全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
收稿日期 ： 2014-03-20
基金项目 ：西南民族大学研究生创新性项目（CX2014SZ75）
作者简介 ：陈亚冰，男，硕士研究生，研究方向 ：高原动物免疫分子机制 ；E-mail ：cybxc923410296@126.com
通讯作者 ：李键，男，博士，教授，研究方向 ：动物生殖调控 ；E-mail ：lijian@swun.cn
Toll 样 受 体（Toll-like receptors，TLRs） 是 一
类重要的天然免疫识别受体，其可以识别一种或者
多种特定的病原体及其产物，即病原体相关分子模
式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP），
从而启动针对病原体的早期应答，诱发获得性免疫
反应［1-5］。作为 TLR 家族的重要一员，TLR3 是识
别 dsRNA 的特异性受体，当病毒感染机体时，会
在机体的细胞内复制产生 dsRNA，TLR3 可以识别
dsRNA，并将信号向下游传递，最终激活干扰素
调 节 因 子 3（Interferon regulatory factor3，IRF3） 和
核 因 子 κB（Nuclear factor B，NF-κB）， 启 动 核 内
相关基因的表达，合成 I 型干扰素、白细胞介素 6
麦洼牦牛 TLR3 基因编码区的克隆及生物信息学分析
陈亚冰1  兰道亮2  林宝山1  黄偲1  黄勇1  李键1，2
（1. 西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041 ；2. 西南民族大学青藏高原研究院，成都 610041）
摘 要 ： 利用分子克隆技术成功获得麦洼牦牛 TLR3 编码区基因序列，采用相关分析及预测软件对基因及其编码的蛋白质
进行基本理化性质、二级结构及结构域等分析预测。结果表明该基因包含了 1 个 2 715 bp 的开放阅读框，编码 904 个氨基酸 ；所
编码的蛋白质二级结构主要由 α 螺旋及无规则卷曲为主 ；TLR3 基因进化树及基因同源性比对结果表明 TLR3 基因及其保守，牦牛
TLR3 基因与黄牛、绵羊和马等哺乳动物遗传距离很近。
关键词 ： 麦洼牦牛 TLR3 基因 克隆 生物信息学分析
Cloning and Bioinformatics Analysis of TLR3 Gene in Maiwa Yak
Chen Yabing1 Lan Daoliang2 Lin Baoshan1 Huang Cai1 Huang Yong1 Li Jian1，2
（1. College of Life Science and Technology Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041 ；2. College of Tibetan Plateau Research，
Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041）
Abstract: The coding sequence of Maiwa yak（Bos grunnien）TLR3 was cloned in this research. Some characteristics of the TLR3 gene
and encoded protein sequences were predicted and analyzed by the methods of bioinformatics in the following aspects, including the general
physical and chemical properties, secondary structure and protein domain. Results showed that the coding region sequence of Maiwa yak TLR3
contains a complete open reading frame（2 715 bp）encoding 904 amino acids. The secondary structures of the protein are mainly composed of
a-helix and random coli. The phylogenetic tree shows that the gene of Maiwa yak was so close to cattle, sheep and horse. Sequence alignment of
TLR3 gene also showed highly homology in yak with other species.
