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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
吡咯喹啉醌（PQQ）是一种阴离子水溶性醌
类化合物，是葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的辅酶。
PQQ 于 20 世纪 60 年代被发现，1979 年被 Durine 分
离得到，随后 Salishuryt 通过 X 线衍射技术阐明这种
化合物的结构并命名［1］。2004 年 Kay 等［2］人利用
电子顺磁共振法对绿脓假单胞菌所产生的乙醇脱氢
酶辅基 PQQ 的原子结构进行了鉴定。PQQ 有多种生
理功能，它能够抑制过氧硝酸盐的表达，防止龋齿
类动物中风 ，刺激神经生长因子生成、参与醌蛋白
酶电子传递、增强微生物对极端环境的适应力以及
促进植物的生长［3-5］，使其在食品业、轻工业、农
收稿日期 ：2012-10-31
作者简介 ：徐文，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物系统学及多样性 ; E-mail:ydk19870705@163.com
通讯作者 ：张利平，教授，博士生导师，研究方向 ：微生物系统学、资源保护与利用及微生物遗传育种 ; E-mail: zhlping@hbu.edu.cn
业和医药等方面具有重要的开发前景。目前 PQQ 造
价昂贵，化学合成方法步骤繁杂，产率低，副产物多，
污染严重，后续处理困难。而微生物发酵法以甲醇
为唯一碳源，培养基以无机化合物为主，这有利于
产品的提取，所需成本低，国外也有报道有人曾利
用生丝微菌生产 PQQ，所以发酵法生产 PQQ 在实际
产业化中具有重要意义［6-8］。黏细菌是一类可滑行
的革兰氏阴性杆菌，虎杖内生细菌多样性丰富，根
据已有的报道，PQQ 产生菌多为革兰氏阴性细菌［6］。
本研究从 160 株虎杖内生细菌和黏细菌中共筛选到
4 株甲基利用型 PQQ 产生菌，编号分别为 083114、
甲醇利用型吡咯喹啉醌产生菌的筛选及鉴定
徐文  许然  张利平
（河北大学生命科学学院 河北省微生物多样性研究与应用重点实验室，保定 071002）
摘 要 ： 从虎杖内生细菌和黏细菌中筛选吡咯喹啉醌（PQQ）产生菌。采用 3 种以甲醇为唯一碳源的培养基对 160 株供试
菌株进行摇瓶培养发酵，发酵产物采用光谱学分析法及 HPLC 法筛选。结果显示，通过初筛和复筛共得到甲醇利用型菌 134 株，
PQQ 产生菌 4 株，其中菌株 083114 的 PQQ 产量为 64.34 mg/L。菌株 083114 的 16S rRNA 基因序列分析结果显示，其序列与酸快生
芽孢杆菌（Bacillus acidiceler）的系统发育关系最近。虎杖内生细菌及黏细菌中存在 PQQ 产生菌。
关键词 ： 甲醇利用型菌 吡咯喹啉醌 内生细菌 黏细菌 光谱法
Isolation and Identification of PQQ Producing Strains Using
Methanol-utilizing Bacteria
Xu Wen Xu Ran Zhang Liping
（Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province，College of Life Sciences，Hebei University，
Baoding 071002）
Abstract:  The aim was to isolate Pyrroloquinoline quinine producing strains from endophytic bacteria of Polygonum cuspidatum
and strains of myxobacteria. Three kinds of media with methanol as single carbon source were used for microbial fermentation of the strains.
Spectroscopy and HPLC analysis of the fermentation product were performed. Through preliminary screening and complex screening we got 134
strains of methanol-utilizing and 4 strains of Pyrroloquinoline quinine producing. The Pyrroloquinoline quinine producing strain 083114 was
determined to be 64.34 mg/L. The 16S rRNA sequence analysis showed that the phylogenetic relationship between strain 083114 and Bacillus
acidiceler is the most similar. Therefore, it proved that Pyrroloquinoline quinine producing bacteria were in endophytic bacteria of Polygonum
cuspidatum and myxobacteria.
