全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-05-12
基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（30871741, 30972037）
作者简介 ：李玲，女，博士研究生，研究方向 ：食品生物技术；E-mail:liling19820925@163.com
通讯作者 ：朱本忠，男，副教授，博士，研究方向 ：食品生物技术；E-mail:cauzbz@126.com
利用染色质免疫共沉淀技术确定转录因子 RIN
调控的靶基因
李玲1 傅达奇2 朱毅2 田慧琴2 罗云波2 朱本忠2
（1天津农学院食品科学系，天津 300384 ；2中国农业大学食品科学与营养工程学院 食品生物技术实验室，北京 100083）
摘 要: 以粉红期番茄果实为材料，用含不同浓度甲醛的缓冲液交联 DNA 和蛋白质，利用超声波将其染色质随机断裂成大
小为 200-1 000 bp 的片段，用 RIN 蛋白的特异性抗体免疫沉淀与 RIN 蛋白结合的 DNA 片段，然后解交联和纯化 DNA 片段，最
终用普通 PCR 试验和测序验证与转录因子 RIN 结合的 DNA 序列。结果表明，适用于番茄果实的最佳 ChIP 试验条件为 ：用 1% 甲
醛溶液交联 DNA 和蛋白质的复合物 ；用 20% 功率，工作 6 s，间隔 10 s，脉冲 3 次超声破碎该复合物，可以得到适当大小的片段，
用于后续的试验。普通 PCR 和测序验证结果证明转录因子 RIN 与 LeACS2 和 LeACS4 启动子区域的 CArG box 序列结合。
关键词: 染色质免疫共沉淀技术 转录因子 RIN LeACS2 基因 LeACS4 基因 番茄果实
Determining the Target Genes of RIN Transcription Factor by
Chromatin Immunoprecipitation
Li Ling1 Fu Daqi2 Zhu Yi2 Tian Huiqin2 Luo Yunbo2 Zhu Benzhong2
（1Department of Food Science，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384 ；2Food Biotechnology Lab，College of Food Science &
Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）
Abstract: Briefly，tomato tissues were fixed with different concentrations formaldehyde for 10 min（protein to DNA cross-linking），
sonicated to shear the DNA into 200-1 000 bp fragments，and then immunoprecipitated with anti-RIN antibody. After that，DNA fragments
were extracted，purified，and ultimately detected by the general PCR assay and sequencing experiments. The optimal formaldehyde
concentration to achieve efficient and reversible cross-linking turned out to be 1%. After testing various sonication conditions，we used 3 rounds
of 6 seconds each at 20% power，which was sufficient to obtain 200-1 000 bp DNA fragments. The results showed that RIN transcription factor
bound to the CArG box sequences of LeACS2 and LeACS4.
Key words: Chromatin immunoprecipitation RIN transcription factor LeACS2 gene LeACS4 gene Tomato fruit
真核生物基因表达是一个十分复杂而有序的过
程，它是众多反式因子和顺式作用元件相互作用的
结果。研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下的相互
