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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):106-110
油菜素内酯是一类甾醇类激素，其在植物的生
长发育及耐逆性方面起着重要作用［1-3］。研究表明，
盐碱、干旱等逆境胁迫条件下外施油菜素内酯可提
高植物的耐逆性［4，5］。但植物体内油菜素内酯水平
的高低主要是通过原位油菜素内酯代谢相关基因的
表达来调控［6］。BAS1 基因编码一个细胞色素 P450
（CYP72B1），过量表达导致油菜素内酯 C-26 羟基羟
化，但 C-26 羟化后的油菜素内酯生物活性远低于正
常油菜素内酯［7，8］，因此 BAS1 作为 C-26-羟化酶，
是一个重要的油菜素内酯失活基因［7，9，10］，影响植
物体内活性油菜素内酯含量。
作物根系是植株的支柱，是作物吸收养分和水
分的主要器官，还是盐碱、干旱等逆境胁迫首先作
用的器官，逆境通过影响根系生理功能从而影响植
株地上部的生长发育乃至产量形成［11，12］。但由于根
系生长的特殊性及研究技术手段的局限，目前关于
根系对逆境的响应以及根系的改良研究较少，关于
根系油菜素内酯基因 BAS1 在逆境调控中的作用尚
收稿日期 ：2014-11-01
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31201139），国家转基因专项（2011ZX08005-001），江苏省自主创新基金项目［CX（14）2065］
作者简介 ：束红梅，女，博士，副研究员，研究方向 ：作物基因功能和耐逆生理 ；E-mail ：shuhm1982@163.com
通讯作者 ：倪万潮，男，硕士，研究员，研究方向 ：作物基因技术 ；E-mail ：nwchao2002@aliyun.com
油菜素内酯基因 BAS1 根系表达载体的构建及烟草的
遗传转化
束红梅  郭书巧  巩元勇  倪万潮
（江苏省农业科学院经济作物研究所 农业部长江下游棉花与油菜重点实验室，南京 210014）
摘 要 ： 为使油菜素内酯基因 BAS1 在根系特异表达。首先构建含有根系启动子 TobRB7 的根系表达载体 pCAMBIA2301-
RB7-rbc。再将获得的油菜素内酯失活基因 BAS1 与其整合，得到 BAS1 基因的根系特异表达载体 pCAMBIA2301-RB7-BAS1-rbc，通
过农杆菌侵染转入烟草。经 PCR 和 RT-PCR 验证，目的基因 BAS1 已成功转入烟草，并在根系表达，转基因植株中根系油菜素内
酯受体激酶基因 BRI1 的表达受到影响。
关键词 ： BAS1 基因 ；根系表达载体构建 ；转基因植株 ；表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.015
Construction of Root Expression Vector of Brassinosteroid Gene BAS1
and Genetic Transformation into Tobacco
Shu Hongmei Guo Shuqiao Gong Yuanyong Ni Wanchao
（Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Cotton and Rapeseed of Ministry of Agriculture，
Nanjing 210014）
Abstract: In order to allow brassinosteroid gene BAS1 overexpress in root, the root expression vector pCAMBIA2301-RB7-rbc with root
promoter TobRB7 was constructed. Then inactivated gene BAS1 was integrated into the root overexpression vector pCAMBIA2301-RB7-BAS1-
rbc, and they were transformed into tobacco by Agrobactrium tumefaciems infection. With the verification by PCR and RT-PCR, the target gene
BAS1 was transformed into tobacco genome successfully, and expressed in root ；the expression of brassinosteroid receptor kinase gene BRI1 in
roots of transgenic plants was affected.
