全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):222-229
收稿日期 ： 2015-02-27
基金项目 ：国家“973”前期研究专项（2012CB722304），河南省自然科学基金项目（142300413212，132300413208），河南省重大科技攻关
项目（111100910600）
作者简介 ：杨刚刚，男，博士，研究方向 ：微生物药物研究与开发 ；E-mail ：yanggang1987@gmail.com
通讯作者 ：徐存拴，男，教授，研究方向 ：微生物药物研究与开发 ；E-mail ：cellkeylab@126.com
豹蛙抗瘤酶与人血清白蛋白融合蛋白的毕赤酵母高效表
达与活性测定
杨刚刚1，3  马诚凯1，3  史世会2  张全义2  王泽2  吕中原2  王绪洋2   
许晓亚1，3  崔晴晴1，3  张继红1，3  丁一1，3  徐存拴1，3
（1. 河南师范大学生命科学学院，新乡 453007 ；2. 河南新乡华星药厂，新乡 453007 ；3. 河南省一科技部共建细胞分化国家重点实验室
培育基地和河南省生物工程重点实验室，新乡 453007）
摘 要： 豹蛙抗瘤酶（Onconase，ONC），又称豹蛙酶，对多种肿瘤细胞和实体瘤具有显著杀伤作用，为得到高表达的 ONC，
利用 HSA 在毕赤酵母系统中的表达优势，将 HSA 和 ONC 融合进行毕赤酵母表达并分离纯化。设计融合基因 HSA-（Gly4Ser1）3-ONC，
简称 HSA-ONC，构建至 3 种表达载体 pPIC9、pPIC9K、pPICZα-A 并分别转染 X-33、GS115 和 SMD1168 3 种宿主菌，在摇瓶和 10
L 规模优化表达条件和双水相偶联柱层析分离纯化目的蛋白并测定其生物学活性。结果显示，在 1 L 摇瓶规模下，pPICZα-A/X-33/
HSA-ONC 组合的表达量优于其他组合，且在 pH7，温度 23℃条件下诱导 10 d，表达量达到最高（235 mg/L）。在 10 L 规模进行不
同培养基条件的发酵，rHSA-ONC 于 pH 7 的低盐基础盐培养基（Low salt basic salt medium，LS-BSM），甲醇浓度 0.25% 条件下诱导
10 d，表达量达到最高（2.02 g/L）。经双水相萃取偶联 DEAE 离子交换层析可得到纯度≥ 95%、收率高于 70% 的 rHSA-ONC。生物
活性检测发现，rHSA-ONC 在体外能抑制多种癌细胞增殖。rHSA-ONC 的表达量较 rONC 提高 1 倍（同等摩尔量情况下），同时在体
外抑制多种癌细胞增殖。
关键词 ： 豹蛙抗瘤酶 ；人血清蛋白 ；毕赤酵母高效表达 ；双水相萃取 ；癌细胞活性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.034
Efficient Expression and Biological Activity Detection of Fusion Protein
of Onconase with Human Serum Albumin in Pichia pastoris
Yang Ganggang1，3 Ma Chengkai1，3 Shi Shihui2 Zhang Quanyi2 Wang Ze2 Lü Zhongyuan2 Wang Xuyang2
Xu Xiaoya1，3 Cui Qingqing1，3 Zhang Jihong1，3 Ding Yi1，3 Xu Cunshuan1，3
（1. College of Life Science，Henan Normal University，Xinxiang 453007 ；2. Henan Xinxiang Hua Xing Pharmaceutical Factory，
Xinxiang 453007 ；3. State Key Laboratory Cultivation Base for Cell Differentiation Regulation and Henan Bioengineering Key Laboratory，
Henan Normal University，Xinxiang 453007）
Abstract:  Onconase（ONC, also known as ranpirnase or P-30 protein）has weak RNase activity and significant toxic effect on various
tumor cells and solid tumors. In order to obtain ONC owing highly efficient expression, we utilized the advantage of human serum albumin（HSA）
expression in Pichia pastoris, had a fusion of HSA and ONC which was expressed in P. pastoris, then separated and purified the expressed
protein. We designed the fusion gene according to the amino acid sequence of HSA-ONC and synthesized it based on the codons of P. pastoris,
HSA-ONC gene was inserted into vector of pPIC9, pPIC9K and pPICZα-A to form the recombinant plasmid pPIC9/HSA-ONC, pPIC9K/HSA-ONC
and pPICZα-A/HSA-ONC, then the linearized recombinant plasmids were transformed into P. pastoris X-33, GSS115 and SMD1168 respectively.
