全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
肝素是一种含硫酸酯的黏多糖，产生于哺乳动
物细胞表面，属不均一的多糖分子。早在 20 世纪
40 年代初，西方研究人员既已发现肝素具有很强的
抗凝血作用。除此之外，肝素还具有降血脂、抗炎、
抗肿瘤、抑制细菌黏附等作用［1-3］，是重要的糖胺
聚糖类生化药物之一。肝素类抗血栓药物在治疗心
脑血管疾病时具有诸多优点，但同样存在诸如血小
板减少症、骨质疏松、高血钾症等严重副作用及生
物污染的风险。作为临床上用量最大的抗凝血药，
肝素的大量应用使得其产量低的问题日益突出。因
此，世界各国正在努力寻求一种合成具有生物活性
人工肝素的方法，以取代目前所使用的天然肝素。
目前肝素的获得主要有 3 种途径 ：从猪的肠黏
膜中分离提取得到天然肝素，该方法是目前肝素药
收稿日期 : 2012-02-23
作者简介 : 陕婧婧 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 微生物遗传教育 ; E-mail: shanjingjing372@163.com
通讯作者 : 许正宏 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 发酵工程 , 微生物与生化药学 ; E-mail: zhenghxu@163.com
硫酸乙酰肝素 3-O硫酸基转移酶 5的表达、
纯化及酶学性质研究
陕婧婧1 窦文芳2 李会2 张旦旦2 许泓瑜2 陈敬华2 许正宏1，2
（1 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122 ；2 江南大学医药学院制药工程研究室，无锡 214122 ）
摘 要： 经过 PCR克隆得到硫酸乙酰肝素 3-O硫酸基转移酶 5（3-OST-5）的基因，将其与大肠杆菌表达载体 pET-15b连
接后，在大肠杆菌 BL21（DE3）中诱导表达，使用镍亲和层析柱纯化得到具有活性的 3-OST-5。经测定纯化后的 3-OST-5比活达
到 0.58 U/mg，是纯化前的 5.27倍，回收率达 80.4%。在此基础上，研究了该酶的酶学性质，酶反应的最适温度为 35℃，稳定范
围为 20-40℃ ；最适 pH为 7.0，在 pH7.0-9.0范围内稳定。在反应液中加入终浓度为 1 mmol/L的 K+、Ca2+、Ba2+对酶促反应有一
定的促进作用。
关键词： 硫酸乙酰肝素 3-O硫酸基转移酶 5 表达 纯化 酶学性质
Expression，Purification and Enzymatic Characterization of Heparan
Sulfate 3-O Sulfotransferase 5
Shan Jingjing1 Dou Wenfang2 Li Hui2 Zhang Dandan2 Xu Hongyu2 Chen Jinghua2 Xu Zhenghong1， 2
（1 The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122；2Laboratry of
Pharmaceutical Engineering，School of Medicine and Pharmaceutics，Wuxi 214122）
Abstract: The heparan sulfate 3-O sulfotransferase 5（3-OST-5） gene was amplified, and inserted into expression vector pET-15b, and
then the plasmid pET15b/3-OST-5 was constructed and transformed into Escherichia coli BL21 （DE3）. SDS-PAGE showed that the gene 3-OST-5
was expressed successfully in recombinant E. coli BL21. Then 3-OST-5 was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The results showed
a single band about 31 kD on SDS-PAGE gel, and the specified activity was about 0.58 U/mg. The specified activity of 3-OST-5 is 5.27-fold
higher than that of unpurified and the activity recovery is 80.4%. The optimum reaction temperature was 35℃, and the 3-OST-5 was more stable
on the temperature of 20-40℃. The optimum reaction pH was 7.0, and the 3-OST-5 activity have little changed when incubated in the buffer of
pH7.0-9.0. The addition of K+, Ca2+, Ba2+ with the final concentration of 1 mmol/L in the reaction solution plays a certain role in promoting the
enzymatic reaction.
