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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
II 型糖尿病是一种以慢性血葡萄糖水平增高为
特征的代谢性疾病，是由于胰岛素分泌和作用缺陷
所引起，是影响人类健康的一种主要疾病之一。目
前，对 II 型糖尿病患者的治疗主要从饮食、运动以
及使用药物等几个方面着手，新的治疗手段主要是
控制机体代谢、增加胰岛 β-细胞数量和维持其正常
生理功能［1］。人胰高血糖素样肽 1（hGLP1）是一种
肠肽激素，主要由末端空肠、回肠和结肠的 L 细胞
所分泌，是胰高血糖素原（proglucagon）基因翻译
后加工和修饰的产物，主要通过与 G 蛋白偶联的受
收稿日期 ：2012-07-29
基金项目 ：三峡大学人才科研启动基金项目（KJ2012B023），国家林业局“948”项目 (2006-4-73)
作者简介 ：梁宏伟，男，讲师，博士，研究方向 ：植物学、植物细胞工程与分子生物学 ；E-mail ：lianghwcn@yahoo.com.cn
通讯作者 ：陆海，男，博士，教授，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail: luhai1974@yahoo.com
体结合后发挥其生理功能［2］。hGLP1 作为一种肠降
血糖素，能够诱导胰岛 β-细胞增殖和分化，促进葡
萄糖依赖的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，减
缓胃肠蠕动和饥饿感，减少饮食，从而达到降低血
糖的水平［3］。hGLP1 能够明显降低Ⅱ型糖尿病患者
空腹和餐后血糖水平，对Ⅱ型糖尿病具有较好的疗
效，同时对Ⅰ型糖尿病的治疗也具有一定的潜力［4］。
烟草是转基因植物生产重组药用蛋白、抗体、
基因工程疫苗研究的模式植物，其遗传转化体系成
熟完善。目前利用转基因烟草已成功表达了葡萄
利用转基因烟草表达人胰高血糖素样肽 1 的研究
梁宏伟1  陈发菊1  王玉兵1  李凤兰2  陆海2
（1. 三峡大学生物技术研究中心，宜昌 443002 ； 2. 北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）
摘 要 ： 人胰高血糖素样肽 1（hGLP1）是一种短肽激素，是近年来备受关注的治疗糖尿病最有前景的候选药物。在设计合
成 hGLP1 基因并构建植物表达载体的基础上，通过农杆菌介导将 hGLP1 基因导入烟草基因组中，获得转化再生植株，经过 PCR
扩增和 Southern blot 分析，证实 hGLP1 基因已整合进入 6 个株系的烟草基因组中。GUS 组织化学染色表明，与目的基因融合的报
告基因在转基因烟草中获得表达。Western blot 检测表明，其中 2 个株系转基因烟草叶片中能够检测到 hGLP1 融合蛋白的表达。初
步的动物试验表明该融合蛋白具有一定的降血糖生物活性。
关键词 ： 烟草 转基因 人胰高血糖素样肽 1 生物活性
Expression of Human Glucagon-like Peptide 1 in
Transgenic Tobaccos
Liang Hongwei 1 Chen Faju 1 Wang Yubing 1 Li Fenglan 2 Lu Hai 2
（1. Biotechnology Research Center，China Three Gorges University，Yichang 443002 ；2. College of Biological Sciences and Biotechnology，
Beijing Forest University，Beijing 100083）
Abstract:  Human pancreatic glucagon-like peptide-1（hGLP1）is a short peptide hormone with special attention in the treatment
of diabetes, is considered as the most promising candidate medicines. Based on design composition of hGLP1 gene and construction of plant
expression vector, hGLP1 gene was introduced into tobacco through Agrobacterium tumfaciens-mediated method. The PCR amplification
and Southern blot analysis indicated that the hGLP1 gene have been integrated into the genome of six lines of the regenerated tobaccos. GUS
histochemistry staining showed that the reporter gene fusion with the target gene was expressed in transgenic tobacco plants. Western blot
analysis confirmed that hGLP1 fusion protein was detected in two lines of transgenic tobacco leaves. The fusion protein demonstrated a certain
biological activity in reducing blood sugar by elementary animal experiments.