The expression conditions were optimized in the shake flask and 10-L bioreactor. The rHSA-ONC was purified by aqueous two-phase extraction
2015,31(10) 223杨刚刚等：豹蛙抗瘤酶与人血清白蛋白融合蛋白的毕赤酵母高效表达与活性测定
豹蛙抗瘤酶（Onconase，ONC），又称豹蛙酶，
是从北极豹蛙卵母细胞和早期胚胎中提取的一种天
然蛋白，是核糖核酸酶 A 家族的最小成员［1］，是
第一个进入抗肿瘤临床试验的核糖核酸酶［2，3］，在
体内外多种肿瘤试验中体现出了很强的杀伤作用。
1996 年以来，Tamir 公司（前身为 Alfacell 公司）针
对 ONC 已开展乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、恶
性间皮质瘤等的Ⅰ-Ⅲ期临床试验，均表现出了良好
的抗肿瘤作用［4］。ONC 是一个由 104 个氨基酸残基
构成的单链蛋白，含 4 对二硫键。与 RNaseA 相比，
尽管属同一超家族成员，并且氨基酸序列具有 30%
相似性，但在酶活和细胞毒性上具有成千上万倍的
差别。RNA 降解活性为 ONC 的 1 000 倍，而 ONC
的细胞毒性达到 RNaseA 的 10 000 倍［5］。ONC 较高
的细胞毒性和较低的免疫原性正是它成为肿瘤药物
的关键因素。ONC 的作用机制尚不完全明确，目前
认为它通过静电作用与细胞膜表面结合，再通过膜
流和内吞作用进入细胞内［6］。在胞内通过特异性降
解 tRNA 而抑制蛋白质合成［7］，Qiao 等［8］研究发现
ONC 特异性降解 miRNA 前体为 ONC 的作用机提出
新的研究思路。
目前，临床试验中所用的 ONC 都取自蛙卵和早
期胚胎，资源少、周期长、收率低及代价高，难以
满足临床需要［9］。ONC 常见的已表达系统有大肠杆
菌系统和毕赤酵母系统，但大肠杆菌系统需要进行
包涵体复性等繁琐步骤，活性难以保证，不利于工
业化生产［9-11］；毕赤酵母系统因表达量过低（150
mg/L）［12］，不利于大规模应用。与之相反，HSA 的
毕赤酵母表达技术已经十分成熟，表达量高（最高
表达量 10 g/L）［13，14］且分离纯化体系完善，实用优
势明显，而且人血清白蛋白有重要的生物学作用和
广泛的临床应用，常用来与其他蛋白融合以延长蛋
白半衰期，是理想的药物载体［15］。
本研究拟利用巴斯德毕赤酵母表达人血清白蛋
白和豹蛙抗瘤酶的融合蛋白，将 rHSA 的高表达和
纯化成熟的优势体现于 ONC，并对其表达条件和分
离纯化方法进行优化，旨在有效降低 ONC 的生产成
本，为其大规模生产应用提供参考。。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和基因 大肠杆菌（Escherichia
coli）DH5α 菌株购自武汉晶赛生物工程技术有限公
司，毕赤酵母 X-33、GS115、SMD1168 菌株，分泌
型 酵 母 表 达 载 体 pPIC9、pPIC9K、pPICZα-A 购 自
Invitrogen 公司，HSA-ONC 融合基因委托上海生工生
物工程有限公司合成。人肝癌细胞株 7402、HeLa、
RH35 细胞株菌购自中国医学科学院基础医学研究所
细胞资源中心（北京）。
1.1.2 试剂和工具酶 DMEM、RPMI-1640 培养基、
青霉素、链霉素购自 Invitrogen 公司，胎牛血清购
自杭州天杭生物科技有限公司，MTT、DMSO 购自
Geneview 公司。DNA 片段回收试剂盒及质粒快速提
取试剂盒均购自鼎国生物技术有限公司，酵母基因
组快速提取试剂盒购自北京博迈德科技发展有限公
司。限制性内切酶 Pme I、Bst B I、Bam H I、Eco R I
购自 MBI 公司，Protein Ladder 购自上海赛默飞世尔
科技有限公司。DEAE Sepharose Fast Flow 购自美国
GE 公司。HSA 一抗购自北京中杉金桥生物技术有
限公司，ONC 一抗购自武汉博士德生物工程有限公
司，其他试剂为国产分析纯。
1.1.3 培养基及基础培养条件 常用培养基 ：LB、
coupling DEAE anion exchange chromatography, and the biological activity was detected by SRB assay. The highest rHSA-ONC production
reached 235 mg/L in pPICZα-A/X-33/HSA-ONC combination under the condition of pH7 and 23℃in 1-L flask after induced 10 d, better than
other combinations. In the 10-L bioreactor, when the induction was performed in the low basic salt medium of pH 7, and induced 10 d under 0.25%
ethanol, the highest rHSA-ONC production could reach 2.02 g/L. The rHSA-ONC was purified by aqueous two-phase extraction coupling DEAE
anion exchange chromatography, the purity was ≥ 95% and the yield was > 70%. The results of detecting biological activity showed that the
rHSA-ONC inhibited the proliferation of various tumor cells in vitro. Conclusively, the expression level of rHSA-ONC was twice as that of rONC
at the same molar dose, and rHSA-ONC inhibited the proliferation of various tumor cells in vitro.
