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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(2):217-221
微生物细胞的脂肪酸组成与 DNA 具有高度的同
源性，不同属种的微生物具有不同的脂肪酸指纹图
谱［1］。Able 等［2］（1963 年）提出细菌脂肪酸的分析
可以应用于细菌的系统分类鉴定 ；Oyama（1963 年）
采用气液色谱法（Gas Liquid Chromatography，GLC）
应用于微生物细胞脂肪酸的测定。由于 GC 法可检
测成分比浓度在 ng（10-9）甚至 pg（10-12）含量［3，4］，
具有较高的灵敏度，因此，该项检测技术广泛应用
于细菌的鉴定和辨别［5］。Sherlock MIS 系统是美国
MIDI 公司成功开发的一套自动化分析细胞脂肪酸的
微生物鉴定系统，使脂肪酸检测结果更加快捷准确，
并且，检测结果可与系统内数据库进行快捷比对分
收稿日期 ：2014-10-04
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31100582），河南省基础与前沿技术研究计划项目（102300413217）
作者简介 ：何蔚荭，女，高级实验师，研究方向 ：微生物系统分类与鉴定 ；E-mail ：heweihong-70@163.com
通讯作者 ：王亚南，女，博士，副研究员，研究方向 ：环境微生物菌种资源开发与应用 ；E-mail ：wangyanan@mail.tsinghua.edu.cn
血液杆菌 Haematobacter sp. 细胞脂肪酸测定的
影响因素
何蔚荭1  安明理1  陈国参1  贾彬1，3  吴晓磊2  王亚南1
（1. 河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南省微生物工程重点实验室，郑州 450008 ；2. 北京大学工程学院，北京 100871 ；
3. 深圳大学生命科学学院，深圳 518060）
摘 要 ： 应用美国 MIDI 公司 Sherlock MIS 系统检测一株归属于血液杆菌属的新菌种 Haematobacter sp. HNMC11807 的细胞脂
肪酸组成，探讨不同培养方法和条件对其细胞脂肪酸组成的影响。采用不同培养条件培养微生物细胞，即不同的培养基组成、固
液类型和培养时间 ；分析比较细胞脂肪酸检测结果存在的差异。同时对比分析仪器专用的两种检测体系，即常规标准和快速标准
体系，对样品脂肪酸测定结果的影响。结果发现，细胞脂肪酸组成与其培养条件密切相关，且差异显著。因此，在应用该系统做
微生物分类鉴定时，必需严格遵守特定的、统一的培养条件平行进行。
关键词 ： 细胞脂肪酸检测 ；培养基条件 ；脂肪酸标准品 ；血液杆菌
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.032
The Influence Factors of Determination of Haematobacter sp.
Cellular Fatty Acids
He Weihong1 An Mingli1 Chen Guocan1 Jia Bin1，3 Wu Xiaolei2 Wang Yanan1
（1. Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province，Zhengzhou 450008 ；2. College of Engineering，Peking University，
Beijing 100871 ；3. College of Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060）
Abstract ： Cellular fatty acid composition of strain HNMC11807, a novel species belong to Haematobacter sp., were detected by
used Sherlock MIS system of MIDI company USA. The influence by different culture methods and cells growth conditions on cells fatty acid
composition were explored in this article. Based on the bacterial cells cultured in varied medium such as in different medium components and
in solid or liquid medium, the cellular fatty acid composition were respectively analysed and compared. On the same time, two standard systems
in this instrument, conventional and fast, were used to run samples, and the detect results of the cellular fatty acid composition were compared
respectively. As the results, the cells fatty acid composition was closely related with culture condition and a significant differences. The cellular
fatty acid composition must be carried out in specified and unified culture conditions when this system was used in microbial classification.
