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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
Neuritin，中文名为神经营养素，是美国学者
Nedivi［1］ 在 1993 年发现并以可塑性候选基因 -15
（candidate plasticity-related genes 15，CPG15）报道。
1997 年 Naeve 等［2］将其命名为 Neuritin。
人类的 neuritin 基因位于染色体 6P25.1，全长
2 072 bp，开放读码框（ORF）为 426 bp，编码含有
收稿日期 ：2013-03-27
基金项目 ：内蒙古自治区高校蓖麻产业工程研究中心资助项目（BMYJ2010007）
作者简介 ：张树军，男，讲师，博士研究生，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：zh-shujun123456@163.com
通讯作者 ：黄瑾，女，博士，教授，研究方向 ：蛋白因子的功能与机制 ；E-mail ：huangjin623@163.com
Neuritin 毕赤酵母表达系统的构建及其对 PC12
细胞的影响
张树军1，2  赵臣3  狄建军1，2  穆莎茉莉1，2  仙玲玲4  于娜4  黄瑾4
（1. 内蒙古民族大学 生命科学学院，通辽 028000 ；2. 内蒙古自治区高校蓖麻产业工程研究中心，通辽 028000 ；3. 包头北方医院普外科，
包头 014000 ；4. 石河子大学医学院新疆地方与民族高发病重点实验室，石河子 832002）
摘 要 ： 旨在构建 Neuritin 的毕赤酵母表达系统获得大量有活性的 Neuritin 蛋白，研究其神经生物学功能。PCR 扩增编码
neuritin 基因 cDNA 序列，并纯化回收，通过酶切和连接插入穿梭载体 pPIC9K 中，转化大肠杆菌 DH5α，neuritin-pPIC9k 重组质粒
经 PCR 与测序鉴定后，使用 Sal Ⅰ酶切使其线性化，电击转化酵母菌 GS115，经筛选与鉴定，成功构建了 Neuritin 的毕赤酵母表
达系统。结果表明，使用甲醇诱导其表达，SDS-PAGE 和 Western blot 分析得到 11 kD 的 Neuritin 蛋白，纯化的 Neuritin 蛋白加入
PC12 细胞培养液中，能促进其突起的生长。
关键词 ： Neuritin pPIC9k 毕赤酵母表达系统 PC12 细胞
Constuction the Pichia pastoris Expression System of Neuritin and Its
Impacts on PC12 Cell
Zhang Shujun1，2 Zhao Chen3 Di Jianjun1，2 Mushamoli1，2 Xian Lingling4 Yu Na4 Huang Jin4
（1. College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000 ；2. Inner Mongolia Industrial Engineering Research
Center of Universities for Castor，Tongliao 028000 ；3. Department of General Surgery，Baotou Northern Hospital，Baotou 014000 ；
4. Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease University，Shihezi 832002）
Abstract:  It was to intend to construct Pichia pastoris expression system of neuritin, to obtain large amount of active Neuritin protein and
study its neurobiological function. Encoding cDNA sequence of neuritin was amplified by PCR, then the fragment was digested and ligated into
shuttle vector pPIC9K. The neuritin-pPIC9K recombinant was transformed into E. coli DH5α, and was confirmed by PCR and sequencing. The
recombinant was linearized by restriction enzyme Sal Ⅰ , and transformed into yeast GS115 by electric shock. After screening and identification,
the Pichia pastoris expression system of neuritin was successfully constructed. Using methanol to induce the expression of neuritin, through SDS-
PAGE and Western blot analysis, we obtained Neuritin protein about 11 kD. The purified Neuritin protein was added into PC12 cell culture
medium and it can promote the neurite growth of PC12 cell.