Key words:  onconase ；human serum albumin ；Pichia pastoris efficient expression ；aqueous two-phase extraction ；activity of tumor
cells
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10224
YPD、BMGY、PTM1、PTM2 等 培 养 基 参 考 Invitro-
gen 公司的酵母表达手册。
BSM（Basic Salt Medium，BSM）（g/L）：硫酸钾
14.3，硫酸镁 11.7，盐酸胍 6，氢氧化钾 3.9，硫酸钙 0.9，
甘油 40，磷酸 23.5 mL/L。
LBSM（Low Salt Basic Salt Medium，LSBSM）
（g/L）：硫酸钾 4.55，硫酸镁 3.73，氢氧化钾 1.03，
硫酸钙 0.23，六偏磷酸钠 6.5，甘油 40。
摇瓶培养条件：温度 28℃，培养转速 300 r/min，
诱导转速 200 r/min，诱导 10 d。发酵罐发酵条件 ：
发酵开始至 12 h ：温度 28℃，转速 400 r/min，通气
量 0.2 NM3/h。
12 h 至开始诱导 ：温度 28℃，转速 750 r/min，
通气量 1 NM3/h。开始诱导至诱导 10 d ：温度 23℃，
转速 750 r/min，通气量 1 NM3/h。
1.1.4 主要仪器 高速低温离心机和紫外分光光度
计（NANO Drop 2000）购自上海赛默飞世尔科技公
司。全温震荡培养箱（211B）购自上海智城分析仪
器制造有限公司。细胞电转化仪购自 Invitrogen 公司。
10 L 微生物全自动发酵罐（Bio-10JS）和甲醇检测流
加控制器（FC2002）购自上海保兴生物设备有限公
司。XK26 层析柱、Typhoon FLA 7000 IP 激光扫描成
像仪和 ImageQuant LAS 4000mini 超灵敏化学发光成
像仪购自美国 GE 公司。HD-3000 型紫外检测仪购
自上海嘉鹏科技有限公司。ELx800 酶标仪购自美国
Biotek reader 公司。
1.2 方法
1.2.1 HSA-ONC 融 合 基 因 的 序 列 优 化 与 载 体 构
建 通过 GenBank 查询 HSA（NM_000477.5）基因
序列和 ONC 基因序列（AF332139.1），选取两者的
的成熟肽碱基序列作为融合基因序列，于 HSA 和
ONC（按何庆等［12］方法突变糖基化位点）间插入
（Gly4Ser1）3 作为连接肽，对融合蛋白核苷酸序列
进行密码子偏好性优化设计并提高 GC 含量，采用
HSA 自身信号肽作为融合基因的分泌信号肽，序
列全长 2 187 bp，优化序列经全基因合成后分别构
建至分泌型毕赤酵母表达载体 pPIC9、pPIC9K 和
pPICZα-A，合成及构建由上海生工生物工程有限公
司进行。
1.2.2 工 程 酵 母 菌 的 制 备 与 筛 选 提 取 重 组 质
粒 pPIC9/HSA-ONC、pPIC9K/HSA-ONC 和 pPICZα-
A/HSA-ONC，Pme I 分别线性化后电转至新鲜制备的
酵母感受态细胞，将 pPIC9/HSA-ONC、pPIC9K/HSA-
ONC、pPICZα-A/HSA-ONC 分别转至 X-33、GS115 和
SMD1168 三种感受态中，转化方法参考 Invitrogen
公司毕赤酵母表达手册进行。其中含抗性载体为
pPIC9K（G418） 和 pPICZα-A（Zeocin）， 组 氨 酸 缺
陷型宿主菌为 GS115 和 SMD1168，载体与宿主菌株
组合后需要筛选标记方可进行阳性克隆筛选，实际
得到以下 7 种载体 - 宿主菌组合，依次为 ：pPICZα-
A/X-33、pPIC9/GS115、pPIC9K/GS115、pPICZα-
A/GS115、pPIC9/SMD1168、pPIC9K/SMD1168、
pPICZα-A /SMD1168。 转 化 的 感 受 态 细 胞 涂 布 不
同抗性平板进行阳性克隆筛选，其中转化 pPIC9、
pPIC9K 的 菌 液 涂 布 组 氨 酸 缺 陷 型 平 板， 转 化
pPICZα-A 菌液涂布于 pH7.5、含 Zeocin（100 μg/mL）
的 YPD 平板。28℃倒置培养 3 d，挑取单克隆进行
扩大培养，提取酵母基因组作为模板，使用 AOX 通
用引物进行 PCR 扩增，产物进行琼脂糖电泳鉴定并
测序（苏州金唯智生物科技有限公司）。
随机挑选 7 个组合中鉴定正确菌种分别接种到
10 mL YPG/50 mL 三角瓶中，于 28℃、250 r/min 振
荡培养 18-24 h（一级活化），当 OD600 值达到 10 时，
按 1% 接种至 100 mL BMGY /1 L 三角瓶中，继续于
28℃、280 r/min 培养 24 h 后进行甲醇诱导。每 12 h
补加一次甲醇（发酵液体积的 1%），培养条件调整