Key words ： determination of cells fatty acids ；condition of medicum ；standards of fatty acids ；Haematobacter sp.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2218
析，以判别微生物细胞的种属。
大量的报道显示，微生物细胞生长过程中，细
胞脂肪酸组成呈动态变化，多数报道认为，细胞中
不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸组成，随细胞生长环境
条件，如温度、pH 或各种生长因子存在状况的变
化，以及生长期等发生改变［6-9］。为避免培养条件
和提取脂肪酸操作过程引起检测结果的波动，提高
细胞脂肪酸检测结果应用于分类鉴定的准确性，使
测定结果与系统数据库的比对具有严谨的分析意
义，MIDI 公司为脂肪酸鉴定系统制定了一套严格
的操作规范，从培养基和培养条件的标准化，到细
胞脂肪酸提取处理过程的标准化。尽管如此，在实
际试验过程中，仍会出现一些与标准要求有偏差
的操作［10，11］，比如生长期较长的细胞、固态培养
基难以生长的细胞、标准培养基中不生长的细胞
等［12］。本研究尝试在一株归属为血液杆菌属的新菌
种 Haematobacter sp. HNMC11807 的鉴定中，采用不
同的试验条件和方法对比细胞脂肪酸的检测结果，
探讨更为有效的、更具有可比性的细菌脂肪酸的检
测方法和条件，旨在为细胞脂肪酸检测体系应用于
微生物的系统分类与鉴定提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 一株分离自油田采油回注水的微
生物菌株，编号 HNMC11807（北京大学供试菌株）。
依据该菌株细胞 16S rDNA 序列比对分析结果，应归
属于 Haematobacter（血液杆菌属）的一个新物种，
即 Haematobacter sp. HNMC11807。
1.1.2 培养基和试剂
1.1.2.1 细胞培养基 菌株活化和传代培养采用 LB
培养基（10 g 蛋白胨，5 g 酵母粉，10 g NaCl，1 000
mL H2O，pH7.0 ；其中有机类试剂采用安琪酵母股份
有限公司产品）。脂肪酸测定采用 TSB（Tryptone Soy
Broth）培养基（北京奥博星生物技术有限公司）和
E2216 培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）。
试验中的 TSA 培养基为 TSB 培养基加入琼脂后的固
体培养基。
1.1.2.2 脂肪酸提取用试剂 溶液 I：45 g NaOH，150
mL 甲醇，150 mL 超纯水 ；溶液 II ：325 mL HCl（6.0
mol/L），275 mL 甲醇 ；溶液 III ：200 mL 己烷，200
mL 甲 基 三 丁 基 乙 醚 ；溶 液 Ⅳ ：10.8 g NaOH，900
mL 超纯水。
1.2 方法
1.2.1 细菌细胞脂肪酸的提取［13］ 按照 MIDI 公司
微生物鉴定系统的操作步骤。TSA（TSB 加入琼脂）
培养基新鲜培养（设定的温度和培养时间）的待测
菌株细胞。刮取 20-40 mg 菌体，置于试管，加入 1
mL 溶液Ⅰ，充分振荡后，>95℃水浴 30 min ；冰水
迅速冷却，加入 2 mL 溶液Ⅱ，振荡混匀后 80℃水
浴 10 min ；冰水迅速冷却，加入 1.25 mL 溶液 III，
上下颠倒 10 min，静置分层后，吸取液相上层部分；
加入 3 mL 溶液Ⅳ，上下颠倒 5 min，2 000 r/min 离
心 3 min，静置吸取上层液体于 GC 样品瓶中，4℃
放置待测。
1.2.2 脂肪酸成分检测 采用美国 Agilent 6850 N
型气相色谱系统，包括全自动进样装置、石英毛细
管柱及氢火焰离子化检测器 ；通过细菌细胞脂肪酸
成分进行细菌鉴定的分析软件采用 Sherlock MIS4.5
