 47（1）：252-254.
［13］Kim SH, Bae YA, Yang Y, et al. Paralogous proteins comprising the
150 kDa hydrophobic-ligand-binding-protein complex of the Taenia
solium metacestode have evolved non-overlapped binding
affinities toward fatty acid analogs［J］. International Journal for
Parasitology, 2011, 41（11）：1207-1215.
［14］Lee EG, Kim SH, Bae YA, et al. A hydrophobic ligand-binding
protein of the Taenia solium metacestode mediates uptake of the
host lipid ：Implication for the maintenance of parasitic cellular
homeostasis［J］. Proteomics, 2007, 7（21）：4016-4030.
［15］许伟 . 家兔囊虫病的诊断与防治［J］. 畜牧兽医杂志 , 2009,
28（2）：134.
［16］Hopp TP, Woods KR. Prediction of protein antigenic determinants
from amino acid sequences［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1981,
78（6）：3824-3828.
（责任编辑 马鑫）