Key words: Maiwa yak TLR3 gene Cloning Bioinformatic analysis
（Interleukin6，　IL-6）、IL-8 肿瘤坏死因子 α（Tumor
necrosis factor α，TNF-α） 等 细 胞 因 子， 启 动 和 调
节机体的天然免疫反应，并继而激发获得性免疫反
应［6，7］。人和小鼠上的研究结果表明，TLR3 是重
要的抗病候选基因，该基因的突变与多种疾病的抗
性 / 易感性存在着显著相关。
牦牛时代生活在高原环境下的特殊物种，其机
体早已适应了高原的低氧、严寒等恶劣天气。作为
高原上特有的模式动物，其可能存在特殊的抗病和
免疫机制，因此对其免疫机制的研究就具有一定的
必要性。另外，近年来牦牛疫病尤其是重大疫病的
发病有逐年上升的趋势，严重阻碍了牦牛业的健康
2014年第9期 185陈亚冰等：麦洼牦牛 TLR3基因编码区的克隆及生物信息学分析
发展。因此，对牦牛的抗病分子机制进行研究，一
方面可以深入理解高原动物特有的免疫机制，另一
方面也为牦牛的抗病育种提供了理论基础。本研究
克隆了牦牛 TLR3 基因，并对所得序列进行了生物
信息学分析，这对揭示牦牛传染病的发生和传播机
制及天然免疫的调节机理具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 试验所用材料为牦牛脾脏组织，
采自成都市青白江区唐家寺向阳牛市屠宰场，属于
麦洼品种牦牛（四川阿坝）。
1.1.2 主要仪器和试剂 普通 PCR 仪、电泳仪、琼
脂糖凝胶成像系统均购自美国 Bio-Rad 公司 ；LA Taq
DNA 聚合酶购自天根 ；pMD-19T Vector 购自 TaKaRa
公司；DNA 片段回收纯化试剂盒购自 AXYGEN 公司；
反转录试剂盒购自 Ferments 公司 ；TRIZOL 试剂购
自 Invitrogen 公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据 GenBank 中登录的野
牦牛及黄牛 TLR3 基因序列，应用 Premier 5.0 软件
设计能获得 TLR3 编码区全长的引物。引物序列，
退火温度及预期扩增片段长度见表 1，引物由上海
Invitrogen 公司合成。
表 1 基因 TLR3 的引物序列
引物名称 引物序列（5-3） 退火温度（℃） 预计扩增片段（bp）
TLR3-S GAAAACGAACTG- 58 2 942
GATTTGGACTAA
TLR3-A GGGAGACGTATTT-
CCATAGAAGAGA
1.2.2 RNA 的 提 取 和 cDNA 合 成 每 100 mg 牦 牛
脾脏组织，加入 1 mL Trizol，采用液氮研磨经典方
法提取总 RNA，检测其纯度和完整度，-80℃保存
备用 ；采用 Ferments 公司的 RevertAidTM First Strand
cDNA Synthesis Kit 进行反转录反应，采用 20 μL 体系：
模板 2 μg，oligo dT18 1 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，
RibolockTM Rnase Inhibitor 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix
2 μL，Reverse Transcriptase 1 μL，RNase Free dH2O
补足到 20 μL，按以下程序进行反转录反应 ：42℃、
60 min ；70℃、5 min，合成 cDNA，-20℃保存。
1.2.3 目的基因的克隆 以获得牦牛脾脏组织 cDNA
为模板，进行 PCR 扩增。反应体系为 ：cDNA 1 μL，
2×Taq MasteMix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，双蒸
水 10 μL。反应条件 ：95℃预变性 5 min ；94℃变性
45 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 3 min，30 个循环，
72℃延伸 5 min。PCR 产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电
泳查看扩增结果，Axygen 凝胶回收试剂盒回收纯化
目的产物。将 PCR 产物连接 pMD19-T 载体，转化
DH5α 感受态细胞并在 Amp+ 琼脂平板上涂板，37℃
培养后挑选单菌落，菌液 PCR 鉴定后，将阳性重组
质粒送往 Invitrogen（上海）公司进行测序。
2 结果
2.1 目的基因的扩增
牦牛 TLR3 基因扩增结果如图 1，扩增片段大小