为 23℃、200 r/min。诱导 10 d 后，发酵液于 12 000
r/min 离心 10 min 后保留上清，Bradford 法测定上清
蛋白浓度，取 50 μL 上清进行 15% SDS-PAGE 检测
（下同），用 Typhoon FLA 7000 IP 激光扫描成像仪对
SDS-PAGE 电泳中蛋白条带进行灰度扫描，依据目
的条带所占比例进行定量，确定表达量最高的载体 -
宿主菌组合。
1.2.3 摇瓶发酵的最优条件试验 取表达量最高的
载体 - 宿主菌组合菌株进行一级活化，按 1% 接种
至 100 mL BMGY/1L 三角瓶中。培养基的 pH 分别为
5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。在 28℃、300 r/min 培养 24 h
后，加入终浓度为 1%（V/V）的甲醇开始诱导。转
速调整为 200 r/min，诱导温度分别设置为 20、23、
2015,31(10) 225杨刚刚等：豹蛙抗瘤酶与人血清白蛋白融合蛋白的毕赤酵母高效表达与活性测定
26℃，每 12 h 补加一次甲醇，补加体积为发酵液体
积的 1%。诱导 10 d 后测定发酵液上清蛋白浓度，
取 50 μL 上清进行 SDS-PAGE 检测，蛋白条带进行
灰度扫描和定量，实验重复 3 次。
1.2.4 10 L 发酵规模下最适培养基试验 取上述
表达量最高的菌种进行一级活化，取 400 mL 菌液
（OD600 值达到 20 左右）分别加入含有 4 L BSM 培
养基和 4 L LBSM 培养基的 10 L 发酵罐中，培养基
中分别添加 4 mL PTM1，设定发酵条件（依据摇瓶
最佳条件），发酵过程中控制 pH 为 7.0（流加氨水
和磷酸），调节通气量控制溶氧，必要时通入富氧
空气，发酵控制按发酵培养条件进行，当溶氧上升
时（培养基中甘油耗尽）按 DO 关联进行甘油补加，
当 OD600 值达到 600 左右时停止补甘油。饥饿 1 h 后
开始诱导，每升甲醇含 20 mL PTM2，诱导过程中控
制 DO 为 20%，温度 23℃，甲醇浓度 0.25%，诱导
10 d 后取 10 μL 发酵上清进行 SDS-PAGE，进行灰度
扫描和定量，检测 rHSA-ONC 表达情况。
1.2.5 rHSA-ONC 的分离纯化 以下步骤非特殊要
求，均在 4℃或冰上进行，优化的纯化条件如下 ：
双水相萃取 ：取 10 L 罐诱导 10 d 发酵液，于 4℃，
4 000×g 离心 30 min 收集上清，每升上清加入 385
g K2HPO4，搅拌至 K2HPO4 完全溶解后，边搅拌边
缓慢加入 372 mL 无水乙醇，混匀完全后于分液漏斗
中 -20℃静置过夜，形成上、中、下三层。上层经 0.22
μm 滤膜过滤，30 kD 膜包超滤除盐、除乙醇后进行
DEAE 弱阴离子交换层析。
离 子 交 换 层 析 ：层 析 柱 型 号 XK26， 层 析 填
料 DEAE Sepharose Fast Flow， 树 脂 装 填 量 为 150
mL， 取 100 mg 浓 缩 蛋 白 上 样（ 约 50 mL）， 以 1
mL/min 的流速上样至平衡（25 mmol/L Na2HPO4 溶
液，pH 7.0）后的层析柱（2.5 cm×20 cm），用含 25
mmol/L Na2HPO4 的不同浓度 NaCl 溶液进行分段洗脱
（pH7.0），紫外检测仪监控全程，SDS-PAGE 分析各
洗脱段组分，灰度扫描后定量。
1.2.6 Western blotting 分析 取纯化后 rHSA-ONC 进
行 SDS-PAGE，用电转仪将目的蛋白从凝胶转移至
PVDF 膜上，转膜结束后用脱脂奶粉封闭过夜，分
别用 HSA 山羊多抗一抗与 ONC 兔抗人一抗于室温
孵育 1 h，TBST 洗涤 3 次，再分别与对应的辣根过
氧化物酶（HRP）标记的 HSA 兔抗山羊二抗和 ONC
山羊抗兔二抗室温孵育 1 h，TBST 洗涤 3 次，超敏
ECL 底物发光显色，用 ImageQuant LAS 4000mini 扫
描仪和图像定量软件进行定量分析。
1.2.7 SRB 法 测 定 rHSA-ONC 对 癌 细 胞 活 性 的 影
响 人肝癌 7402 细胞的培养基为 RPMI-1640 培养
基，HeLa 和 RH-35 细胞的培养基为 DMEM 培养基，
均含 10% 的胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉
素（100 U/mL），用 0.25% 胰蛋白酶消化对数生长
期的细胞，将细胞稀释至 5×104 个 /mL，接种于 96
孔板中，每孔 100 μL，于 37℃、5% CO2、饱和湿度
条件下培养 24 h，弃去培养基，分别加入 200 μL 含
不同浓度 rONC 的培养基，设置无药物处理的对照
组和仅含培养基的调零组。于药物处理细胞 24h 后
SRB 法测定细胞活性，每个实验组设置 3 个复孔，
实验重复 3 次。
2 结果