Key words:  Tobacco Transgene Human glucagon-like peptide 1 Biological activity
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期140
脑 苷 脂 酶（β-glucocerebrosidase）［5］、 人 生 长 激 素
（hGH）［6］，以及针对霍乱病毒（cholera）［7］、人类
乳突病毒（HPV）［8］、艾滋病（HIV）［9］和炭疽杆
菌（anthrax）［10］等多种治疗性蛋白或疫苗。本研究
利用烟草这一成熟转化体系，通过农杆菌介导法将
人胰高血糖素样肽 1（hGLP1）基因导入烟草中，并
通过动物试验对转基因烟草表达产物进行初步的生
物活性检测，旨在为转基因烟草作生物反应器表达
人胰高血糖素样肽 1 提供理论和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
普通烟草（Nicotiana tabacum L.），本实验室保
存。昆明小鼠购自军事医学科学院，雄性，6-7 周
龄，体重 18-22 g，SPF 级，质量合格证号 ：SCXK-
（军）-2007-004。
各种限制性内切酶购自宝生物工程（大连）
有 限 公 司 ；所 有 引 物 均 由 上 海 生 工 公 司 合 成 ；
Southern blot 试剂盒购自 Roche（Germany）公司 ；
Marker DNA、2×Taq MasterMix、Western blot 试剂
盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；各种激素、
抗生素和组培生化试剂购自北京拜尔迪生物技术有
限公司。
hGLP1 基因和 PBI121 表达载体由三峡大学生物
技术研究中心惠赠，将含有 His-tag 标签的 hGLP1 基
因克隆至 PBI121 质粒 CaMV35S 启动子下游，hGLP1
基 因 两 端 限 制 性 酶 切 位 点 为 BamH Ⅰ 和 Sma Ⅰ，
T-DNA 区结构示意见，图 1。根癌农杆菌（Agrobac-
terium tumefaciens）GV3101 菌株，由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 烟 草 的 遗 传 转 化 采 用 叶 盘 法［11］ 进 行 农
杆菌的侵染转化。用含有 PBI121-GLP1 表达载体
的农杆菌 GV3101 侵染过夜预培养的烟草小叶块
（0.5 cm×0.5 cm）5 min，然后吸去附着的菌液置于
（25±2）℃、黑暗条件下共培养 2 d，共培养结束后
转入附加 30 mg/L 卡那霉素和 500 mg/L 羧苄青霉素
的不定芽分化培养基上，（25±2）℃，16/8 h 光周期
下进行选择培养，3 周后叶片外植体开始分化出抗性
不定芽，待不定芽长到 1 cm 以上时，切下并接入附
加 30 mg/L 卡那霉素的生根培养基上进行生根培养。
1.2.2 GUS 组织化学染色 GUS 染色液配方参照 Jef-
ferson 等［12］方法稍作修改。50 mmol/L 磷酸钠缓冲
液（pH7.0）中含有 5 mmol/L K4Fe［CN］6，5 mmol/L
K3Fe［CN］6，10 mmol/L EDTA-Na2，0.1%（V/V）
Triton X-100，20% 甲 醇，1 mg/L 的 X-Gluc。X-Gluc
需提前溶于 DMSO 中，再加入上述缓冲液里，混匀
后分装于 2.0 mL 离心管中置 -20℃中保存备用。
1.2.3 转基因烟草的分子生物学检测
1.2.3.1 PCR 检 测 采 用 CTAB 法［13］ 提 取 转 化 植