Key words: Heparan sulfate 3-O sulfotransferase 5 Expression Purification Enzymatic characterization
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期102
物的主要来源，但是产量低而且产物含大量杂质 ；
通过化学合成获得肝素，合成步骤繁多，产率低，
成本高昂，并且现阶段基本不可能合成分子量较大
的寡糖及多糖；通过酶法催化合成低分子量肝素［4-7］，
在保留了普通肝素抗血栓形成等功能的同时，避免
了天然肝素的不良作用，但是合成前体和酶的产量
制约了合成规模。本研究中的硫酸乙酰肝素 3-O 硫
酸基转移酶 5（3-OST-5）催化硫酸基从磺基供体转
移到葡糖胺单元的 3-OH 位置，从而生成同时具有
抗凝血活性和单胞疱疹病毒识别结合活性的多糖分
子［7-9］。作为催化肝素合成过程中的关键酶，其表
达和活性高低变得尤为重要。
本研究克隆了 3-OST-5 基因，将其连接到大肠
杆菌表达载体 pET-15b 上，在大肠杆菌 BL21（DE3）
中诱导表达后，利用镍亲和层析柱纯化得到具有活
性的 3-OST-5，并对其酶学性质进行初步研究，旨在
为酶法合成低分子量肝素奠定一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒载体 大肠杆菌（Escherichia coli）
JM109、BL21（DE3）、表达载体 pET-15b 为本实验
室保藏。重组质粒 pMD19-T/3-OST-5 由陈敬华教授
惠赠。
1.1.2 酶、引物和主要试剂 扩增硫酸乙酰肝素 3-
OST-5 基因的引物 （表 1） 由上海捷瑞生物工程有限
公司合成，其上下游引物分别加入 Nde I 和 BamH I
酶切位点（下划线标示）。限制性内切酶、T4 DNA 连
接酶、Taq 酶等分子生物学工具酶均购自宝生物工程
（大连）有限公司。PCR 产物纯化试剂盒、质粒提
取试剂盒、IPTG 等购自上海生工生物技术有限公司。
镍 NTA 琼脂糖凝胶 FF 购自北京韦氏博慧色谱科技
公司。其他化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 硫酸乙酰肝素 3-OST-5 基因表达载体的构
建 提 取 质 粒 pMD19-T/3-OST-5， 以 pMD19-T/3-
OST-5 为模板扩增硫酸乙酰肝素 3-O 硫酸基转移酶 5
基因。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收、纯
化后用 Nde I 和 BamH I 双酶切修饰，用 T4 DNA 连
接酶连接到同样经过 Nde I 和 BamH I 双酶切的 pET-
15b 质粒上。构建重组表达载体 pET-15b/3-OST-5。
重组质粒通过热激法转化大肠杆菌 BL21（DE3）后，
筛选阳性转化子。经 PCR 和双酶切鉴定后，送至上
海 Generay 公司进行测序。
1.2.2 重组蛋白 3-OST-5 在大肠杆菌 BL21（DE3）
中的表达及条件优化 挑取阳性转化子 BL21
（DE3）/pET15b/3-OST-5 在液体 LB 培养基中活化过
夜后，接种至含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的培养基
中，37℃培养至 OD600=1.0 时，加入诱导剂 IPTG，
使其终浓度达到 0.5 mmol/L，20℃诱导表达 5 h。通
过 SDS-PAGE 验证表达产物。
1.2.3 重组蛋白 3-OST-5 的纯化［10］ 取 IPTG 诱导
的发酵液 1 L，4℃条件下 8 000 r/min 离心 15 min 收
集菌体，冰浴超声破碎，功率 300 W，工作 3 s 间歇
9.9 s 超声 50 min，镜检检验破碎是否完全。利用镍
NTA 琼脂糖凝胶柱纯化目的蛋白，使用不同浓度的
咪唑梯度洗脱，具体操作参照其说明书，纯化后的