2.1 重组表达质粒的鉴定
对 pPIC9/HSA -ONC、pPIC9K/HSA -ONC、
pPICZα-A/HSA-ONC 重组质粒进行酶切、PCR 和测序，
如 图 1 所 示。pPIC9/HSA-ONC、pPIC9K/HSA-ONC
经 Pme Ⅰ单酶切后出现一个 12 000 bp 左右条带，
pPICZα-A/HSA-ONC 经 Pme Ⅰ 单 酶 切 后 出 现 一 个
5 000 bp 左 右 条 带。pPIC9/HSA-ONC、pPIC9K/HSA-
ONC 经 Bst B I 和 Eco R I 双酶切后出现一个 9 000 bp
和 一 个 2 187 bp 左 右 条 带，pPICZα-A/HSA-ONC 经
Bam HI 和 Eco RI 双酶切后出现一个 3 000 bp 和一
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
10000
bp
3000
2000
1-4：分别为重组质粒 pPIC9/ HSA-ONC、Pme I 单酶切、Bst BI 和 Eco RI 双酶切、
PCR 扩增结果 ；5-8 ：分别为重组质粒 pPIC9K/ HSA-ONC、Pme I 单酶切、
Bst BI 和 Eco RI 双酶切、PCR 扩增结果 ；9-12 ：分别为重组质粒 pPICZα-A/
HSA-ONC、 Pme I 单 酶 切、Bam HI 和 Eco RI 双 酶 切、PCR 扩 增 ；M ：DNA
maker DL10000
图 1 重组表达质粒鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10226
个 2 187 bp 左右条带。利用载体通用引物进行 PCR
扩增，产物理论大小为 2 500 bp，结果与理论一致，
测序结果显示，序列与预期基因序列一致。
2.2 转化子验证及重组融合蛋白的表达
将 Pme I 线性化后的 pPIC9/HSA-ONC、pPIC9K/
HSA-ONC、pPICZα-A/HSA-ONC 重组质粒分别电转入
X-33、GS115、SMD1168 感受态细胞，经过涂板 - 培
养 - 筛选等过程获得单克隆。扩大培养后提取酵母
基因组 DNA，分别以基因组 DNA 进行 PCR，通过
琼脂糖凝胶电泳验证 PCR 产物，结果如图 2 所示。
重组菌株的基因组均能扩增出 2 500 bp 的特异条带
和 2 200 bp 的酵母自身条带（图 2-A）。特异条带的
大小与预期一致，测序结果正确，表明 HSA-ONC 已
成功整合入毕赤酵母基因组中。每个组合随机挑取
若干阳性克隆进行蛋白表达，取诱导 10 d 发酵液上
清进行 SDS-PAGE 检测（图 2-B）发现，有蛋白条
带高表达，其中位于 70 与 100 kD 间蛋白条带分子
量与预期相符（HSA+ 非糖基化 ONC 的理论分子量
为 78.3 kD），为目的条带。
ONC）的菌株在 1 L 摇瓶规模进行不同培养基 pH 和
诱导温度的表达条件优化，发酵结果如图 3 所示，
诱导 10 d 时，rHSA-ONC 的最佳表达条件为 ：23℃、
pH7.0，表达量最高为 235 mg/L
3000
bpA
B
2000
HSA-ONC
100
kD
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
70
50
rHSA-ONC
1：protein ladder；2：pPIC9/GS115；3：pPIC9K/GS115；4：PPICZα-A/GS115；5：
PPICZα-A/X33 ；6 ：pPIC9/SMD1168 ；7 ：pPIC9/SMD1168 ；8 ：PPICZα-
A/SMD1168
图 2 rHSA-ONC 菌株基因组 PCR 电泳图（A）和不同载
体 - 菌株组合诱导产物 SDS-PAGE（B）鉴定图
300
200
100
rH
SA
-O
N
C
/mg·L-1 
50
0
5.5 6 76.5
20ć 7.5150250 5.5 6 76.523ć 7.5 5.5 6 76.526ć 7.5
图 3 不同 pH 和诱导温度对 rHSA-ONC 表达量的影响
图 4 不同培养基对 rHSA-ONC 表达量的影响
BSM LBSM
rHSA-ONC
2.3 摇瓶规模表达条件的优化
选 取 表 达 量 最 高 组 合（pPICZα-A /X-33/HSA-
2.4 10 L规模不同培养基对rHSA-ONC表达的影响
取表达量最高组合菌株进行扩大培养，当菌体
OD600 达到 20 时，取 400 mL 菌液，接种到分别含
4 L BSM 和 4 L LBSM 的 10 L 发酵罐，培养基 pH 和
温度依据摇瓶最佳结果进行设定。待菌体 OD600 达
到 600 左右开始补甲醇，诱导 10 d 后，取 10 μL 发
酵液上清进行 SDS-PAGE 检测。结果（图 4）表明，
在 LBSM 培养基中诱导 10 d 时 rHSA-ONC 表达量最
高，达到 2.02 g/L。