株和野生型烟草植株总 DNA。以 PBI121-GLP1 质粒
DNA 为阳性对照，野生型烟草总 DNA 为阴性对照
进行 PCR 扩增。PCR 扩增检测引物 ：GLP1-F ：5-
GGATCCACCATGGGGCATCATCATC-3；GLP1-R ：5-
GCACCAGTCTTCCCTTAACCAGCCAAG-3。扩增程序：
94℃变性 5 min ；94℃变性 1 min，58℃退火 35 s，
72℃延伸 30 s，30 个循环 ；72℃ 延伸 10 min。
1.2.3.2 Southern blot 检 测 通 过 PCR 扩 增 PBI121-
GLP1 质粒 DNA，回收 GLP1 基因片段，按照 Roche
公司 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter
kit Ⅱ操作手册标记探针。对 PCR 检测呈阳性植株进
行 Southern 杂交检测，方法按杂交试剂盒的操作指
南进行。
1.2.3.3 Western blot 检 测 采 用 PBS 提 取 缓 冲 液
（NaCl 137 mmoL/L，KCl 2.7 mmoL/L，Na2HPO4 10
mmoL/L，KH2PO4 1.76 mmoL/L，pH7.4）提取烟草叶
片中总可溶性蛋白质，用 Bradford 法测定可溶性蛋
白质浓度。经 SDS-PAGE 电泳，采用半干法转移至
硝酸纤维素膜（NC）上。将 NC 膜置于封闭液中封闭；

hGLP1 gusA NPT II CaMV35S NOS-Ter NOS-Ter NOS-Pro
RB BamH I Sma I LB
图 1 植物表达载体 PBI121 质粒（包含 hGLP1 基因）
T-DNA 区
叶 片 不 定 芽 分 化 培 养 基 ：MS+6-BA 1.0 mg/L+
NAA 0.2 mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 琼脂粉 5.2 g/L ；继代、
生根培养基 ：1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L+ 蔗
糖 30 g/L+ 琼脂粉 5.4 g/L ； 遗传转化的选择压力为
30 mg/L 卡那霉素（Km），除菌羧苄青霉素（Carb）
为 500 mg/L。以上培养基配制时均调 pH 值 6.0。
2013年第1期 141梁宏伟等 ：利用转基因烟草表达人胰高血糖素样肽 1 的研究
漂洗，加入稀释的 His-tag 标签抗体一抗孵育 ；漂
洗，加入稀释的羊抗兔 -HRP（辣根过氧化物酶）二
抗孵育 ；漂洗，使用 ECL Western blot Kit 进行 ECL
反应 ；X-光片压片，曝光、显影、定影。
1.2.4 转 hGLP1 基因烟草的总可溶性蛋白生物活
性检测 参照文献［14，15］将雄性昆明小鼠禁食
12-18 h 后，检测基础血糖值，挑选血糖值相近的小
鼠分成 2 组，每组 8 只。分为对照组和给药组，对
照组按体重腹腔注射 50% 葡萄糖溶液同时给予野生
型烟草总可溶性蛋白提取液，给药组按体重腹腔注
射 50% 葡萄糖溶液同时给以待测样品。
尾静脉取血测定血糖值，并记录血糖值变化的
差异。所有数据以 x
_
±s 表示，以 SPSS12 进行 t 检验
统计组间差异。
2 结果
2.1 烟草外植体的选择培养和抗性再生
经过农杆菌侵染烟草小叶块在不定芽分化的选
择培养过程中，大部分外植体黄化甚至白化逐渐死
亡，小部分则仍然正常生长分化。15-20 d 左右，开
始有部分外植体分化出不定芽。取 1 cm 以上的抗性
不定芽转入附加 30 mg/L Km 选择压的生根培养基进
行生根培养，最终获得 hGLP1 基因转化的烟草再生
植株 10 株。
