全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
多肽及蛋白类药物自 20 世纪 90 年代初应用于
临床以来，经过 20 多年的发展已经在全球医药市场
上广泛使用，如治疗糖尿病的胰岛素，2009 年国内
的销售额就已超过 10 亿元。
多肽和蛋白质属于生物大分子，其分析难点在
于肽段离子化过程中就发生碎裂而无法检测。1966
年，Muson 等［1］提出了一种软电离方法——化学电
离技术（Chemical ionisation，CI），软电离技术的出
现使高精密度分析生物大分子结构成为可能。1981
年，Morris 等［2］发展了快原子轰击技术（Fast atom
bombardment，FAB），使质谱能用于分析包括多肽及
蛋白在内的高极性、难挥发和热不稳定样品。1988
年，Tanaka 等［3］发明了基质辅助激光解析电离技术
收稿日期 ：2013-10-23
基金项目 ：江苏高校优势学科建设工程资助项目
作者简介 ：范学海，男，硕士研究生，研究方向 ：多肽合成及其分析 ；E-mail ：fxh19890119@163.com
通讯作者 ：朱颐申，男，副教授，硕士生导师，研究方向 ：多肽合成、分析及制剂 ；E-mail ：zhuyish@njtech.edu.cn
液质联用在多肽及蛋白质定性方面的研究进展
范学海  朱颐申  陈兰婷  李文惠  韦萍
（南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211816）
摘 要 ： 随着液质联用技术的不断发展，液相色谱—质谱联用系统广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析等多方面，
该技术将液相色谱的高分离能力与质谱强大的结构鉴定功能相结合，具备了高分离度、高灵敏度、高选择性以及提供丰富结构信
息等一系列优点。这些优点决定了液相色谱—质谱联用系统将在越来越多地相关领域得到应用，尤其是近年来在生物大分子方面
开展了大量研究，结合这些研究对液质联用技术在多肽及蛋白质定性方面进行了系统归纳。
关键词 ： 液质联用（LC-MS） 多肽和蛋白质 定性分析
Applications of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in the
Qualitative Analysis of Peptides and Proteins
Fan Xuehai Zhu Yishen Chen Lanting Li Wenhui Wei Ping
（The College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211816）
Abstract:  With liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS）technology developing continuously, the system of LC-MS is
widely used in pharmaceutical analysis, food analysis, environmental analysis and related fields. LC-MS provides powerful function of structure
identification, which includes the ability of separation by LC and the advantages of high resolution, high sensitivity, high selectivity by MS. These
advantages demonstrate that LC-MS will be applied in more related fields. In recent years, many researches were carried out in the identification