2.5 rHSA-ONC的分离纯化
取 10 L 罐诱导 10 d 发酵液，离心收集上清，上
清经双水相萃取后形成上、中、下三层，用 SDS-
PAGE 分别检测三层的蛋白分布情况（图 5-B），取
rHSA-ONC 所在层进行 0.22 μm 过滤和 30 kD 超滤。
将浓缩样品用 DEAE 离子交换层析进一步分离纯化，
2015,31(10) 227杨刚刚等：豹蛙抗瘤酶与人血清白蛋白融合蛋白的毕赤酵母高效表达与活性测定
如图 5-A 所示，在凝胶层析过程出现 3 个蛋白洗脱
峰（P1、P2 和 P3）。rHSA-ONC 主要分布在洗脱液
峰 P2 中，灰度扫描后进行定量分析，rHSA-ONC 的
纯度大于 95%，收率高于 70%（图 5-B）。纯化后样
品经 Western blot 检测发现，rHSA-ONC 呈现 HSA 和
ONC 双阳性（图 5-C）。
16.17 μmol/L，与非糖基化 rONC IC50 相比，活性发
生明显下降（表 1）。
1 2 3 4 5 6 P1 P2 P3
rHSA-ONC
100
kD
70
50
1 2M
rHSA-ONC
0
0 15
P1 P2
P3
30 45 60 75
t/min
90 105 120 150135
0.1
0.2A
28
0/n
m 0.3
0.4
0.5A
B
C
（A）P1 ：平 衡 液 洗 脱 ；P2 ：25 mmol/L Na2HPO4+75mNaCl 洗 脱 ；P3 ：25
mmol/L Na2HPO4+1M NaCl 洗脱。（B）1：10 μg BSA；2：上清；3：双水相上相；
4 ：双水相中相 ；5 ：双水相下相 ；6 ：超滤浓缩液。（C）M ：蛋白 maker ；1 ：
HSA 抗体检测 rHSA-ONC ；2 ：ONC 抗体检测 rHSA-ONC
图 5 rHSA-ONC 离子交换层析检测谱图（A）、SDS-
PAGE 纯度鉴定（B）及 Western blotting 鉴定（C）
0.20 RH-35 7402 Hela
0.16
0.12
0.08
O
D
49
0
0.04
0.00
0 6
rHSA-ONC/μmol·L-112 24
图 6 rHSA-ONC 对 RH-35、7402、HeLa 细胞的抑制作
用图
表 1 rHSA-ONC 与 rONC 的 IC50 比较
Protein
Cell
RH-35 7402 HeLa
rONC 7.78 6.55 2.33
rHSA-ONC 19.44 18.56 16.17
3 讨论
宿主系统与外源基因密码子的差异性经常造
成基因沉默或蛋白表达量很低，对外源基因进行密
码子优化以适应宿主系统将有利于外源蛋白的表
达［17-19］，对酵母偏好性密码子的应用及发酵过程中
控制条件的优化是近几年提高外源蛋白表达量和活
性的常见手段，它们的应用也为外源蛋白在酵母系
统中的表达带来了新的发展［20，21］。
将两个不同的基因片段通过一段合适的连接肽
进行连接，可直接表达融合蛋白，融合蛋白通常具
有双重活性，但融合蛋白较原有蛋白会在功能与活
性上发生改变［22，23］。融合蛋白间引入的连接肽过长
则可能增加蛋白的免疫原性，还可能影响目的蛋白
的活性和功能 ；而过短的链间连接肽会在分子间造
成空间效应，可能影响蛋白的正确折叠［24，25］；因此
应当选择能够有效分隔融合蛋白两个功能基团的最
短连接肽。一般来说，3-5 个氨基酸的连接肽可满
足大多数融合蛋白的正确折叠需求，长度不宜超过
15 个氨基酸［26-28］，连接肽的柔性和疏水性能保证蛋
白质的功能结构域不受影响［29］。
2.6 rHSA-ONC的活性测定
不 同 浓 度 的 rHSA-ONC 处 理 细 胞 后，SRB 法
检测细胞的活力，结果（图 6）表明，6-24 μmol/L
的 rHSA-ONC 处理 RH-35、7402 和 HeLa 细胞后 24
h，细胞增殖明显受到抑制，表明 rHSA-ONC 能抑
制多种肿瘤细胞增殖且呈剂量依赖效应，对 HeLa、
7402、RH-35 细 胞 的 IC50 依 次 为 ：19.44、18.56、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10228
为 获 得 高 表 达 的 非 糖 基 化 rONC， 本 文 将
ONC（突变掉糖基化位点）与 HSA 的 C 端连接后
进行表达，采用目前普遍使用的柔性连接肽，即
（Gly4Ser1）3 作为融合蛋白间的连接肽，简称 HSA-
ONC。首先利用酵母密码子偏好性对融合序列进行优
化，同时提高序列 GC 含量，采用 HSA 的自身信号
肽作为分泌信号肽，构建 3 种表达载体 pPIC9/HSA-
ONC、pPIC9K/HSA-ONC、pPICZα-A/HSA-ONC，分别
转化酵母菌 X-33、GS115 和 SMD1168，筛选得到 7
种载体 - 受体菌组合，初步诱导后发现表达量最高
的 载 体 - 受 体 菌 组 合 为 pPICZα-A/X-33/HSA-ONC，
在摇瓶规模的最佳表达条件（23℃、pH 7.0）下，