Key words:  Neuritin pPIC9K Pichia pastoris expression system PC12 cell
142 个氨基酸分子量为 15.3 kD 的 Neuritin 蛋白，其
中第 1-27 位氨酸为信号肽，第 116-142 位氨基酸为
糖基磷脂酰肌醇（glycolsylphosphatidylinositol，GPI）
锚定位点。Neuritin 蛋白有可溶性和以 GPI 形式锚
定在细胞膜上的膜蛋白两种形式。可溶性的 Neuritin
蛋白去除信号肽和 GPI，分子量为 10.98 kD。
2013年第10期 149张树军等 ：Neuritin 毕赤酵母表达系统的构建及其对 PC12 细胞的影响
Neuritin 可促进神经突起的生长和分支［3-5］、神
经元的迁移和网络形的形成［6-8］、突触的生成和成
熟［9］，调节突触的可塑性及抑制的细胞退变和凋
亡［10-13］，促进视觉皮层的发育［14，15］，以及损伤神
经功能的恢复，在治疗神经疾病及其损伤中具有良
好的应用前景［16-18］。因此，深入研究 neuritin 的生
物学功能，明确它在神经发育及再生过程中的作用
具有十分重要的意义。
Neuritin 在大肠杆菌原核表达系统中获得高水
平表达，但表达的 Neuritin 蛋白主要以包涵体形式
存在，没有活性［19］。为了获得大量具有天然活性
的 Neuritin 蛋白，研究其生物学活性和功能，本试
验构建 neuritin 的毕赤酵母分泌表达系统，诱导表达
Neuritin 蛋白，采用镍离子亲和层析法纯化 Neuritin
蛋白，纯化的 Neuritin 蛋白加入 PC12 细胞培养液中，
通过观察其对 PC12 细胞形态的影响，即细胞突起
的生长情况，研究 Neuritin 蛋白的神经生物学功能。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株和细胞株 Neuritin cDNA 全长序
列的重组质粒由本室保存 ；穿梭载体 pPIC9K 和酵
母菌 GS115 购自 Invitrogen 公司 ；大肠杆菌 DH5α 及
PC12 细胞株由本室保存。
1.1.2 酶和主要试剂 酵母提取物和胰蛋白胨购自
Oxide 公司 ；Not Ⅰ、EcoR Ⅰ内切酶购自 Promega 公
司、Taq DNA 聚合酶和 T4 DNA 连接酶购自大连宝
生物公司 ；酵母氮源（YNB）购自 Invitrogen 公司 ；
G418、RPMI 1640 和 F-12K 培养基购自 Sigma 公司 ；
鼠抗 6×His 单抗和羊抗鼠的 IgG-HRP 购自 Novagen
公司 ；预染低分子量蛋白质 Marker 购自索莱宝生物
科技有限公司 ；化学发光检测试剂盒购自上海康成
公司 ；Ni-NTA 蛋白纯化试剂盒购自 Qiagen 公司。
1.2 方法
1.2.1 Neuritin 基因的扩增 引物由上海生工生物工
程公司合成。上游引物 ：5-GACGAATTCCATCATC-
ATCATCATCATATG-3（下划线部分为 EcoR Ⅰ酶切
位点），下游引物 ：5-TATGCGGCCGCTCAGAAGGA
AAGCCAGG-3（下划线部分为 Not Ⅰ酶切位点）。
PCR 模板为含有 Neuritin cDNA 全长序列的重组质粒，
扩增条件为 ：94℃变性 30 s，54℃退火 30 s，72℃
延伸 60 s，30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。
1.2.2 构 建 neuritin-pPIC9K 重 组 质 粒 切 胶 回 收
PCR 扩增的 neuritin 片段，将回收的 neuritin 片段和