of biological macromolecules by LC-MS. The analysis of peptide and protein qualitatively by LC-MS is reviewed.
Key words:  Liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS） Peptides and proteins Qualitative analysis
（Matrix assisted laser desorption ionisation，MALDI），
使生物大分子的相对分子质量可测得值高达 25 kD。
Fenn［4］于 1989 年提出的电喷雾离子化（Electrospray
ionisition，ESI）技术大大推动了多肽及蛋白质化学
的发展，使得液相色谱-质谱联用（Liquid chromato-
graphy-mass spectrometry，LC-MS）研究生物大分子
成为可能，Fenn 也于 2002 年因该贡献获得了诺贝
尔化学奖。此后质谱技术飞速发展，已成为目前最
热点的分析手段之一。
LC-MS 技术结合了 LC 的高分离能力和 MS 的高
选择性、高灵敏度，使其在生物大分子分析方面更
加快速、准确。目前最为广泛应用的是 LC-ESI-MS，
本文重点讨论 LC-ESI-MS 方法在多肽及蛋白质定性
2014年第6期 63范学海等 ：液质联用在多肽及蛋白质定性方面的研究进展
方面的研究应用。
1 ESI 原理
ESI 过程第一步是在喷雾毛细管管口加一高电
压，作用于经毛细管进入离子化室的溶液，将 3-6
kV 的电压加到毛细管和对应的电极之间，电压导致
毛细管末端液滴表面的电荷增加，高电压导致液体
表面分裂和形成多电荷液滴，与毛细管对应的电极
携带的正电荷或负电荷以产生正电荷或负电荷液滴。
因此 ESI 可分为正离子和负离子两类。随后的离子
化过程是进行质谱分析的关键步骤。带电液滴形成
分子离子的机理有两种假设，分别是离子蒸发假设
机理和带电残基假设机理。Iribane 和 Thomson［5］提
出了离子蒸发假设机理，该机理认为 ：带电溶液在
电场作用下向带相反电荷的电极运动，并形成带电
液滴，由于小雾滴分散，比表面积增大，溶剂在电
场中迅速蒸发，结果带电雾滴表面单位面积的场强
高达 108，从而产生液滴的“爆裂”，重复这一过
程，最终产生分子离子。而 Schmelzeisen-Redeker 和
Röllgen 等［6］提出了带电残基假设机理 ：处于毛细
管尖端的极性溶液液滴在强电场中积累电荷，带电
的雾滴在电场作用下运动，由于溶剂迅速蒸发，库
伦斥力大于表面张力导致液滴破裂成较小液滴，再
蒸发溶剂，液滴再破裂，溶液中分子所带电荷在去
溶剂化时被保留在分子上形成离子化分子，最终形
成气相离子。
多肽或蛋白质通过 LC 分离时能在强电场作用下
部分质子化，也能经气相分子离子反应，在 ESI 腔
内形成［M+H］+，［M+2H］2+，［M+ 3H］3+，……，
［M+nH］n+ 等一系列电荷离子。由于多肽或蛋白质
中含有较多的碱性氨基酸（Arg，Lys 和末端 NH2），
在酸性溶液中更容易质子化，因此多肽或蛋白质在
ESI 中多数情况下是以正离子方式进行。测定时只
要适当提高溶液的酸度，如加入甲酸或乙酸增大离
子化效率便可以提高灵敏度，得到理想的测定结果。
不同的多肽或蛋白质质子化的程度各异，容易发生
质子化的多肽或蛋白质可以获得更好的灵敏度。
2 LC-ESI-MS 定性分析多肽及蛋白质
LC-ESI-MS 对多肽及蛋白质可进行多种定性分
析，如分析准确的相对分子质量、一级结构序列、
二硫键位置等。对于侧链糖基、磷酸盐、硫酸盐等
多肽及蛋白质，还能测定取代基的结构和位置。
2.1 多肽及蛋白质相对分子质量的测定