（Microbial Identification System） 和 LGS4.5（Library
Generation Software）（均为美国 MIDI 公司产品）。在
下述气相色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标
样和全细胞脂肪酸待检样本，分析条件为 ：柱箱温
度 170℃起，升至 310℃稳定 ；检测器温度 300℃ ；
进样口温度 250℃，常规标准压力 10 psi，快速标准
27.3 psi；载气为氢气（30 mL/min）、尾吹气为氮气（30
mL/min）；进样量为常规标准 1 μL，快速标准 5 μL。
2 结果
2.1 培养基组成类型对细胞脂肪酸组成的影响
按照 MIDI 公司脂肪酸测定体系应采用 TSA 培
养基，而该菌株归属的 Haematobacter 菌属的模式菌
株 Haematobacter massiliensis（马赛血液杆菌）细胞
的脂肪酸测定采用 E2216 培养基。本试验采用 TSA
和 E2216 培养基平行进行菌株 HNMC11807 细胞培
养与脂肪酸提取和检测，分析不同培养基组成对培
养细胞的脂肪酸组成影响。结果（表 1）显示，细
胞中含量最高的长链脂肪酸（18 ：1 ω7c）差异最显
著。数据库比对分析也显示出不同聚类结果，因此，
不同培养基成分对细胞脂肪酸组成具有显著影响。
2015,31(2) 219何蔚荭等 ：血液杆菌 Haematobacter sp. 细胞脂肪酸测定的影响因素
肪酸组成呈动态变化。在 MIDI 系统的标准检测中，
为排除培养时间对细胞脂肪酸组成的影响，一般要
求培养时间为 2 d。本试验为探讨细胞培养时间对细
胞脂肪酸组成的影响，采用 E2216 固体培养基，平
行进行菌株 HNMC11807 细胞 48 h 和 72 h 培养与脂
肪酸提取和检测。结果（表 3）显示，细胞培养时
间延长，其细胞长链脂肪酸含量显著增加，与之前
学者的研究结果一致。因此，细胞生长期对脂肪酸
组成的检测结果有显著的影响，不同培养时间的细
胞脂肪酸组成检测结果不具有严格的可比性。
表 3 菌株 HNMC11807 于 E2216 培养基 28℃培养细胞脂
肪酸测定结果
序号 Peak Name
48 h 72 h
1 2 1 2
1 10 ：0 3OH 4.25 4.55 3.72 2.41
2 16 ：0 10.70 10.34 11.41 9.25
3 18 ：0 6.35 6.07 4.22 4.23
4 18 ：1ω7c 67.00 67.44 78.40 78.00
5 18 ：1ω7c 11-methyl 10.60 10.39 2.24 5.21
注 ：表中加粗部分标注了差异性 >5 的脂肪酸
2.4 检测器进样量对细胞脂肪酸组成的影响
MIDI 公司脂肪酸测定体系设置了两种标准品的
检测项，即常规检测标准品和快速检测标准品，两
种标准品的脂肪酸组成配置没有显著差别（表 4），
但在进样量方面，快速检测体系高于常规检测体系
5 倍 ；在检测时间方面，快速检测体系柱分析时间
低于常规检测体系。由于进样量的增加，快速检测
体系可以提高样品的可检测性，对检测结果的影响
需探讨确认。本试验将菌株 HNMC11807 于 E2216
固体培养基 28℃、48 h 培养，提取并采用不同的检
测体系和标准品检测细胞脂肪酸组成，对比分析两
种检测体系的测定，结果（表 5）显示，由于进样
量的提高，快速检测体系能够检测到更多微量成分
（如含量 <1% 的脂肪酸）。但是，对比分析具有可比
性意义的脂肪酸检测结果（即含量 >1%-5% 的脂肪
酸），发现快速检测体系与常规检测体系没有显著的
差异（表 5 中黑体标注的脂肪酸），同时数据库给出
的比对分析结果也非常一致。因此，在实际检测中
两种体系均可以使用，只是跨体系的检测结果比较
时存在微小的误差。建议作为新菌种鉴定指标比对
表 1 菌株 HNMC11807 于 28℃培养 48 h 细胞脂肪酸测定
结果
序号 Peak Name
TSA E2216