pPIC9K 质粒用 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ限制性内切酶进行
双酶切，然后用 T4 DNA 连接酶过夜连接，42℃热
击 45 s 转化 DH5α 菌，挑取单菌落进行 neuritin 基因
的 PCR 鉴定，最后将菌落 PCR 鉴定为 neuritin 阳性
的转化子进行测序鉴定。
1.2.3 Neuritin-pPIC9K 重组质粒转化毕赤酵母 参
照 Invitrogen 公司操作手册制备酵母菌 GS115 感受
态，同时 Sac Ⅰ酶切 neuritin-pPIC9K 重组质粒使其
线性化， 与 80 μL 感受态酵母菌混合，移入电转杯，
冰浴 30 min 后，于电转仪 1 500 V，5 μF，4.7 ms 条
件下电击，立刻加入 1 mL 冰浴山梨醇，将其涂布在
MD 板上，30℃培养至菌落出现。
1.2.4 酵母重组子的表型筛选及鉴定 筛选 His+Muts
表型酵母重组子。将 MD 板上的单菌落接种至每孔
装有 200 μL YPD 培养液的 96 孔板，30℃培养 2 d ；
每孔取 10 μL 一一对应加入到装有 190 μL YPD 培
养液的 96 孔板中，30℃过夜培养得到第 2 批酵母
菌 ；再取新的 96 孔板，按照第 2 批操作方法培养
第 3 批酵母菌 ；从第 3 批 96 孔板中各吸取 10 μL 菌
液加到含有不同浓度 G418 的 YPD 板上，30℃培养
至菌落出现。将挑选的 His+Muts 表型酵母重组子先
PCR 鉴定 neuritin 基因是否插入酵母基因组中，再
将 PCR 鉴定结果为阳性的酵母重组子进行测序，验
证 neuritin 基因的 ORF 是否正确。
将 neuritin 基因 ORF 正确的酵母重组子接种至
5 mL YPD 培养基中，30℃震荡培养（180 r/min）24 h；
取 15 μL 加入到 50 mL BMGY 培养基中，震荡培养
至 OD600 值在 2-6 之间 ；5 000 r/min 离心 5 min 沉淀
酵母菌，加入 BMMY 培养基重悬酵母菌，使 OD600
值等于 1 ；加入诱导剂甲醇，终浓度为 0.5%，30℃
诱导酵母重组子表达 Neuritin 蛋白 ；每隔 24 h 补加
甲醇，使其终浓度保持在 0.5% ；在培养 24、48 和
72 h 时各取 1 mL 菌液，并在 72 h 时收集菌液。将
收集的菌液 5 000 r/min 离心 5 min，将 1 mL 菌液的
上清进行 SDS-PAGE，分析 Neuritin 蛋白在 24、48
和 72 h 时的表达量，72 h 时的菌液上清用于纯化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期150
Neuritin 蛋白。
1.2.5 表达产物 SDS-PAGE 和 Western blot 分析 使
用 15% 的 SDS-PAGE， 取 80 μL 上 清 与 20 μL 5×
蛋白上样缓冲液混匀，煮沸 5 min，电泳上样量为
20 μL/ 孔，电泳结束后使用考马斯亮蓝对凝胶染
色，根据蛋白条带颜色深浅判断 Neuritin 蛋白在 24、
48 和 72 h 的 表 达 水 平， 并 根 据 目 的 蛋 白 在 SDS-
PAGE 胶中迁移距离的对数与标准分子量作图，计
算 Neuritin 蛋白的分子量。将诱导 72 h 的上清样品
进行 Western blot 分析，先经 SDS-PAGE 电泳，然后
电转至尼龙膜，用鼠抗 6× His 单克隆抗体结合后，
再用羊抗鼠的 IgG-HRP 进行显色，确定表达产物的
位置和分子量大小。
1.2.6 表达目的蛋白的纯化 将收集的菌液离心去
除酵母菌，上清中加入硫酸铵（终浓度为 55%），充
分混匀，4℃沉淀过夜。10 000 r/min 离心 30 min 后，