多肽及蛋白质的相对分子质量是分析检测的一
个重要参数，目前常规测定多肽及蛋白质相对分子
质量的方法有很多，包括凯氏定氮法、渗透压法、
光散射法、考马斯亮蓝法和凝胶过滤等。但这些方
法操作复杂，灵敏度低，使测得的相对分子质量不
准确。ESI-MS 测定多肽及蛋白质相对分子质量优点
在于 ：准确性好、易于操作及灵敏度高。
ESI 测定多肽及蛋白等生物大分子的相对分子
质量主要原因是在电喷雾过程中能形成稳定多重电
荷离子，这样就使得单电荷质量范围为 0.05-3 kD
的质谱仪可以测定高达几百 kD 的相对分子质量，
而这是过去的接口技术无法做到的。据报道，75 kD
相对分子质量以内化合物的准确度可达到 5×10-6，
即使是复杂的蛋白质混和物，经 LC-ESI-MS 测定也
能得到令人满意的结果。
李萌等［7］利用 LC-ESI-MS 技术分析了重组抗
肿瘤抗病毒蛋白（乐复能），测得的相对分子质量为
19.311 63 kD，与理论相对分子质量（19.311 27 kD）
的相对误差为 0.2 ×10-6。
Kou 等［8］从鸡豆白蛋白的水解产物中分离纯
化出了抗氧化多肽——Cpe- Ⅲ，并与水解产物中
其他肽类比较，结果表明 Cpe- Ⅲ表现出了最高的
抗氧化能力，利用 LC-ESI-MS 对 Cpe- Ⅲ进行鉴定，
确定其相对分子质量为 1.155 kD，为十肽化合物
RQSHFANAQP。
Wang 等［9］ 用 木 瓜 蛋 白 酶、 碱 性 蛋 白 酶、 胰
蛋白酶将芝麻蛋白进行酶解，其中胰蛋白酶酶解的
产物最容易进行金属螯合。用锌离子固定金属亲和
色 谱 法（Immobilized metal affinity chromatography，
IMAC）对其进行处理，从水解产物中分离得到 6 个
容易与锌离子螯合的多肽，最后用 LC-ESI-MS 对其
进行结构鉴定分析，结果表明，6 个多肽的相对分
子量与理论值相符，Ser-Met 二肽的相对分子量为
0.236 kD，Leu-Ala-Asn 三 肽 的 相 对 分 子 量 为 0.316
kD，Ile-Ala-Asn 三 肽 的 相 对 分 子 量 为 0.316 kD，
Arg-Lys-Arg 三肽的相对分子量为 0.458 kD，Arg-Gln-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期64
Arg 三肽的相对分子量为 0.458 kD，Asn-Cys-Ser 三
肽的相对分子量为 0.322 kD。
2.2 多肽及蛋白质一级结构的测定
在 20 世纪 50 年代，Edman 降解是氨基酸测序
的唯一选择，后来又发明了自动测序仪，但这些方
法存在很多缺点 ：速度慢 ；需高纯度的蛋白质样品 ；
需自由的氨基端。由于基因组学、蛋白质组学研究
的深入开展，大量的功能蛋白迫切需要快速准确的
测定蛋白质序列的技术。经过几十年的探索及发展，
LC-ESI-MS 在多肽及蛋白质测序方面已经成熟完善。
LC-ESI-MS/MS 在多肽及蛋白质测序方面广泛应
用 ：LC 高效分离样品后通过 ESI 离子化，多肽的分
子离子进入质谱得到分子离子峰和一系列碎片离子，
经过解析得到肽段序列。李响等［10］分别采用四级杆 -
飞行时间串联质谱（ Quadrupole time-of-flight tandem
mass spectrometry， Q-TOF-MS） 和 离 子 阱 串 联 质 谱
（ion trap tandem mass spectrometry，Ion-Trap-MS） 技
术测得了融合蛋白 FP3 的一级结构，通过胰蛋白
酶酶解蛋白并除去多肽混合物中糖肽的糖基后，将
脱糖多肽进行 LC-ESI-MS/MS 分析，运用 Q-TOF 和
Ion-Trap 两种串联质谱进行测定，结果表明通过 LC-
ESI-Q-TOF-MS 测定完成了融合蛋白 FP3 的 76% 的
氨基酸序列，随后采用高灵敏度的 Ion-Trap 串联质