诱导 10 d 时 rHSA-ONC 的表达量达到 235 mg/L。在
10 L 规模下使用 LS-BSM 培养基诱导 10 d 时，rHSA-
ONC 的最高表达量为 2.02 g/L，是等摩尔量条件下
非糖基化 rONC 表达量［12］的 2 倍，但仍低于 rHSA
的表达量（10 g/L）。经多次优化纯化条件后，采用
双水相偶联 DEAE 离子交换层析方法进行纯化，最
终得到了收率高于 70%、纯度≥ 95% 的 rHSA-ONC。
MTT 法检测发现 rHSA-ONC 能杀伤多种癌细胞，与
文献报道结果［9-12］的 ONC 作用一致，但对肿瘤细
胞的杀伤作用较 rONC 下降 60%。
本实验优化表达条件后获得了较高表达量的
rHSA-ONC（2.02 g/L），但仍明显低于 rHSA 的表达
量，经电泳检测发现，蛋白积累过程中有较多的目
的蛋白发生降解，目的蛋白的积累减少与之有关，
若能增强融合蛋白的稳定性，减少其降解，目的蛋
白的表达量可至少提高 1 倍。rHSA-ONC 的癌细胞
杀伤作用与 rONC 相比下降明显，可能与 HSA 分子
量较大，空间上干扰了 rONC 的折叠，进而影响其
活性。由此可见，蛋白的稳定性与活性与融合蛋白
间连接肽密切相关，我们将在本实验基础上进一步
研究不同长度或不同类型连接肽对融合蛋白的影响，
以得到表达量、稳定性明显提高，生物学活性较强
的 rHSA-ONC，为降低 ONC 的生产成本及产业化奠
定基础。
4 结论
本研究首次将 HSA 与 ONC（非糖基化）融合
后在真核系统进行重组表达，利用 HSA 的表达优势
和不同载体 - 宿主组合筛选得到高表达组合，优化
表达条件后最终表达量达到 2.02 g/L，是等摩尔量
条件下非糖基化 rONC 表达量的 2 倍，通过双水相
偶联柱层析快速高效地进行纯化。运用 SRB 法测定
rHSA-ONC 对癌细胞的抑制活性，rHSA-ONC 能杀伤
多种癌细胞，但活性低于 rONC。
参 考 文 献
［1］ Porta C, Paglino C, Mutti L. Ranpirnase and its potential for the
treatment of unresectable malignant mesothelioma［J］. Biologics,
2008, 2（4）：601-609.
［2］ Darzynkiewicz Z, Carter SP, Mikulski SM, et al. Cytostatic and
cytotoxic effects of Pannon（P-30 Protein）, a novel anticancer
agent［J］. Cell Tissue Kinet, 1988, 21（3）：169-182.
［3］ Ardelt W, Mikulski SM, Shogen K, et al. Amino acid sequence of
an anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos.
Homology to pancreatic ribonucleases［J］. J Biol Chem, 1991, 266
（1）：245-251.
［4］ 田雪 , 王庆诚 , 沈如凌 , 等 . Onconase 研究与开发的最新进
展［J］. 中国细胞生物学报 , 2010, 32（6）：927-934.
［5］ Leland PA, Schultz LW, Kim BM, Raines RT. Ribonuclease A
variants with potent cytotoxic activity［J］. Proc Nat Acad Sci USA,
1998, 95（18）：10407-10412.
［6］ Iohnson RJ, Chao TY, Lavis LD, et al. Cytotoxic ribonucleases ：The
dichotomy of coulombic forces［J］. Biochemistry, 2007, 46（36）：
10308-10316.
［7］ Chang CH, Gupta P, Michel R, et al. Ranpirnase（frog RNase）
targeted with a humanized, internalizing, anti-Trop-2 antibody has
potent cytotoxicity against diverse epithelial cancer cells［J］. Mol
Cancer Ther, 2010, 9（8）：2276-2286.
［8］ Qiao M, Zu LD, He XH, et al. Onconase downregulates microRNA
expression through targeting microRNA precursors［J］. Cell Res,
2012, 22（7）：1199-1202.