向沉淀加入 2 mL Binding Buffer 溶解沉淀蛋白，按照
Ni-NTA 蛋白纯化试剂盒的操作方法纯化 Neuritin 蛋
白，最后透析去除蛋白溶液中的咪唑。
1.2.7 蛋白定量 用 Bradford 法测定，以牛血清白
蛋白为标准，按蛋白浓度（μg/mL）= A595nm×550×
稀释倍数计算。
1.2.8 Neuritin 蛋白对 PC12 细胞的影响 基础培养
液为 1.5% 胎牛血清 RPMI 1640，96 孔板中每孔总液
体量为 125 μL。取对数生长期 PC12 细胞，用 0.25%
胰 酶 + 0.02% EDTA 混 合 消 化 细 胞 ；1 000 r/min 离
心 1 min，用含 1.5% 胎牛血清的 RPMI 1640 悬浮细
胞，按每孔悬液 100 μL，细胞密度为 6×103 个 /mL
接种至 96 孔板中。试验设阴性对照组、阳性对照组
和试验组，阴性对照组又分为空白对照组和 6×His
蛋白对照组。每组设 5 个孔。空白对照组加入 25 μL
PBS ；6×His 对 照 组 中 6×His 蛋 白， 终 浓 度 为 20
μg/mL ；阳性对照组加入神经生长因子（NGF），终
浓度为 25 ng/mL ；试验组加入 Neuritin，终浓度为
20 μg/mL。培养 48 h 后，按上述步骤给细胞换液，
在第 3 天观察结果。
2 结果
2.1 重组质粒的构建及鉴定
电泳结果（图 1）显示在约 460 bp 处出现特异
性条带，PCR 扩增出的条带与 neuritin 基因片段长
度（464 bp）相仿，插入 pPIC9K 载体，转化宿主菌
DH5α 菌，将 PCR 鉴定结果阳性的细菌（图 2），送
上海生工生物工程公司测序，结果显示其开放阅读
框（ORF）的序列同 GenBank U88958 核苷酸序列完
全一致。
M：DNA Marker；1-5：Neuritin 的 PCR 产物；6：阴性对照（PCR 反应未加模板）
图 1 PCR 扩增 neuritin 基因
M ：DNA Marker ；1-6 ：菌落 PCR 产物 ；7 ：阴性对照（PCR 反应未加模板）
图 2 PCR 鉴定 pPIC9K-neuritin 重组质粒
464
M 2 4 5 6
bp bp
250
500
2000
750
1000
1 3
线性化的 neuritin-pPIC9K 载体转化毕赤酵母菌，
PCR 鉴定酵母重组子为阳性（图 3），测序结果显示
neuritin 基因的 ORF 序列完全正确。
2.2 酵母重组子的诱导表达
经 MM 和 MD 平板两次筛选，获得 His+Muts 表
型酵母重组子，约占总菌落的 30%。SDS- PAGE 分
析不同诱导时间对 Neuritin 蛋白表达量的影响，在
诱导 24 h 时，即有 Neuritin 蛋白，但蛋白条带颜色浅，
说明量较低，随着诱导时间的延长，Neuritin 蛋白
的量逐渐增加，72 h 时达到高峰，且 Neuritin 蛋白
以可溶性形式分泌于培养上清中。作图计算 Neuritin
蛋白的分子量约 11 kD（图 4），与可溶性 Neuritin 蛋
白的分子量（10. 98 kD）相仿。
2.3 表达产物的Western blot鉴定
Western blot 结果（图 5）显示，在 10.98 kD 附
M 2 4 5 6 7
bp
250
500
2000
750
1000
1 3
464
bp
2013年第10期 151张树军等 ：Neuritin 毕赤酵母表达系统的构建及其对 PC12 细胞的影响
近出现一条杂交带，位置与 SDS-PAGE 中的蛋白条
带位置一致，表明酵母重组子的 neuritin 基因被甲醇
诱导表达，可能由于蛋白量过多导致条带面积过大。
2.5 Neuritin对PC12细胞的影响