约为 2 942 bp 与预期扩增片段大小相符，将获得的
序列与 NCBI 数据库中进行 Blast 分析，结果表明，
该序列与其它物种的 TLR3 基因存在高度同源性，
初步推测该序列为牦牛 TLR3 基因的编码区。
2000 2000
3000
1000
bp
M1 1 M2
1000
750
500
250
100
M1 ：DNA marker 2000 ；M2 ：1 kb DNA ladder ；1 ：TLR3 基因扩增产物
图 1 牦牛 TLR3 基因 PCR 扩增结果
2.2 基因基本理化性质分析
PCR 扩增后获得牦牛 TLR3 基因全长 2 942 bp
（GenBank 登 录 号 为 KF990164）， 编 码 区 为 2 715
bp，其编码 904 个氨基酸 ；该编码的蛋白分子量为
103.7694 kD ；理论等电点为 6.82 ；不稳定系数为
51.10，表明该蛋白可能为不稳定蛋白质 ；该蛋白含
有正负电荷残基数目分别为 87 和 91。
2.3 TLR3蛋白二级结构预测
运用 SOPMA 服务器对 TLR3 编码的蛋白质二
级结构进行预测，见图 2，该蛋白 α-螺旋（Alpha
helix） 占 37.50% ； 自 由 卷 曲（Random coil） 占
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期186
47.90% ；延伸链（extended strand）占 14.60%，表明
蛋白质的二级结构主要有 α-螺旋以及自由卷曲组成。
2.4 TLR3蛋白结构域和蛋白功能位点预测
利用 Interpro 在线工具对牦牛 TLR3 蛋白进行结
构域预测，结果见图３。该蛋白质在 N 端有多个亮
氨酸富集区域 LRRs（Leucine rich repeat），LRRs 是
受体识别存在于病原体细胞表面的分子标志 ；C 端
第 646-698 个氨基酸处有一个半胱氨酸富集区域 ；C
端第 753-901 个氨基酸处有一个 Toll/IL-1R（Toll/IL-1
receptor homologous region，TIR）功能结构域，该功
能域在介导细胞内信号传递，与天然免疫和获得性
免疫作用的发挥密切相关［8］。
10
Alpha helix Hh：339 is 37.50%
Extended strand Ee：132 is 14.60%
Random coil Cc：433 is 47.90%
20 30 40 50 60 70 80 90 100
图 2 TLR3 蛋白质二级结构预测
1 100 200 300 400 500 600 700 800 904
Domain
Repeat
Leucine-rich repeat
Cysteine-rich flanking region
Toll/interleukin-1 receptor homologyTIRdomain
2.5 牦牛TLR3蛋白分子跨膜区预测
利用在线分析程序 TMpred 对 TLR3 蛋白质跨膜
区进行预测，预测结果见图４，该蛋白在 708-729
氨基酸处有一个典型跨膜区段，结合结构域分析，
此处应该为 TLR3 的跨膜区域。
2.6 同源性分析
利 用 DNAStar 软 件 子 程 序 MegAlign 对 牦 牛
TLR3 基因与其它物种 TLR3 基因序列进行同源性
比 对， 结 果 如 图 5 所 示。 牦 牛 TLR3 基 因 与 野 牦
牛、黄牛、绵羊相似性最高，分别为为 99.8% 和
99.3%，96.8% ；与原鸡及斑马鱼同源性较低，分别
为 66.2%，53.6%。该结果说明牦牛 TLR5 基因在长
期进化中较为保守，尤其在哺乳动物间具有较高的
保守性。
图 3 TLR3 蛋白结构域分析
2.7 进化树构建
用 MEGA 5.0 软件的 Neighbor-Joining 法，对 11
个物种的 TLR3 基因序列构建 Bootstrap 验证的系统
发育树。结果见图 6，牦牛与野牦牛和黄牛 TLR3 基
因的亲缘关系最近，并与绵羊、野猪、马、小家鼠
等哺乳动物形成一个分支。
3 讨论
牦牛是青藏高原上的一个特有物种，近年来，
牦牛疾病以及重大传染病发病几率的增加已经成为
了阻碍当地畜牧业经济发展的主要问题，这就迫切
需要研究牦牛抗病感染分子机制从而用于指导牦牛
业的健康发展。本试验采集了牦牛脾脏组织，提取
RNA，RT-PCR 法对 TLR3 基因进行克隆测序并进行
生物信息学分析。分析结果表明牦牛 TLR3 基因编码
2014年第9期 187陈亚冰等：麦洼牦牛 TLR3基因编码区的克隆及生物信息学分析
区序列与野牦牛、黄牛及绵羊等物种具有较高的同
源性，这进一步证明了 TLR3 基因是一个进化上保
守的基因。另外，推测牦牛与其它物种 TLR3 基因
的差异可能存在于表观遗传学方面上。例如，牦牛