2.2 烟草抗性再生植株的PCR扩增检测
分别提取 10 个株系的转基因烟草植株的叶片基
因组 DNA，采用 hGLP1 基因特异性引物进行 PCR
扩增检测，同时以 PBI121-GLP1 质粒 DNA 为阳性
对照，未转化野生型烟草总 DNA 为阴性对照。结果
（图 2）显示，其中 6 个株系的转基因烟草和阳性对
照均扩增出了 150 bp 左右目的条带，而未转基因野
生型烟草则没有特异性扩增条带。从而证实 hGLP1
基因已经成功整合到烟草基因组 DNA 中。
2.3 转hGLP1基因烟草的GUS组织化学染色
对转 hGLP1 基因烟草再生植株茎叶做 GUS 表
达检测，以未转基因野生型烟草作为阴性对照。结
果（图 3）显示，在转基因烟草的茎和叶脉中有明
显的蓝斑阳性信号，而野生型烟草则无 GUS 蓝斑信
号。从而证明 GUS 报告基因在转基因烟草中获得翻
译表达。由于 hGLP1 基因和 GUS 报告基因串联或构
1：DNA Marker； 2：质粒阳性对照； 3：野生型烟草阴性对照；
4-9 ：检测样本
图 2 PCR 扩增检测抗性再生植株
A ：转基因烟草 ；B ：未转化野生型烟草
图 3 转基因烟草的 GUS 表达
成融合基因，报告基因的表达间接证明 hGLP1 基因
也能够在转基因烟草中正常转录表达。
2.4 Southern blot检测
以含有 hGLP1 基因的质粒 DNA 为阳性对照，
野生型烟草总 DNA 为阴性对照，对转化植株样本
进行 Southern 杂交检测。结果（图 4）显示，6 个转
hGLP1 基因烟草抗性再生株系均出现明显的阳性杂
交信号。进一步证明 hGLP1 基因已成功整合到烟草
的基因组 DNA 中，获得了转人胰高血糖素样肽 1 基
因的转基因烟草。将 Southern 杂交检测呈阳性的转
基因烟草进行扩繁，炼苗后移栽至温室，以便进行
蛋白质提取和生物活性检测。
2.5 转hGLP1基因烟草的Western杂交检测
由于 hGLP1 基因序列中融合有 6×His-tag 标签，
在检测转基因烟草是否翻译表达 hGLP1 融合蛋白的
Western 杂交检测中，以 Anti-His tag Antibody 作为
第一抗体，羊抗兔 -HRP 为二抗，以野生型烟草总
可溶性蛋白作为阴性对照，分别提取 6 个株系的转
hGLP1 基因烟草的总可溶性蛋白进行 Western 杂交
2000
1000
750
500
250
100
bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9
A B
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期142
50% 葡萄糖溶液同时给以 7.5 mg/kg 的总可溶性蛋白，
在随后的 10、20、40 min 时小鼠血糖浓度均明显低
于葡萄糖对照组。初步证明转 hGLP1 基因烟草的总
可溶性蛋白具有一定的降血糖生物活性。
3 讨论
hGLP1 基因由本课题组根据植物偏爱密码子对
碱基序列的优化修饰，在基因序列上游添加了在翻
译的起始中有重要作用 KOZAK 序列［16］，以增强目
的基因的翻译效率，期待能够在转基因烟草植株内
高效表达人胰高血糖素样肽 1。
在烟草的遗传转化过程中，通过抗生素筛选获
得再生植株仍有相当一部分假阳性植株，可能是因
为在培养过程中叶片常常卷翘变形而没有完全接触
到选择培养基，从而造成部分假阳性植株的筛选逃
逸。也可能随着培养时间增长，培养基中抗生素逐
渐降解导致浓度降低，从而造成假阳性植株的再生。
因此，在选择培养的过程中保证叶片外植体充分接
触选择培养基，经常更换新鲜的培养基，优先选取
最早分化的抗性芽进行下一步的继代培养，可望提
高选择效率。在 Western 杂交检测中，仅有 2 个株