Key words:  Methanol-utilizing bacteria Pyrroloquinoline quinine Endophytic bacteria Myxobacteria Spectroscopy
2013年第1期 163徐文等 ：甲醇利用型吡咯喹啉醌产生菌的筛选及鉴定
083129、95001 和 95032，分别对其 PQQ 产量进行
测定，对其同源性进行分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 虎杖内生细菌 100 株和黏细菌 60
株，均为本实验室分离获得并保藏。
1.1.2 培养基（1）完全培养基 ：蛋白胨 10 g/L，牛
肉膏 3 g/L，NaCl 5 g/L，pH7.0。（ 2）基本培养基 ：
（NH4） 2HPO4 3 g/L，K2HPO4 2 g/L，NaCl l g/L，烟酸
20 μg/L，VBl 10 μg/L，VB2 20 μg/L，泛酸钙 20 μg/L，
吡哆醇 20 μg/L，生物素 10 μg/L，对氨基苯甲酸 10
μg/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，FeS04·7H2O 10 mg/L，
MnSO4·H2O 5 mg/L。（3）MPQ 培 养 基 ：MgSO4 1.5
g/L，（NH4） 2SO4 3 g/L，KH2PO4 1.4 g/L，Na2HPO4 3 g/L，
柠檬酸铁 30 mg/L，CaCl2·2H2O 30 mg/L，MnCl2·4
H2O 0.5 mg/L，ZnSO4 ·7H2O 5 mg/L，CuSO4· 5H2O 0.5
mg/L。
1.1.3 主要仪器和试剂 HPLC 为 HITACHI L-2455 ；
Thermo ODS 反 相 C18 分 析 柱（5 μm，4.6 mm×250
mm）；PQQ 标准品系 Sigma 公司产品（>98.6），其
他均为市售生化试剂。
1.2 方法
1.2.1 PQQ 产生菌的初筛 将供试菌株分别接种于
装有 10 mL 1% 无水甲醇的完全培养基和 1% 无水甲
醇的基本培养基的 50 mL 发酵管中，28℃、180 r/min
摇床培养 7 d，观察菌体生长情况，选择发酵液颜色
由清澈变为红色的菌株。
1.2.2 发酵液中 PQQ 的提取 挑取初筛获得的菌株
的单菌落，接入装有 10 mL MPQ 培养基的发酵管中，
28℃、180 r/min 振荡培养 72 h，然后将全部培养
液倒入装有 50 mL MPQ 培养基的三角瓶中，28℃、
180 r/min 振荡培养 7 d。
真空抽滤器抽滤去菌体，上清液中加入 3 倍体
积的无水甲醇过夜，10 000 r/min 离心 20 min 取上清，
pH 调至 3.5。
1.2.3 PQQ 的光谱法分析 参照杨延新的方法［9］，
将 PQQ 产物分别加入石英和玻璃比色杯中进行紫外
扫描，以 MPQ 培养基加入 3 倍体积甲醇液为对照，
记录 D326nm 和 D400nm 值，计算 OD326nm-OD400nm 值用以
检测 PQQ 含量。
1.2.4 PQQ 的 HPLC 分析条件 流动相 ：甲醇∶水
为 80∶20 ；流速 ：0.5 mL/min ；检测波长 ：213 nm ；
柱温 ：29℃ ；进样量 ：10 μL。
1.2.5 PQQ 产生菌的鉴定 虎杖内生细菌培养 36 h
后进行革兰氏染色并观察菌体形态。黏细菌培养 36
h 后，于解剖镜观察子实体形态，每隔 24 h 观察一次。
菌株的 16S rRNA 基因序列测定参照文献［10］
进行。使用细菌通用引物 27f（5-AGAGTTTGATCC-
TGGCTCAG-3）和 1525r（5- AGAAAGGAGGTGAT-
CCAGCC-3），PCR 扩增产物使用 1％琼脂糖凝胶电
泳检测，PCR 扩增产物由北京三博生物技术公司测
序。根据测序结果，使用 MEGA 软件（Version 5.05）
及 Neighbor joining（NJ）法构建系统发育进化树。
2 结果
2.1 PQQ产生菌的初筛
从 160 株供试菌株中初筛获得 16 株发酵后培养
液变为红色的的菌株，其中虎杖内生细菌 10 株，其