［9］ 汪楠 , 唐小军 , 熊四平 , 等 . 重组豹蛙酶的制备及其生物学特
性分析［J］. 南京医科大学学报 , 2013, 33（8）：1034-1038.
［10］ 胡晓珺 . 核糖核酸酶 Onconase 及其融合蛋白表达［D］. 上海：
华东理工大学 , 2012.
［11］ 郭红 , 徐殿胜 , 王庆诚 . 核糖核酸酶 Onconase 的稀释复性条
件优化研究［J］. 化学与生物工程 , 2013, 10（30）：57-60.
［12］ 何庆 . 糖基化和非糖基化 Onconase 在巴斯德毕赤酵母中的分
2015,31(10) 229杨刚刚等：豹蛙抗瘤酶与人血清白蛋白融合蛋白的毕赤酵母高效表达与活性测定
泌表达、纯化与活性鉴定［D］. 北京 ：中国人民解放军军事
医学科学院 , 2009.
［13］ 贾茜 , 刘文献 , 赵伟 , 等 . 一种重组人血清白蛋白的纯化方法
及其应用 ：中国 , 101768206A, 1［P］. 2008-12-30.
［14］ 徐存拴 , 史世领 , 史世会 , 等 . 一种表达人血清白蛋白的质粒
和重组菌以及它们的应用 ：中国 , 103194482A, 1［P］. 2013-
3-12.
［15］ Kratz F. Albumin as a drug carrier ：design of prodrugs, drug conj-
ugates and nanoparticles［J］. J Control Release, 2008, 132（3）：
171-183.
［16］ 王康 , 王强 , 张磊 . SRB 法和 MTT 法检测 PDGF-BB 对牛眼小
梁细胞增殖的影响［J］. 滨州医学院学报 , 2012, 35（1）：10-
12.
［17］ Mellitzer A, Weis R, Glieder A, et al. Expression of lignocellulolytic
enzymes in Pichia pastoris［J］. Microb Cell Fact, 2012, 2012（11）：
61-72.
［18］ Sygmund C, Gutmann A, Krondorfer I, et al. Simple and efficient
expression of Agaricus meleagris pyranose dehydrogenase in Pichia
pastoris［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 94（3）：695-
704.
［19］ Abad S, Nahalka J, Winkler M, et al. High-level expression of
Rhodotorula gracilis D-amion acid oxidase in Pichia pastoris［J］.
Biotechnol Lett, 2011, 33（3）：557-563.
［20］ Spatz SJ, Volkening JD, Mullis R, et al. Expression of chicken
parvovirus VP2 in chicken embryo fibroblasts require codon
optimization for production of naked DNA and Vecored meleagrid
herpesvirus type 1 vaccine［J］. Virus Genes, 2013, 47（2）：
259-267.
［21］ Park S, Pack SP, Lee J. Expression of codon-optmiazed phosphoen-
olpyruvate carboxylase gene from Glaciecola sp. HTCC2999 in Es-
cherichia coli and its application for C4 chemical production［J］.
Appl Biochem Biotech, 2012, 167（7）：1845-1853.
［22］ Geng SS, Feng J, Li Y, et a1. Binding activity difference of anti-
CD20 scFv-Fc fusion protein derived from variable domain
exchange［J］. Cell Mol Immunol, 2006, 3（6）：439-443.
［23］ Tranchant I, Herve AC, Carlisle S, et a1. Design and synthesis
of ferrocene probe molecules for detection by electrochemical
methods［J］. Bioconjug Chem, 2006, 17（5）：1256-1264.
［24］ Gustavsson M, Lehtiö J, Denman S, et a1. Stable linker peptides
for a cellulose-binding domain-lipase fusion protein expressed in
Pichia pastoris［J］. Protein Eng, 2001, 14（9）：711-715.
［25］ Le Gall F, Reusch U, Little M, et a1. Effect of linker sequences
between the antibody variable domains on the formation, stability
and biological activity of a bispecific tandem diabody［J］. Protein
Eng Des Sel, 2004, 17（4）：357-366.
［26］ Hu W, Li F, Yang X, et al. A flexible peptide linker enhances the
immunoreactivity of two copies HBsAg preSl（21-47）fusion
protein［J］. J Biotechnol, 2004, 107（1）：83-90.
［27］ Ha SH, Park JJ, Kim JW, et al. Molecular cloning and high-level
expression of G2 protein of hantaan（HTN）virus 76-118 strain in
the yeast Pichia pastoris KM71［J］. Virus Genes, 2001, 22（2）：
167-173.
［28］ Arai R, Ueda H, Kitayama A, et al. Design of the linkers which
effectively separate domains of a bifunctional fusion protein［J］.
Protein Eng, 2001, 14（8）：529-532.
［29］ Wriggers W, Chakravarty S, Jennings PA. Control of protein
functional dynamics by peptide linkers［J］. Biopolymers, 2005,
80（6）：736-746.
（责任编辑 李楠）