蛋白进行 15% SDS-PAGE 分析，确定洗脱液中咪唑
的最佳浓度并测定纯化效率。
1.2.4 蛋白质含量测定 蛋白质含量的测定采用
Bradford 法［11］，以牛血清白蛋白为标准蛋白绘制标
准曲线。待测样品稀释至合适浓度后，通过线性回
归曲线计算实际样品中蛋白质含量。
1.2.5 3-OST-5 的活性检测 AST-IV 和 OST 催化的
两个酶促反应可以通过硫酸基供体 PAPS 再生体系
偶联到一起［12］，即 AST-IV 催化 PAP 得到硫酸基团
从而生成 PAPS，同时催化 PNPS 失去硫酸集团生成
PNP ；3-OST-5 催化转移 PAPS 上的硫酸基团到多糖
的 3-OH 上，从而产生 3-O 硫酸化的多糖及硫酸基
受体 PAP。通过检测体系中 PNP 的生成量和增量来
分别计算 AST-IV 和 3-OST-5 的酶活性［13］。
本试验中 AST-IV 的一个酶活力单位定义为在最
表 1 克隆 3-OST-5基因的引物
引物 序列（5-3）
上游引物 CGGCCATATGAAAAGAATGCAGCAGCTCCCCAAG
下游引物 GGATCCTTAGGGCCAGTTC
1.1.3 培养基及培养条件 LB 培养基，培养温度
37℃，摇床转速 200 r/min，氨苄青霉素浓度 100
μg/mL，IPTG 终浓度为 0.5 mmol/L。
2012年第8期 103陕婧婧等 ：硫酸乙酰肝素 3-O 硫酸基转移酶 5 的表达、纯化及酶学性质研究
适条件下，在 1 min 内能转化 1 μmol 硫酸基所需要
的酶量。3-OST-5 的一个酶活力单位定义为在最适条
件下，在 1 min 内比空白对照多转化 1 μmol 硫酸基
团所需要的酶量。
1.2.6 酶学性质测定［14，15］
1.2.6.1 最适温度及温度稳定性 采用pH7.0的反应
缓冲液，分别在 20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、
45℃、50℃、55℃和 60℃温度下测定 3-OST-5 的酶
活，研究温度对酶促反应的影响。将纯化后的3-OST-5
酶液分别在 20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下放置
2 h，取样测定剩余酶活，观察 3-OST-5 在不同温度
下的稳定性。
1.2.6.2 最适 pH 及 pH 稳定性 配制 pH4.0-9.0 的
反应缓冲液，在 30℃下将酶液分别与不同 pH 的反
应液混合，测定 3-OST-5 在不同 pH 反应体系下的酶
活，以观察 pH 对酶促反应的影响。将纯化后的酶
液分别加入到不同 pH 的反应体系中，30℃保温 2 h，
测定剩余酶活，观察 3-OST-5 在不同 pH 条件下的稳
定性。
1.2.6.3 不同金属离子对酶活的影响 在反应液中
分别加入终浓度为 1 mmol/L 的 K+、Ca2+、Na+、Mg2+、
Al3+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Ba2+、Mn2+，30℃下测
定 3-OST-5 的酶活，以不加金属离子的反应液作为
对照，研究不同金属离子对其酶促反应的影响。
以上试验平行重复3次，误差范围在±8%之间。
2 结果
2.1 重组大肠杆菌表达载体的构建
提取质粒 pMD19-T/3-OST-5，以 pMD19-T/3-OST-
5 为模板扩增得到硫酸乙酰肝素 3-OST-5 基因。PCR
产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收后用 Nde I 和
BamH I 双酶切修饰，将其与同样经过双酶切的 pET-
15b 载体连接，构建重组表达质粒 pET-15b/3-OST-5。
重组质粒经 Nde I 和 BamH I 双酶切，得到 5 696 bp
和 783 bp 两个片段，分别对应于 pET-15b 和 3-OST-5
基因的大小（图 1），且测序结果也表明重组质粒构
建成功，将其命名为 pET15b/3-OST-5。