编号为 083113、083114、083129、083142、083153、
091417、091421、091423、091424 和 092610。黏细
菌 6 株， 其 编 号 为 95001、95011、95032、95041、
95046 和 95047。
2.2 PQQ的光谱法分析
光 谱 学 分 析 法 通 过 计 算 OD326nm-OD400nm 值 用
以 检 测 PQQ 含 量， 菌 株 091417 和 菌 株 091423 的
OD326nm-OD400nm 为 负 值， 说 明 此 2 株 菌 株 不 产 生
PQQ（表 1），选择 OD326nm-OD400nm 值大于 0 的 14 株
菌进行 HPLC 色谱分析。
2.3 PQQ的HPLC定量分析
通过 HPLC 分析，样品色谱峰的保留时间与标
准品相同，通过色谱峰面积进行了定量分析（图 1）。
结果共筛选得到甲基利用型 PQQ 产生菌 4 株，编号
分 别 为 083114、083129、95001 和 95032， 通 过 对
色谱峰面积的定量分析其 PQQ 产量分别为 64.340、
3.344、4.427 和 8.342 mg/L。
2.4 PQQ产生菌的鉴定
2.4.1 形态学观察 菌株 95001 分离自福州圆柏树
叶，其子实体在树叶基质上为球形，暗红色，表面
干燥，无折光性。CAS 液体发酵液中，菌体为圆球形，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期164
沿壁生长，产红棕色色素。
菌株 95032 分离自福州假苹婆树皮，其子实体
在树皮基质上为椭球形，顶端尖，略带亮黄色，基
部土黄色，发暗。CAS 液体发酵液中，菌体呈絮状，
沿壁生长，产黄色色素。
菌株 083114 革兰氏阳性，菌体细胞杆状，芽孢
椭圆形，近末端，菌落透明，表面光滑透亮，边缘
整齐。
菌株 083129 革兰氏阴性，短杆菌，不形成芽孢，
菌落半透明，光滑湿润，圆形边缘整齐。
2.4.2 PQQ 产生菌 16S rRNA 的系统发育分析 采
用 PCR 技术扩增 4 株 PQQ 产生菌的 16S rRNA 基因
序列，经北京三博远志生物技术有限公司测序。通
过在 GenBank 中进行同源性序列搜索及比对，从中
选取同源性较高菌株的 16S rRNA 基因序列构建系统
表 1 16 株供试菌株的光谱法分析测定结果
菌株编号 OD326nm OD400nm OD326nm-OD400nm
95001 0.074 4 0.019 5 0.054 9
95011 0.071 6 0.046 6 0.025 0
95032 0.106 9 0.091 4 0.015 5
95041 0.073 3 0.044 3 0.029 0
95046 0.565 3 0.309 4 0.255 9
95047 0.154 3 0.066 4 0.087 9
083113 0.297 8 0.170 5 0.127 3
083114 0.401 9 0.232 5 0.169 4
083129 0.509 4 0.326 1 0.183 3
083142 0.067 8 0.014 5 0.053 3
083153 0.047 5 0.034 8 0.012 7
091417 0.072 7 0.099 0 ——
091421 0.178 7 0.079 5 0.099 2
091423 0.089 8 0.096 4 ——
091424 0.218 4 0.128 6 0.090 1
092610 0.072 4 0.048 9 0.023 5
A ：PQQ 标准品 ； B ：083114 产物 ； C ：95032 产物
图 1 产物的 HPLC 分析结果
进化树。结果（图 2）显示 083114 为芽孢杆菌（Baci-
llus. sp），083129 为 无 色 杆 菌（Achromobacter. sp），
95001 和 95032 均为黏球菌（Myxococcus. spp）。
3 讨论
本研究从 160 株供试菌株中筛选得到 134 株甲
醇利用型菌和 4 株 PQQ 产生菌，其中菌株 95032 的