谱进行测序，进一步补充了 Q-TOF 串联质谱未检出
的 24% 序列。
多酶酶解能更充分地酶解蛋白，与单酶酶解相
比，可以提高 LC-ESI-MS 对蛋白的鉴定能力。Chen
等［11］应用胰蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶对
人肝脏组织分别酶解，通过糖蛋白质组学分析发现，
3 种酶酶解能够发现单酶酶解所未发现的位点，能
够获得更多肽段信息，还可提高蛋白鉴定时氨基酸
序列覆盖率。苗兰等［12］采用胰蛋白酶和 V8 酶分别
酶解牛血清白蛋白（BSA）、大肠杆菌及复杂血清样
品，与单酶酶解比较，双酶酶解的蛋白总发现率增
加了 11%，蛋白总覆盖率增加了 10% 以上。
经过 LC-ESI-MS 的分析，能得到大量肽段信息，
目前有以下两种方法对这些信息进行分析 ：数据库
检索法和从头测序法（de novo），从而准确的鉴定多
肽及蛋白质的一级结构。
数据库检索法鉴定蛋白的一级结构 ：酶解后
的蛋白片段通过质谱精确测定了每个肽段的相对分
子质量，通过与数据库中已知蛋白的理论酶解肽段
相对分子质量比较从而鉴定蛋白结构，数据库检索
结果强烈依赖于数据库中所收录的蛋白质序列以及
搜索引擎的算法。例如数据库中不存在相应的序
列则无法鉴定出相应的蛋白质，而数据库过于庞
大则蛋白鉴定的概率会降低，因此选择适合的蛋
白数据库尤为重要 ；常用的搜索引擎有 Mascot［13］、
Sequest［14］、X!Tandem［15］ 等， 生 物 资 源 设 施 协 会
（The Association of Biomolecular Resource Facilities，
ABRF）在 2010 年的蛋白质组研究工作中，采用了
多种搜索引擎来鉴定蛋白结构，其中采用 Mascot 的
实 验 室 占 55%，Sequest 占 21%，X!Tandem 占 3%，
其他的一些搜索引擎占 21%。该研究表明，Mascot
和 Sequest 是最常用的搜索引擎。Fernández 等［16］采
用胰蛋白酶酶解 β-乳球蛋白，利用 LC-ESI-MS 技术
测定酶解多肽的一级结构并进行 MASCOT 数据分析，
在 NCBInr 201011 数据库中进行搜索，结果表明测
得的 β-乳球蛋白的氨基酸序列覆盖率达到 85.8%。
从头测序方法不依赖现有的数据库，根据肽段
规律裂解的特点，直接从裂解图谱中推导出肽段的
序列，具有数据库搜索方法不可替代的优势，其基
本步骤包括 ：质谱图的构建，离子类型的确定和测
序算法。Zhou 等［17］从海参刺参蛋白中提炼出抗氧
化蛋白——TP2b-1，利用 LC-ESI-MS 进行鉴定其氨
基酸序列，结合从头测序方法并利用 BioLynx 分析
软件进行分析，结果表明 TP2b-1 的氨基酸序列为
GPEPTGPTGAPWLR。
2.3 翻译后修饰（post-translational modifications，
PTMs）多肽及蛋白质的结构分析
蛋白质的功能是多种多样的，PTMs 使得蛋白
质的功能更加丰富，对蛋白质的功能和结构产生巨
大影响。目前已报道了约 200 多种 PTMs 类型，如
糖基化［18］、磷酸化［19］、乙酰化［20］、甲基化［21］等，
最受关注的是糖基化修饰和磷酸化修饰。LC-ESI-MS
在 PTMs 分析方面主要解决以下两个问题 ：（1）修
饰基团的类型 ；（2）修饰位点、数量。
蛋白质的糖基化修饰是低聚糖以糖苷的形式与
2014年第6期 65范学海等 ：液质联用在多肽及蛋白质定性方面的研究进展
蛋白上特定的氨基酸残基形成共价结合。Hua 等［22］
利用非特异性蛋白酶水解糖蛋白，通过 LC-ESI-MS
分析得到在牛核糖核酸酶 B 上有一个 N-糖基化位
点 —— 第 60 位 天 冬 氨 酸， 连 接 13 条 糖 链 ；在 牛
乳铁蛋白上有 5 个 N-糖基化位点——第 252、200、
387、495 和 564 位天冬氨酸，共连接 59 条糖链 ；