1 2 1 2
1 10 ：0 3OH 6.18 5.89 4.25 4.55
2 16 ：0 9.20 10.22 10.70 10.34
3 16 ：1ω7c/16 ：1ω6c 1.94 - - -
4 18 ：0 4.98 4.28 6.35 6.07
5 18 ：1ω7c 72.80 73.36 67.00 67.44
6 18 ：1ω7c 11-methyl 4.36 4.24 10.60 10.39
注 ：表中加粗部分标注了差异性 >5 的脂肪酸
2.2 培养基固液类型对细胞脂肪酸组成的影响［14］
按照 MIDI 公司脂肪酸测定体系应采用固体培
养基，培养并获得菌体细胞。但有些微生物细胞适
合液体培养，而在固体培养基中生长很差，难以在
规定的时间内生长至稳定期、获得足够量的细胞。
由于液体培养基比较适合微生物细胞生长过程中的
各种生理生化水解反应，更有利于多数微生物细胞
的生长繁殖，因此，细胞生长速度在液体培养基中
可能高于在固体培养基中，从而造成细胞脂肪酸组
成的差异。本试验采用 E2216 的液体和固体培养基
平行进行菌株 HNMC11807 细胞培养与脂肪酸提取
和检测，结果见表 2。据资料报道，随着细胞生长
过程中，长链脂肪酸的积累逐渐增加，短链脂肪酸
则相反［15］。表 2 显示，液体培养显著高于固体培养
细胞的长链脂肪酸含量，这一结果可能与细胞的生
长速度有关，即液态培养细胞生长速度较快。
表 2 菌株 HNMC11807 于 E2216 培养基 28℃培养 48 h 细
胞脂肪酸测定结果
序号 Peak Name
液态 固态
1 2 1 2
1 10 ：0 3OH 3.89 3.46 4.25 4.55
2 16 ：0 12.22 11.55 10.70 10.34
3 18 ：0 4.28 5.02 6.35 6.07
4 18 ：1ω7c 77.36 76.47 67.00 67.44
5 18 ：1ω7c 11-methyl 2.24 3.09 10.60 10.39
注 ：表中加粗部分标注了差异性 >5 的脂肪酸
2.3 培养时间对细胞脂肪酸组成的影响
已有的研究结果表明，微生物细胞生长初期小
分子脂肪酸含量较高，随培养时间延长，大分子脂
肪酸逐渐增加并积累，不同生长期的微生物细胞脂
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2220
分析数据时，最好在相同的检测体系下完成。
表 4 2 种标准品脂肪酸组成的检测结果
序号 Peak Name
常规标准品 快速标准品
1 2 1 2
1 9 ：0 5.37 5.41 5.42 5.38
2 10 ：0 10.71 10.60 10.43 10.69
3 10 ：0 2OH 2.18 2.19 2.29 2.20
4 10 ：0 3OH 1.09 1.08 1.13 1.08
5 11 ：0 5.39 5.36 5.46 5.38
6 12 ：0 10.76 10.78 10.91 10.72
7 13 ：0 5.35 5.38 5.37 5.38
8 14 ：0 10.72 10.77 10.62 10.75
9 14 ：0 2OH 2.16 2.17 2.14 2.17
10 14 ：0 3OH/16 ：1 iso I 1.11 1.10 1.12 1.13
11 16 ：0 10.74 10.73 10.64 10.71
12 16 ：0 2OH 2.22 2.21 2.21 2.20
13 17 ：0 5.35 5.34 5.41 5.39
14 18 ：0 10.76 10.74 10.77 10.71
15 19 ：0 5.39 5.37 5.39 5.36
16 20 ：0 10.70 10.75 10.70 10.75
2.5 不同处理条件对细胞脂肪酸含量影响强度对比
综上可知，不同处理方法对细胞脂肪酸组成有
不同程度的影响，针对本试验的菌株 Haematobacter
sp. HNMC11807 的脂肪酸测定结果对比（表 6）表明，
对细胞脂肪酸影响的幅度分别为细胞培养时间 > 液