作用是阐明真核基因表达机制的基本途径。MADS
box 转录因子家族具有重要的作用，其 DNA 结合域
有很高的亲和力，能与高度保守的 CArG box 基元结
合 [1]。RIN 蛋白是 MADS box 转录因子家族成员之
一，在系统Ⅰ乙烯和系统Ⅱ乙烯的过渡阶段有极显
著的作用 [2,3]，而且会导致 LeACS4 基因表达量增加 [2]。
2002 年，Vrebalov 等 [4] 指 出 番 茄 ripening-inhibitor
（rin）携带编码 MADS box 转录因子的突变基因，
不能将乙烯信号传递给下游的成熟相关基因，导致
果实不能成熟。此后，确定转录因子 RIN 的调控
途径和其直接靶基因成为特别关注的研究领域。本
实验室之前的研究已经证明，RIN 融合蛋白有很
好的 DNA 结合活性 [5]。Yokotani 等 [6] 指出 RIN 基
因可能在 LeACS2 的转录后调控中发挥作用。Ito
等 [7] 指出 RIN 结合于顺式作用元件 LeACS2。然而，
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RIN 蛋白在番茄体内调控乙烯生物合成的机制仍不
完全清楚。
在 细 胞 核 中， 有 一 种 易 被 碱 性 染 料 染 上 颜
色的物质，称为染色质，它是调节生物体新陈代
谢、遗传和变异的物质基础。真核细胞的染色质
由 4 类分子组成 ：即 DNA、RNA、组蛋白（富含
赖氨酸和精氨酸的低分子量碱性蛋白）和非组蛋
白。DNA 和组蛋白的比例接近于 1 1。染色质是
一种动态结构，其形态随细胞周期不同而发生变
化，进入有丝分裂时，染色质高度螺旋、折叠形
成 凝 集 的 染 色 体。 染色质免疫共沉淀（Chromatin
Immunoprecipitation，ChIP）技术是一种在体内研究
DNA 和蛋白质相互作用的方法。与传统的研究转录
因子和 DNA 相互作用的方法相比，ChIP 的优点在
于能够在体内捕获转录因子和靶基因的相互作用，
能在同时快速地提供一种或者多种基因的调控机制，
所以有巨大的应用价值。近年来，此技术经过不断
发展和完善，被广泛应用于体内转录调控因子与特
定染色质序列之间相互作用等方面的研究，并逐渐
成为染色质水平基因表达调控研究的重要方法。由
于能够灵敏地检测目的蛋白与特异 DNA 片段的结合
情况，因此可以用来研究组蛋白修饰在基因表达中
的作用，是全面阐明真核基因表达调控机制的强有
力的工具。特别是 ChIP 技术与 DNA 芯片和分子克
隆技术相结合，可用于高通量筛选已知蛋白因子的
未知 DNA 靶位点和研究反式作用因子在整个基因组
上的分布情况。该技术在国外已经得到广泛应用，
但在国内还鲜有报道，特别是在使用该技术确定转
录因子 RIN 的调控靶基因方面尚属空白。本研究利
用 ChIP 技术确定了转录因子 RIN 的直接靶基因，以
期揭示 RIN 蛋白调控乙烯生物合成的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
番茄品种为 Lycopersicon esculentum Mill. cv. Ailsa
Craig，由美国番茄种质资源中心（Tomato Genetics
Resource Center）馈赠。番茄在统一的栽培条件下种
植，常规管理，均在花期挂牌，采摘花后 46-48 d
的粉红期番茄果实进行 ChIP 试验。采摘、运输过程
中避免机械伤害，挑选大小均匀，成熟度相对一致，
无病虫害、无机械伤的一批果实作为试验材料。
1.2 方法
1.2.1 染色质免疫共沉淀技术 参照 Upstate 公司
Chromatin Immunoprecipitation Kit 说明书，略有修改。
首先用甲醛在体内固定蛋白质和结合的 DNA。取新
鲜、健康的粉红期番茄果实组织，切成小块，并用
双蒸水漂洗两次；将果实组织浸没于不同甲醛浓度
的 PBS 缓冲液中，真空渗透 10 min，直到组织呈半
透明状；加入终浓度为 0.125 mol/L 的甘氨酸，再渗
透 5 min 以停止交联。弃去缓冲液，用预冷的双蒸
水漂洗果实组织两次，且用液氮速冻。将果实组织
放入预冷的研钵中，加入液氮，用研杵迅速研磨成
粉末。粉末用预冷的 PBS 缓冲液（含蛋白酶抑制剂
Ⅱ）重悬。4℃，2 500 r/min 离心 2-5 min，去掉上清。
用 1 mL SDS 裂解缓冲液（含 5 μL 蛋白酶抑制剂Ⅱ）
重悬。除非特别说明，以下所有步骤均按照说明书
在 4℃下进行。通过超声波处理，将 DNA 剪切成
200-1 000 bp 大小的片段，离心。上清液用 ChIP 稀
释缓冲液稀释，并用蛋白 G 琼脂糖清洁，以降低非
特异性背景。样品用相应的抗体进行免疫沉淀反应，