在牛 κ-酪蛋白上有 4 个 O-糖基化位点——第 142、
152、154 和 163 位苏氨酸，共连接 20 条糖链，糖
蛋白上糖链结构的改变能够体现特定的生理或病
理状态改变。Wang 等［23］ 利 用 胰 蛋 白 酶 水 解 Hu-
recA1PI，酶解后在含有 PNGase F 的 37 H2O
18 中放置
16 h，进行同位素标记，然后进行 LC-ESI-MS 分析，
结合 PNGase F 的催化作用以及同位素标记，得出了
Hu-recA1PI 含有 3 个 N-糖基化位点，分别为第 46
位的 Asn——连接双链聚糖，有一部分三链聚糖以
及极少的四链聚糖 ；第 83 位的 Asn——连接三链以
及四链聚糖 ；第 247 位的 Asn——连接二链聚糖。
蛋白质的磷酸化修饰是通过蛋白质磷酸化激酶
将 ATP 的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程，
磷酸化修饰的作用位点为蛋白上的 Ser、Thr 和 Tyr
残基。Zhu 等［24］ 利用 LC-ESI-MS 分析了酪蛋白磷
酸化多肽（CPPs），考察了 β-CN f1-25 4P 上的丝氨
酸磷酸化在酪蛋白磷酸化多肽水解过程中的稳定性，
试验研究了温度在 75℃时，pH 分别为 6、7、8 时
丝氨酸磷酸化的稳定性，结果表明 pH7 时其稳定性
较好，同时发现温度和 pH 是影响磷酸化修饰稳定
性的两个重要因素。Zhu 等［25］在此基础上利用钙聚
集、乙醇沉淀和镓离子 IMAC 富集 CPPs，然后进行
LC-ESI-MS 分析鉴定 CPPs，结果表明镓离子 IMAC
结合钙聚集和乙醇沉淀是富集 CPPs 的有效方法，该
实验得出的结论对产业化生产 CPPs 和 CPPs 产品的
质量控制有很大帮助。
2.4 蛋白质分子内二硫键的定位
许多蛋白质内部都是通过二硫键形成稳定的
空间结构，如人胰岛素含有两个二硫键。二硫键位
置为研究蛋白立体结构与催化活性之间的关系提供
了依据，已有很多学者将 LC-ESI-MS 技术应用于二
硫键定位。Chen 等［26］在研究蛋白质的剪接作用时，
利用 LC-ESI-MS 技术检测到在极端嗜热菌 Pol Ⅱ中
的蛋白质剪接过程中存在着分子内二硫键的作用，
结果表明二硫键的位置存在于第 7 位的 Cys 和第
192 位的 Cys 之间，该分子内二硫键阻碍了蛋白质
的剪接作用。Krudysz-Amblo 等［27］分析了一种含有
两个二硫键的跨膜蛋白——组织因子（Tissue factor，
TF），利用 LC-ESI-MS 技术测定了 TF 的一级结构，
结果表明两个二硫键分别位于 Cys49-Cys57，Cys186-
Cys209。Li 等［28］利用 LC-ESI-MS 技术测定出溶解酵
素中二硫键的位置及其数量，溶解酵素经过胰蛋白
酶酶解，通过 LC 的分离找到含有 Cys 的肽段，再
经过 MS 以及 MS/MS 的数据分析，结果表明溶解酵
素中含有 4 个二硫键，位置分别为 Cys24-Cys146、
Cys48-Cys134、Cys83-Cys99 和 Cys95-Cys113。
3 展望
ESI 接口拓展了 LC-MS 在生物大分子方面尤其
是在多肽及蛋白质方面的应用，LC-ESI-MS 现已发
展成为分析蛋白质的常规工具。随着基因重组技术
和蛋白表达技术的日益成熟，生物技术产品的大规
模工业化生产技术也在不断完善和发展。各种各样
的重组类蛋白药物层出不穷，但这些蛋白药物因其
一级结构、PTMs、二硫键位置的不同而引起空间结
构的变化，进而引起生物活性的差异，因此对其定
性的研究显得尤为重要。科学、有效、快捷的鉴定
方法是发展趋势，LC-ESI-MS 因其灵敏、准确、快
速的特点，将在各类多肽及蛋白药物的定性方面发
挥重要作用。
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（责任编辑 狄艳红）