系能够检测 hGLP1 融合蛋白的表达，其余 4 个株
系没有获得阳性信号。由此可见，不同转化子之间
外源蛋白表达与否及表达量是存在明显差异。究其
原因可能是发生基因沉默，或是外源蛋白表达量太
低不足以检测到阳性信号，也可能是表达的外源蛋
白在植物体内被降解。外源蛋白在转基因植物中表
达量低是普遍存的问题，有时甚至发生基因沉默而
不能表达［17］。Yasud 等［18］将 GLP1 基因导入水稻
中，发生基因沉默而未获得胰高血糖素样肽 1 的表
达，随后他们将 GLP1 与 GFP 基因构建融合序列转
化水稻，获得高效的表达融合蛋白，但分离纯化的
过程中 GLP1 蛋白丢失，分析认为可能是被细胞内
水解酶消化。
以模式植物烟草作为生物反应器的受体，比较
1 ：阳性对照 ；2 ：阴性对照 ；3-8 ：转基因烟草样本
图 4 转基因烟草的 southern 杂交检测
1 ：野生型阴性对照 ；2-6 ：转基因烟草样本
图 5 转基因烟草的 Western blot 分析
分组
时间（min）
0 10 20 40
对照组（n=8） 3.15±0.55 17.14±3.11 23.45±5.49 20.03±6.01
给药组（n=8） 3.61±0.41 14.50±3.59 20.90±3.33 16.78±4.99
表 1 转 hGLP1 基因烟草总可溶性蛋白的生物活性（血糖浓度单位 ：mmol/L）
1 2 3 4 5 6 7 8
检测。结果（图 5）显示，在 2 个株系转基因烟草
中可以检测到 hGLP1 融合蛋白的表达而在非转基因
的野生型烟草中没有检测到特异性杂交条带。从而
证实了 hGLP1 基因在转基因烟草中获得了翻译表达。
随着压片时间的延长，非特异性条带开始出现。
2.6 转hGLP1基因烟草总可溶性蛋白的生物活性
提取转 hGLP1 基因烟草总可溶性蛋白，以昆明
小鼠葡萄糖性高血糖模型进行体内生物活性检测。
葡萄糖对照组注射 50% 葡萄糖溶液，同时给以野生
型烟草总可溶性蛋白提取液，给药组注射 50% 葡萄
糖溶液，同时给以转 hGLP1 基因烟草总可溶性蛋白
提取液。统计结果（表 1）显示，对照组和给药组
腹腔注射 18 mmol/kg 的 50% 葡萄糖溶液，10 min 后
小鼠血糖浓度迅速升高 4 7 倍，说明试验性高血糖
模型造模成功。给药组小鼠腹腔注射 18 mmol/kg 的
1 2 3 4 5 6
2013年第1期 143梁宏伟等 ：利用转基因烟草表达人胰高血糖素样肽 1 的研究
高效的遗传转化效率是其最大优点。但是也存在着
一定的问题，主要表现为烟草中含有大量的尼古丁
等生物碱毒素，毒性较大，4 0 60 mg 剂量即可使人
致死［19］。以烟草作为生物反应器表达的药用蛋白无
法直接使用，需精细纯化后才能应用。本研究中提
取烟草总可溶性蛋白测试小鼠体内生物活性发现，
无论是对照组还是给药组小鼠注射烟草总可溶性蛋
白提取液后不断颤抖，可能是烟草中生物碱毒素所
致，下一步将采用分离纯化的 hGLP1 融合蛋白进行
动物体内生物活性检测。分离纯化转基因烟草表达
的重组药用蛋白，无疑会大大提高重组药用蛋白的
生产成本，不符合植物生物反应器廉价地生产重组
药用蛋白的主旨。尽管目前已经有多种植物被用作
生物反应器的受体来生产药用蛋白、重组疫苗，如
烟草、 谷类作物、 豆类、 蔬菜与根茎类作物等，但是
还没有找到公认的最好的适于商业生产的植物物种
和组织［20］。
4 结论
通过农杆菌介导侵染转化，hGLP1 基因已成
功地整合到烟草基因组中并获得转化再生植株，
hGLP1 融合蛋白在转基因烟草植株中获得表达，初
步的动物试验表明该融合蛋白具有一定的降血糖生
物活性。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）