TLR3 基因的的启动子区与其它物种相比可能存在不
同程度甲基化水平，从而导致了表达量存在差异性。
因此，在接下来的工作中需要重点比较牦牛与其它
物种在 TLR3 基因非编码区的甲基化水平的差异性。
蛋白结构域预测显示该蛋白与 TLRs 家族其它成员
一样拥有 LRRs、TIR 功能区，这些结构域被证明在
介导 TLRs 识别微生物细胞壁表面上的甘露糖、脂
多糖、多肽糖和胞壁酸等各种细胞表面的病原体相
关 分 子 模 式（Pathogen associated molecular patterns，
PAMPs）继而诱发天然免疫及获得性免疫反应过程
中扮演重要角色［9-11］。
目 前， 研 究 发 现 TLR3 对 乙 型 肝 炎 病 毒， 单
纯疱疹病毒及流感病毒等发挥着重要的抗病毒作
用［12-14］。另外，TLR3 基因多态性被证明与病毒致
病抗性 / 易感性有着密切关系［15，16］。因此，后续研
究将分析不同基因型在各品种牦牛间的分布规律并
通过相关性分析揭示牦牛 TLR3 基因遗传进化变与
免疫相关性状的关系及确定遗传标记，进而为实现
标记辅助选择奠定基础。
4 结论
牦牛与其它物种的 TLR3 基因编码区序列具有
较高同源性，TLR3 基因进化上高度保守。至于碱基
的差异对蛋白功能的影响我们将进行更深一步的研
究。TLR3 基因编码区的克隆及生物信息学分析为后
续研究牦牛的免疫机制奠定了理论基础。
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-5000
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
-4000
-3000
-2000
-1000
0
1000
2000
3000
图 4 TLR3 蛋白跨膜区域预测
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12.1 12.4 71.5 44.9 15.6 16.1 23.7 12.0 12.0 11.4
99.3 53.7 66.1 84.0 83.7 78.5 96.8 99.8 87.0 89.0 䟾⢖⢋Bos mutusPercent Identity 哴⢋Bos taurusᯁ傜劬Danio rerio৏呑Gallus gallusӪHomo sapiens⥅⥤Mucaca mulattaሿᇦ啐Mus musculus㔥㖺Ovis aries⢖⢋Yak傜Equus caballu䟾⥚Sus scrofa0.7 53.4 65.9 83.7 83.4 78.4 96.3 99.3 86.6 88.773.5 74.4 55.6 53.4 53.3 53.7 54.1 53.6 54.1 54.446.1 46.6 68.0 66.8 65.4 63.9 66.4 66.2 67.1 66.718.3 18.7 74.1 44.7 96.3 81.1 84.3 84.1 87.9 86.118.7 19.1 74.3 45.4 3.8 80.8 83.8 83.8 87.6 85.725.9 26.0 73.6 50.5 22.2 22.7 78.2 78.6 80.8 80.13.3 3.8 72.3 45.6 18.0 18.5 26.4 96.8 86.6 89.00.2 0.7 73.8 46.0 18.2 18.6 25.8 3.3 87.0 89.014.5 15.0 72.2 44.1 13.3 13.7 22.7 15.0 14.4 89.5
图 5 不同物种间 TLR3 基因同源性比对䟾⢖⢋Bos mutus|ref|XM 005899004.1哴⢋Bos taurus|ref|NM 001008664.1ᯁ傜劬Danio rerio|ref|NM 001013269.3৏呑Gallus gallus|ref|NM 001011691.3ӪHomo sapiens|ref|NM 003265.2⥅⥤Mucaca mulatta|ref|NM 001036685.1ሿᇦ啐Mus musculus|ref|NM 126166.4㔥㖺Ovis aries|ref|NM 001135928.1⢖⢋Yak|KF990164傜Equus caballu|ref|NM 001081798.1䟾⥚Sus scrofa|ref|NM 001097444.1
0.05
100
100
98
83
100
100
100
67
图 6 TLR3 基因系统进化树构建
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期188
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（责任编辑 李楠）