PQQ 产量为 8.342 mg/L ，菌株 083114 的 PQQ 产量
甚至高达 64.34 mg/L，远远高出已报道的野生菌的
PQQ 产量，且这一结果是野生菌未经诱变选育且未
进行发酵条件优化得到的。培养条件对 PQQ 的产量
影响甚大，如某些微量元素和甲醇的含量等对 PQQ
生物合成具有显著影响［6］。可以预见，发酵条件经
适当优化或对此两株菌进行遗传改造其 PQQ 产量也
会相应提高。
已报道的可产生 PQQ 的微生物种属包括副球菌
属（Paracoccus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、无色
杆菌属（Achromobacter）、甲烷单胞菌属（Methano-
monas）、甲基芽孢杆菌属（Methylobacillus）、等［11］，
国内外尚未见有关黏球菌属（Myxococcus）产生 PQQ
的报道。
根据以往的报道，PQQ 高产菌株多为革兰氏阴
性菌株，一般情况下，野生菌的 PQQ 产量多为 2-3
mg/L［6］，而本研究筛选到的可产生 64.34 mg/L PQQ
的野生型菌株 083114，与革兰氏阳性细菌酸快生芽
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
0 5 10 20 302515؍⮉ᰦ䰤min 0 5 10 20 302515؍⮉ᰦ䰤min 0 5 10 20 30 4025 3515؍⮉ᰦ䰤min
੨ݹ
٬
੨ݹ
٬
੨ݹ
٬
0.4
0.040
0.030
0.020
0.010
0.000
0.005
0.015
0.025
0.035
0.3
0.2
0.1
0.0
5.
07 6.
05 6.
06
5.
47
4.
66 6
.1
8
5.
61
6.
21
5.
40
8.
20
9.
22
12
.2
3
7.
65 8.
22
A B C
2013年第1期 165徐文等 ：甲醇利用型吡咯喹啉醌产生菌的筛选及鉴定
孢杆菌的系统发育关系最近。菌株 95032 在发酵过
程中多糖产量高达 0.3 g/L，菌株 95001 的多糖甚至
高达 0.8 g/L，在发酵液离心过程中会有部分 PQQ 被
多糖沉淀包裹而损失，这一特性阻碍了 PQQ 的提取
和纯化及 PQQ 产量测定。可以推测，多糖被有效去
除菌株 95032 和 95001 的 PQQ 产量会相应提高。
4 结论
从 160 株虎杖内生细菌和黏细菌中筛选到 4 株
PQQ 产生菌，分别属于芽孢杆菌、无色杆菌和黏球菌。
其中芽孢杆菌 083114 的 PQQ 产量高达 64.34 mg/L。
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（责任编辑 李楠）
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Achromobacter sp.083129
Achromobacter xylosoxidansDSM 10346TDSM 10346T
Achromobacter insolitusAY170847TT
Achromobacter piechaudiiAB010841T
Achromobacter marplatensisB2 EU150134T
Bacillus sp.083114
Bacillus acidicelerCBD 119T
Bacillus anthracisATCC 14578T
Bacillus thuringiensisIAM 12077T
Bacillus zhanjiangensisJSM 099021T
Bacillus subtilisDSM10T
Myxococcus sp.95032
Myxococcus sp.95001
Myxococcusf lavescensNBRC 100081T
Myxococcus virescensDSM 2260T
Myxococcus xanthusATCC 25232T
Myxococcus fulvusATCC 25199T
Escherichia coli ATCC11775T
图 2 基于 16S rRNA 序列分析所构建的 PQQ 产生菌的系统发育树