体培养基培养 > 不同成分培养基培养 >> 检测体系差
别，进一步分析认为，在同一温度条件下，细胞的
菌龄是影响细胞脂肪酸组成的关键因素。我们认为，
以 MIDI 分析系统测定的细胞脂肪酸数据为分类学
依据时，除了两种标准品应用对检测体系影响较低
外，其它不同处理条件的结果间差异非常显著，分
析时必需采用完全一致的条件平行培养和处理细胞，
否则其脂肪酸检测结果不具有分类学意义上的可
比性。
表 6 不同处理条件对细胞脂肪酸含量测定结果的影响幅度
处理方法 18 ：1ω7c 18 ：1ω7c 11-methyl 影响幅度排序
培养基组成 5.36-6.36（+） 6.03-6.36（-） 3
液态培养基 9.03-10.36（+） 7.30-8.36（-） 2
培养时间延长 10.56-11.40（+） 5.18-8.36（-） 1
快速检测体系 1.47-2.68（-） 0.23-1.00（-） 4
注 ：表中值为不同处理条件与标准条件测定结果差的幅度近似范围，其中
（+）增量差别 ；（-）减量差别
3 讨论
通 过 对 归 属 于 血 液 杆 菌 属 的 一 个 新 物 种
Haematobacter sp. HNMC11807 细胞脂肪酸检测分析，
探讨了培养基组成、培养基固液类型、培养时间对
细胞脂肪酸组成的影响，同时还探讨了两种检测体
系获得的细胞脂肪酸检测结果的可比性，发现细胞
的生长期对脂肪酸的检测结果影响最为显著。因此，
在应用全细胞脂肪酸分析结果进行物种分类鉴定时，
需要严格控制细胞生长期 ；不同培养基类型（组成
类型和形态类型）培养的细胞和不同生长期的细胞，
其脂肪酸的检测结果不具有可比性，在分类鉴定中
不能作为比对分析的依据。在细胞脂肪酸的气相检
测中，采用快速检测体系或常规检测体系并不影响
结果的正确性，但在微生物分类鉴定时，待鉴定细
胞与参比细胞应采用相同的体系检测脂肪酸组成，
以确保比对结果分析的可靠性和严谨性。
4 结论
微生物细胞脂肪酸的组成和含量与细胞的生境
表 5 菌株 HNMC11807 于 E2216 固体培养基 28℃培养
48 h 细胞脂肪酸测定结果
序号 Peak Name
标准品 快速标准品
1 2 1 2
1 9 ：0 - - - 0.73
2 10 ：0 - - - 0.38
3 10 ：0 3OH 4.25 4.55 4.54 4.19
4 12 ：0 - - - 0.62
5 14 ：0 - - 0.17 0.60
6 14 ：0 3OH/16 ：1 iso I - - 0.22 -
7 15 ：1ω5c - - 0.25 -
8 16 ：0 10.70 10.34 10.14 10.10
9 16 ：0 iso - - 0.20 -
10 16 ：1ω7c/16 ：1ω6c - - 0.47 -
11 17 ：0 - - 0.69 0.80
12 17 ：1 anteisoω9c - - 0.28 -
13 18 ：0 6.35 6.07 6.07 6.32
14 18 ：0 3OH - - 0.67 -
15 18 ：1ω5c - - 0.12 -
16 18 ：1ω7c 67.00 67.44 65.53 64.76
17 18 ：1ω7c 11-methyl 10.60 10.39 10.16 9.60
18 19 ：0 10-methyl - - - 1.25
19 20 ：0 - - - 0.67
20 20 ：1ω7c - - 0.49 -
注 ：表中加粗部分标注了含量 >1% 的脂肪酸
2015,31(2) 221何蔚荭等 ：血液杆菌 Haematobacter sp. 细胞脂肪酸测定的影响因素
和生长阶段密切相关。在细胞脂肪酸检测和数据分
析中，应重视影响细胞生长速度的各种环境条件和
因素（如培养基组成成分、培养基类型和培养温度、
时间等），严格同等的细胞生长条件所获得的细胞脂
肪酸的检测数据才具有鉴定学意义的可比性。
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（责任编辑 马鑫）