于 4℃摇动过夜。复合物用蛋白 G 琼脂糖悬浮液收集；
然后用试剂盒提供的低盐、高盐、LiCl 洗脱缓冲液
洗一次，再用 TE 缓冲液洗两次。免疫沉淀的染色质
用新配制的洗脱缓冲液洗去蛋白 G。蛋白质和 DNA
的交联复合物经过处理解交联，并用蛋白酶 K 消化，
以从 DNA 中除去蛋白质。之后用试剂盒提供的纯化
柱纯化 DNA。取适量纯化后的 DNA 样品（ChIP 和
Input）作为模板，进行 PCR 检测。PCR 反应完毕后，
用 2% 琼脂糖凝胶电泳观察结果。最后将 PCR 产物
进行测序，进一步验证 ChIP 的试验结果。
1.2.2 PCR 产物序列测定及分析 对 DNA 样品的普
通 PCR 产物进行测序，序列测定工作由上海生工生
物技术公司完成，用 DNAMAN（版本 4.0）软件分
析测序结果。
2 结果
2.1 染色质免疫共沉淀技术甲醛浓度的确定
番茄果实组织用不同浓度的甲醛溶液进行真
空渗透，直到果肉组织呈现半透明状。因为只有未
与蛋白质交联的 DNA 能被提取出来，所以用苯酚提
李玲等 ：利用染色质免疫共沉淀技术确定转录因子 RIN 调控的靶基因
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取的方法来评价 DNA 和蛋白质的交联效率。用含有
不同甲醛浓度的缓冲液真空渗透新鲜番茄果实组织
后，用酚仿提取解交联之前和解交联之后的 DNA，
结果（图 1）显示，甲醛浓度为 0% 和 0.5% 时，不
能使 DNA 与蛋白质充分交联；甲醛浓度为 3% 和 5%
时，DNA 和蛋白质的复合物不能充分解交联 ；能达
到交联效率且保证解交联的最佳甲醛浓度是 1%。
的片段大小也没有达到后续试验的要求。而用 20%
功率，工作 6 s，间隔 10 s，脉冲 3 次，能够得到
200-1 000 bp 大小的 DNA 片段，可以用于后续的试验。
2.3 转录因子RIN体内靶基因的分析
2.3.1 免疫沉淀的 DNA 样品的普通 PCR 检测 以
粉红期番茄果实为材料，用 1% 甲醛在体内交联
DNA 和蛋白质。DNA 和蛋白质的复合物用 RIN 蛋
白的特异性抗体和 IgG 抗体（阴性对照）沉淀，沉
淀的 DNA 样品用特定的引物进行 PCR 扩增，且以
LeActin 作为对照。应注意，一定要在相应基因启动
子区域的 CArG box 基元附近设计引物，引物序列如
表 1 所示。
基因名称 引物名称 引物序列（5-3）
LeACS2
CPACS2F AATTCTTTACGCAATCTTACTAAAT
CPACS2R ACCCTTACATCATTTATTATTACAA
LeACS4
CPACS4F TCACAATTCAATAGTTACAGTTCAT
CPACS4R TCAACAAGTACATGGACTATGAGTG
LeACO1
CPACO1F GGTCCTAACAGAGTTCGATGGGTTG
CPACO1R TTAGGACACTTTGACTGGGATGT
LeActin
CPActinF CTTGACTATGAACAGGAACTCGAGA
CPActinR GCAGTAATTTCTTTGCTCATTCTAT
表 1 普通 PCR 验证使用的引物序列
M. DL15000 Marker; -. 解交联之前的 DNA; +. 解交联之后的 DNA
图 1 染色质免疫共沉淀技术的交联效率分析
2.2 染色质免疫共沉淀技术超声波条件的确定
在番茄体内用甲醛固定 DNA 和蛋白质复合物
之后，需要用超声波的手段将其随机切断为一定长
度范围内的染色质小片段（200-1 000 bp），结果如
图 2 所示。按图 2-A 的超声波条件，将样品超声波
之后，得到的片段大于 2 000 bp，没有达到要求。
按图 2-C 的超声波条件，将样品超声波之后，得到
A,B,C. 样品在 10%、20%、25% 功率条件下超声之后的结果 , 均为工作 6 s，
间隔 10 s，脉冲 3 次 ;1. 未超声的样品 ；2. 超声之后的样品 ；M.DL2000
Marker
图 2 染色质免疫共沉淀技术的超声处理效率分析
图 3 结果显示，当用 IgG 抗体沉淀 DNA 和蛋
白质的复合物时，均未扩增出 LeACS2、LeACS4、
LeACO1 和 LeActin 基因的 PCR 产物。当用 RIN 蛋
A 顺式作用元件 LeACS4 的 ChIP PCR 分析 ；B 顺式作用元件 LeACS2 的
ChIP PCR 分析 ；C 顺式作用元件 LeACO1 的 ChIP PCR 分析 ；M.DL2000
Marker ；1.Input ；2.Blank ；3.IgG ；4.ChIP
图 3 RIN 蛋白与乙烯生物合成相关基因启动子片段的
体内结合能力分析