在 PC12 细胞培养基中加入 Neuritin 蛋白，使用
倒置显微镜观察。结果（图 7）发现，在培养第 3 天，
空白对照组 PC12 细胞呈小圆型，无突起生长 ；6×
His 对照组的细胞形态与空白对照组相似，也无突
起长出 ；Neuritin 蛋白组的细胞胞体增大，并有较长
较密的突起长出，细胞形态似神经细胞 ；NGF 阳性
对照组的细胞突起比 Neuritin 组更长、更粗、更密，
有些突起交织成网状。
M ：DNA Marker ；1 ：阴性对照（PCR 反应未加模板）；2-5 ：毕
赤酵母重组子
图 3 PCR 鉴定酵母重组子
1 ：表达的蛋白 ；M ：蛋白质 Marker
图 5 Neuritin 的 Western blot 分析
M ：蛋白质 Marker ；1，2 ：纯化前表达产物 ；3 ：纯化后蛋白 ；4 ：洗涤液
图 6 Neuritin 蛋白的纯化
A ：阴性对照（PBS，40×）；B ：阳性对照（NGF，25 ng/mL，
40×）；C ：阴性对照组（6×His，20 μg/mL，40×）；D ：试验
组（Neuritin，20 μg/mL，40×）
图 7 Neuritin 促进 pc12 细胞突起生长
M ：蛋白质 Marker ；1 ：未转化的酵母培养上清（72 h）；2 ：转化空载体的
酵母培养上清（72 h）；3：转化 neuritin- pPIC9K 的酵母诱导前培养上清；4-6：
诱导 24、48、72 h 酵母培养上清
图 4 Neuritin 蛋白的诱导表达
M 2 4 5
bp
250
500
2000
750
1000
1 3
464
bp
10.98
bpbp
18.4
14.4
25.0
66.2
35.0
45.0
464
bp
M 2 4 5 61 3
10.98
kD
1 M
14.4
20.1
66.2
31.0
43.0
10.98
kD
1 2 3 4M
kD
18.4
14.4
25.0
66.2
35.0
45.0
3 讨论
巴斯得毕赤酵母表达系统有胞内表达和分泌表
达两种表达载体，其中分泌型表达载体具有分离纯
化简便、蛋白高级结构形成正确、糖基化完全等优点，
因而得到更广泛的使用。
Neuritin 蛋白有可溶性和以 GPI 形式锚定在细
A B
C D
2.4 Neuritin重组蛋白的纯化和蛋白定量
表达产物经镍柱纯化后，进行 SDS-PAGE 分析，
可见颜色较深的一条带，无其它杂蛋白条带（图 6），
由此推断 Neuritin 蛋白得到有效纯化。Bradford 法测
定纯化后 Neuritin 蛋白浓度为 490 μg/mL。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期152
胞膜上的膜蛋白两种形式。本研究采用毕赤酵母
分泌型表达载体来表达可溶性 Neuritin 蛋白，分子
量约 11 kD，可能在蛋白质的加工修饰过程中，将
Neuritin 蛋白信号肽序列和 GPI 位点剪切掉，形成
10.98 kD 的 Neuritin 蛋白，这与 Neuritin 可溶性蛋白
表达的分子量较一致。
在 Neuritin 蛋白促进 PC12 细胞突起的生长试
验中，Neuritin 蛋白的作用浓度比 NGF 高很多，可
能原因 ：其促进神经突起生长的活性比 NGF 低 ；
Neuritin 蛋白的纯度比商业化的 NGF 低 ；蛋白纯化
技术不成熟，纯化过程中一些 Neuritin 蛋白失活。
接下来要完善纯化技术，并继续探讨其生物学功能。
4 结论
成功构建了 neuritin 的毕赤酵母分泌表达系统。
该酵母重组子中的 neuritin 获得成功表达和纯化，
Neuritin 蛋白能促进 PC12 细胞突起的生长。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）