2.2 重组蛋白 3-OST-5在大肠杆菌BL21（DE3）中的
诱导表达及纯化
将重组质粒 pET15b/3-OST-5 通过热激法转化大
图 1 质粒 pET15b/3-OST-5的双酶切验证
1. 重组质粒 pET15b/3-OST-5 ；2. 经 BamH I 酶切的质粒 pET15b/3-
OST-5 ；3. 经 Nde I 酶切的质粒 pET15b/3-OST-5 ；4, 5. 经 BamH I 和
Nde I 双酶切的质粒 pET15b/3-OST-5 ；M. DL5000 DNA Marker
肠杆菌 BL21（DE3），利用 Amp 抗性在 LB 平板上
筛选阳性转化子 BL21/pET15b/3-OST-5。IPTG 诱导
后的发酵液离心得到菌体，用 PBS 缓冲液重悬菌体，
然后超声破碎细胞，上清液进行 SDS-PAGE 分析，
观察到一条分子量约为 31 kD 的特异性条带（图 2），
这与报道的目标蛋白大小一致［6］。测得上清液的酶
活为 15.6 U/mg，表明 3-OST-5 基因在大肠杆菌中得
到表达，并且所表达的酶蛋白具有生物学活性。
M. 蛋白 Marker ；1. E.coli BL21/pET15b 超声破碎后的的上清液 ；
2. E. coli BL21/pET15b/3-OST-5 超声破碎后的的上清液
图 2 重组大肠杆菌 BL21/pET15b/3-OST-5全细胞
蛋白 SDS-PAGE电泳图
本试验构建的表达载体 pET15b/3-OST-5 中含有
6×His-Tag 编码序列，可以利用镍琼脂糖凝胶亲和
色谱纯化带组氨酸标签蛋白的方法来纯化 3-OST-5。
纯化后的 3-OST-5 蛋白经 SDS-PAGE 分析，结果（图
3）表明，经过纯化得到了相对单一的条带，可以认
为已得到相对较纯的 3-OST-5 酶蛋白。纯化后酶液
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期104
的比酶活达到0.58 U/mg，是纯化前粗酶液酶活的5.27
倍，回收率达 80.4%。结果见表 2 。
Ca2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Ba2+、Mn2+，
30℃条件下测定 3-OST-5 的酶活，以不加金属离子
的反应液作为对照，设定其酶活为 100%，不同金属
离子对 3-OST-5 酶活性的影响，结果见表 3。结果表
明 K+、Ca2+、Ba2+ 对酶有一定的促进作用，而 Al3+、
Mg2+、 Mn2+、Zn2+、Cu2+ 对酶有抑制作用，其中 Al3+
对酶促反应的抑止作用较弱。
3 讨论
利用常规方法从猪肠分离纯化所获得的肝素产
量低且副作用大，而通过化学合成方法来制备肝素
合成步骤繁多，工艺困难 ；酶法制备低分子量肝素
可以很好的解决上述方法中存在的问题［4-7］，利用
酶法规模化合成低分子量肝素的瓶颈在于合成的前
体以及催化反应的各种酶。本研究的硫酸乙酰肝素
3-OST-5 是低分子量肝素合成过程的一个关键酶，与
硫酸乙酰肝素 3-O 硫酸基转移酶的其他 6 个异构体
图 3 重组菌 BL21/pET15b/3-OST-5全细胞蛋白及
3-OST-5纯化后 SDS-PAGE图
M. 蛋白marker；1. E.coli BL21/pET15b超声破碎后的的上清液；2. E.coli
BL21/pET15b/3-OST-5 超声破碎后的上清液 ；3. 纯化的 3-OST-5
2.3 重组蛋白3-OST-5的酶学性质测定
2.3.1 最适温度及温度稳定性 在 20℃、25℃、
30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和 60℃温度
下测定 3-OST-5 的酶活，结果（图 4）表明 3-OST-5
的最适反应温度为35℃。温度稳定性试验结果表明，
3-OST-5 在 20-40℃较稳定，随着温度的升高，酶稳
定性逐渐下降，到达 60℃时 3-OST-5 酶液出现絮状
沉淀，可能完全变性失活。
2.3.2 最 适 pH 及 pH 稳 定 性 测 定 3-OST-5 在