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白的特异性抗体沉淀 DNA 和蛋白质的复合物时，在
ChIP 样品中扩增出了 LeACS2 和 LeACS4 条带（图
3-A、B，泳道 4）。对照试验表明，LeActin 序列没
有在免疫沉淀复合物中扩增出来，但是在 Input 样品
中与 LeACS2 和 LeACS4 基因序列一样，是存在的。
结果说明 LeACS2 和 LeACS4 基因的启动子序列通过
免疫共沉淀得到了富集，RIN 蛋白在体内与 LeACS2
和 LeACS4 启动子区域上的 CArG box 结合。
2.3.2 免疫沉淀的 DNA 样品的普通 PCR 产物测序
分析 将图 3 中免疫沉淀的 DNA 样品的普通 PCR
产物进行测序。利用生物软件 DNAMAN 将测序结果
与已发表的 LeACS2（X59139）和 LeACS4（M88487）
启动子序列进行比对。结果（图 4）所示，PCR 产
物的序列与 LeACS2 和 LeACS4 启动子部分序列完全
一致，进一步证实 RIN 转录因子在体内与 LeACS2
和 LeACS4 启动子片段结合。
A.LeACS2 基因 ChIP PCR 产物与 LeACS2 基因（X59139）启动子区域核苷酸序列比对 ；
B.LeACS4 基因 ChIP PCR 产物与 LeACS4 基因（M88487）启动子区域核苷酸序列比对
图 4 ChIP PCR 产物测序结果序列比对
3 讨论
传统研究蛋白质与 DNA 相互作用的方法是凝
胶阻滞试验（EMSA）。高等生物的基因组 DNA 与
DNA 上的结合蛋白共同组成染色质结构，用 EMSA
得到的某段 DNA 与蛋白质相互作用的结果，在体内
则很可能由于染色质高级结构的存在而使 DNA 与蛋
白质难以接近。因此，在生理状态下，这段 DNA 很
可能并不与其相对应的因子结合，是没有功能的。
另外，染色质结构本身是动态的，DNA 与非组蛋白
在生理状态下的相互作用通常是瞬时的，EMSA 难
以捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事
件。所以，EMSA 不足以充分反映生理条件下 DNA
与蛋白质相互作用的真实情况。而染色质免疫共沉
淀技术则可以找出在生理条件下某个 DNA 结合蛋白
与 DNA 序列的结合位点，能够真实反映体内基因表
达调控的情况 [8]。
本研究采用染色质免疫共沉淀技术在体内检测
RIN 蛋白与乙烯生物合成相关基因启动子的结合能
力。植物细胞和动物细胞的结构不同，植物细胞有
严格的细胞壁，高水平的纤维素和木质素、大液泡，
这致使不能将动物细胞的 ChIP 技术直接应用于植物
细胞。因此，需要对番茄果实组织的染色质免疫共
沉淀试验条件进行优化。首先要使用真空渗透的方
法，以确保 DNA 和蛋白质交联溶液渗入植物细胞。
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正如 Das 等 [9] 所强调的，甲醛交联使 DNA 与蛋白
质形成复合物的步骤是非常重要的。结果显示，最
佳的甲醛浓度是 1%。当甲醛浓度更高时反而不起作
用，这可能是因为高浓度的甲醛不能很好地解交联
或者抑制了叶绿体的降解，导致与叶绿体连在一起
的细胞核中的染色质难以纯化 [10]。最佳超声波条件
是 20% 功率，工作 6 s，间隔 10 s，脉冲 3 次。可以
根据 ChIP 技术的使用目的，选择不同的平均片段大
小。例如，大片段（1 000-2 000 bp）推荐用于克隆，
小片段建议用于高分辨率的组蛋白修饰图谱研究 [11]。
染色质免疫共沉淀试验结果证实 RIN 蛋白在体内与
LeACS2 和 LeACS4 启动子区域上的 CArG box 结合。
RIN 融合蛋白没有体内结合 LeACO1 启动子的能力，
原因之一可能是转录因子 LeHB-1 在番茄果实体内
结合 LeACO1 启动子片段 [12]。总之，以上结果说明
RIN 蛋白在番茄果实乙烯生物合成过程中有重要作
用，LeACS2 和 LeACS4 是转录因子 RIN 直接结合的
靶基因。这个结果为阐明转录因子 RIN 的作用机理
奠定了理论基础。
4 结论
适用于番茄果实的最佳染色质免疫共沉淀试验
条件为用 1% 甲醛溶液交联 DNA 和蛋白质的复合
物用 20% 功率，工作 6 s，间隔 10 s，脉冲 3 次超
声破碎该复合物，能够得到适当大小的片段。转录
因子 RIN 与 LeACS2 和 LeACS4 启动子区域的 CArG
box 序列结合，且在番茄果实的成熟过程中发挥重
要作用。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）