pH4.0-9.0 范围内反应时的酶活，结果（图 5）显示，
3-OST-5 的最适催化 pH 为 7.0，在 pH7.0 时酶活性
最高达 0.25 U/mg。将纯化后的 3-OST-5 酶液分别
加入到不同 pH 反应体系（pH4.0-9.0）中，在 30℃
保温 2 h 后测定剩余酶活，结果显示 3-OST-5 在 pH
6.0-8.0 的范围内相对稳定。
2.3.3 金属离子对酶活性的影响 金属离子可以作
为酶促反应的辅助因子，因此在酶促反应中经常添
加某些金属离子来促进酶促反应的进行。在 pH7.0
的反应体系中分别加入终浓度为 1 mmol/L 的 K+、
表 2 重组蛋白 3-OST-5的纯化表
纯化
步骤
蛋白质重量
（mg）
酶活
（U）
比酶活
（U/mg）
回收率
（%）
纯化
倍数
Media 29.36 3.12 0.11 100 1
Ni-NTA 4.3 2.51 0.58 80.4 5.27
图 4 3-OST-5的最适反应温度及温度稳定性
图 5 3-OST-5的最适反应 pH及 pH稳定性
2012年第8期 105陕婧婧等 ：硫酸乙酰肝素 3-O 硫酸基转移酶 5 的表达、纯化及酶学性质研究
（3-OST-1、3-OST-2、3-OST-3a、3-OST-3b、3-OST-4、
3-OST-6）相比，它可以催化生成同时具有抗凝血活
性和单胞疱疹病毒识别结合活性的多糖分子［8］。
大肠杆菌表达系统具有操作简单，表达量高，
成本低，可以根据需要进行优化等优点，并可通过
发酵进行大规模生产。Myette 等［16］报道了人硫酸乙
酰肝素 3-O 硫酸基转移酶 1 在大肠杆菌中的表达纯
化及动力学性质。本研究选用大肠杆菌 BL21（DE3）
宿主菌和 pET-15b 表达载体成功构建了重组菌 E.coli
BL21/pET15b/3-OST-5，经 IPTG 诱导后，测得粗酶
液中 3-OST-5 的酶活为 0.11 U/mg，以上结果表明成
功表达了外源蛋白——硫酸乙酰肝素 3-OST-5。通过
镍琼脂糖亲和层析法纯化重组菌中的 3-OST-5 蛋白，
纯化获得的 3-OST-5 比活达到了 0.58 U/mg，较粗
酶液的比活提高了 5.3 倍。在此基础上，对纯化后
的 3-OST-5 的酶学性质进行了初步研究。结果表明，
3-OST-5 酶促反应的最适温度为 35℃，温度在 40℃
以下时，酶的稳定性较好。3-OST-5 酶促反应的最适
pH 为 7.0，且在较高 pH 条件下稳定性较好。在反
应液中加入终浓度为 1 mmol/L 的 K+、Ca2+、Ba2+ 对
酶促反应有一定的促进作用。
现阶段仅对 3-OST-5 的表达纯化进行了初步的
研究，若对重组菌的培养条件进行优化，可以大幅
度的提高 3-OST-5 的表达量，为其规模化生产奠定
基础，此方面的研究本研究室正在进行中。在本研
究中大肠杆菌表达系统所表达的酶蛋白生物学活性
不高，可能原因是来自于人胚胎细胞的基因与大肠
杆菌的基因存在密码子利用偏好的问题。可以尝试
在真核表达体系如毕赤酵母表达系统中表达硫酸乙
酰肝素 3-OST-5 基因，为开发高活性的硫酸乙酰肝
素 3-OST-5 提供依据。
4 结论
本研究在大肠杆菌 BL21（DE3）中成功地表
达了硫酸乙酰肝素 3-O 硫酸基转移酶 5，目标蛋白
条带的大小约为 31 kD，经测定纯化后的电泳纯产
物比活达到 0.58 U/mg。在此基础上，对纯化产物
的酶学性质进行了初步研究，酶的温度稳定范围为
20-40℃，反应的最适温度为 35℃ ；在 pH7.0-9.0 范
围内稳定，最适 pH 为 7.0。在反应液中加入终浓度
为 1 mmol/L 的 K+、Ca2+、Ba2+ 对酶促反应有一定的
促进作用。
参 考 文 献
［1］ Gu L, Wang H, Guo YL. Heparin blocks the adhesive of E.coli 0157：
H7 to human colonic epithelial cells. Food Control, 2008, 19（12）：
1119-1125.
［2］ Kreuger J, Spillmann D, Li JP. Interactions between heparan sulfate
and proteins：the concept of specificity. J Cell Biol, 2006, 174（3）：
323-327.
［3］ ODonnell CD, Shukla D. The importance of heparan sulfate in
herpes virus infection. Virol Sin, 2008, 23（6）：383-393.
［4］ Sugahara K, Kitagawa H. Heparin and heparin sulfate biosynthesis.
Iubmb Life, 2002, 54（4）：163-175.
［5］ Lindahl U, Li J, Kusche-Gullberg M. Generation of ‘neoheparin’
from E.coli K5 capsular polysaccharide. J Med Chem, 2005, 48 ：
349-352.
［6］ Chen JH, Duncan MB, Carrick K, et al. Biosynthesis of 3-O-sulfated
heparan sulfate unique substrate specificity of heparan sulfate
3-O-sulfotransferase isoform 5. Glycobiology, 2003, 13（11）：
785-794.
［7］ Duncan MB, Chen JH, Krise JP, et al. The biosynthesis of anticoagul-
ant heparan sulfate by the heparan sulfate 3-O-sulfotransferase iso-
form 5. Biochimica et Biophysica Acta, 2004, 1671（1-3）：34-43.
［8］ Xia GQ, Chen JH, Liu J, et al. Heparan sulfate 3-O-Sulfotransferase
isoform 5 generates both an antithrombin-binding site and an entry
receptor for herpes simplex virus, type 1. The Journal of Biological
Chemistry, 2002, 277（40）：33791-37912.
［9］ Chen JH, Liu J. Characterization of the structure of antithrombin-bin-
ding heparan sulfate generated by heparan sulfate 3-O-sulfotransfe-
表 3 金属离子对 3-OST-5酶活性的影响
金属离子 酶活（%）
None 100
K+ 154
Ca2+ 106
Mg2+ 13
Al3+ 80
Zn2+ 32
Fe2+ 36
Cu2+ 21
Ba2+ 115
Mn2+ 14
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期106
rase 5. Biochim Biophysica Acta, 2005, 1725（2）：190-200.
［10］ Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning ：A laboratory mannu-
al ［M］.3rd ed.. New York ：Cold Spring Harbor Laboratory Press,
2001 ：1523-1574.
［11］ Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantization of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-
dye binding. Analytical Biochemistry, 1976, 72（1-2）：248-254.
［12］ Burkart MD, Izumi M, Chapman E, et al. Regeneration of PAPS for
the enzymatic synthesis of sulfated oligosaccharides. J Org Chem,
2000, 65（18）：5565-5574.
［13］ 田倩 . 类肝素多糖在聚氨酯材料表面的原位合成［D］. 武汉：
武汉理工大学 , 2010.
［14］ 徐美娟 , 杨套伟 , 饶志明 , 等 . 克雷伯氏菌甘油脱氢酶 dhaD
的克隆表达纯化及酶学性质研究 . 中国生物工程杂志 , 2008,
28（12）：30-35.
［15］ 陈蔚青 , 王晓枫 , 王普 , 等 . 链球菌噬菌体裂解酶在大肠杆菌
中的表达、纯化及活性检测 . 生物工程学报 , 2009, 25（8）：
1267-1272.
［16］ Myette JR, Shriver Z, Liu J, et al. Expression in Escherichia coli,
purification and kinetic characterization of human heparan sulfate
3-O-Sulfotransferase-1. Biochemical and Biophysical Research
Communications, 2002, 290（4）：1206-1213.
（责任编辑 李楠）