Key words: BAS1 gene ；construction of root expression vector ；transgenic plants ；expression
2015,31(6) 107束红梅等：油菜素内酯基因 BAS1根系表达载体的构建及烟草的遗传转化
未见报道。为此，本研究利用烟草根组织特异性表
达基因 TobRB7 启动子［13，14］构建油菜素内酯失活
基因 BAS1 的根系特异表达载体，旨在为研究油菜
素内酯基因 BAS1 的功能奠定基础，并为作物耐逆
改良提供新途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 种子、载体和菌株 烟草、拟南芥种子和
pCAMBIA2301， 大 肠 杆 菌 DH5α 以 及 农 杆 菌 菌 株
EHA105 为江苏省农业科学院经济作物研究所保存。
1.1.2 主要试剂　限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶
是 TaKaRa 公司产品。胶回收试剂盒、质粒提取试
剂盒是 AXYGEN 产品。
1.2 方法
1.2.1 TobRB7 基因启动子的克隆及根系表达载体
的构建 以烟草为材料，用 CTAB 法提取 DNA 并以
其为模板，从公布的烟草基因组数据库中 TobRB7
基 因（GenBank No. S45406） 启 动 子 区 域 设 计 引
物，PCR 扩增 TobRB7 启动子序列。在引物两端分
别引入 EcoR I 和 Sac I 酶切位点，引物序列如下 ：
TobRB7-F1 ：5-GGAATTCGGCATACTTTTAGAATG
CGT-3 ；TobRB7-R1 ：5-CGAGCTCTTCTCACTAGA
AAAATGCCC-3。PCR 反 应 程 序 为 ：94℃ 预 变 性 5
min ；94℃ 变 性 30 s，56℃ 复 性 45 s，72℃ 延 伸 1
min，共 35 个循环 ；再 72℃延伸 10 min。
将 PCR 产 物 和 质 粒 pCAMBIA2301-35s-rbc 在
37℃ 条 件 下 分 别 用 EcoR I、Sac I 双 酶 切 3 h， 酶
切产物分别进行 1% 琼脂糖凝胶电泳分析，回收
892 bp 的 TobRB7 的 启 动 子 序 列 和 12 kb 的 质 粒
pCAMBIA2301-35s-rbc 酶切后的大片段，用 T4 DNA
连接酶 4℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，挑取在卡那霉素（Kan）抗性平板上长
出的单克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。
1.2.2 BAS1 基因的克隆 以野生型拟南芥植株为
材 料， 用 Trozol 提 取 总 RNA， 以 反 转 录 的 cDNA
为模板。根据已报道拟南芥 BAS1 基因（GenBank
No. NM_128228.3）mRNA 序 列 设 计 引 物，PCR 扩
增 BAS1 编码区的全长片段。在引物两端分别引入
Xba I 和 Kpn I 酶切位点，引物序列如下 ：BAS1-F1 ：
5-TGCTCTAGAAAGAAACCAAACTCGCAAAG-3 ；
BAS1-R1 ：5-CGGGGTACCTTCCAAGTCCGGAACA
AA-3。PCR 反应程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变
性 30 s，52℃复性 45 s，72℃延伸 2 min，共 35 个循环；
再 72℃延伸 10 min。将扩增产物连接到 pTG19-T 载
体上，并送至 Invitrogen 公司测序。用于构建 BAS1
基因的根系表达载体。
1.2.3 农杆菌转化及转基因植株的检测 将重组表
达载体转化农杆菌感受态细胞，挑取在 Rif 和 Kan
抗性平板上生长的单菌落进行 PCR 鉴定。将含有
重组表达载体的农杆菌采用叶盘转化法转化烟草，
对当代转基因植株（T0 代）进行 PCR 检测。采用
CTAB 法小量提取烟草基因组 DNA，以 BAS1 基因引
物 BAS1-F2 ：5-AAGAAACCAAACTCGCAAAG-3 和
BAS1-R2 ：5-TTCCAAGTCCGGAACAAA-3 检测转基
因植株。
收获后对 T1 代种子在含有 Kan 的 MS 培养基上
筛选阳性苗，并进行 RT-PCR 分析。用 Trozol 提取
烟草的总 RNA，以反转录的 cDNA 为模板。对转基
因植株 BAS1 基因进行表达分析，引物为 BAS1-F3 ：
5-ACGGTGAAGTTGAGGTAGA-3 和 BAS1-R3 ：5-
AACATAAGGACGGTAGGTG-3，BRI1 基因（GenBa-
nk No. EF623823）的引物为 BRI1-F1 ：5-GAGGGA-
TTAGACAGGAACAG-3 和 BRI1-R1 ：5-CAGGAAT-
AGGTCCAGTGAGA-3。 以 actin 基 因（GenBank No.
EU938079）为内部参照基因（469 bp），引物为 act-
in-F：5-CCTCTTAACCCGAAGGCTAA-3，actin-R：5-
GAAGGTTGGAAAAGGACTTC-3。
2 结果
2.1 TobRB7启动子的植物根系特异表达载体的构建
通过 PCR 扩增获得的 TobRB7 基因启动子片段
与质粒 pCAMBIA2301-35s-rbc 重组，获得的根系表
达载体命名为 pCAMBIA2301-RB7-rbc。对重组质粒
酶切出现 890 bp 左右的目的条带（图 1），说明启动
子片段与质粒重组成功。
2.2 BAS1基因编码区全长的克隆及其根系表达载
体的构建
根据 BAS1 基因序列的开放阅读框（ORF）获
得目的片段，通过核苷酸测序后发现扩增获得的基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6108
因片段全长为 1 790 bp。将带有酶切位点的 BAS1 基
因 PCR 扩 增 产 物 和 质 粒 pCAMBIA2301-RB7-rbc 在
37℃条件下分别用 Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切，酶切产
物回收后连接，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，
挑取单克隆，进行酶切鉴定。酶切结果（图 2）显
示，重组表达载体经双酶切得到两条带的长度分别
与 pCAMBIA2301-RB7-rbc 载体和 BAS1 基因的长度
一致，说明油菜素内酯失活基因 BAS1 的根系重组
表达载体 pCAMBIA2301-RB7-BAS1-rbc 构建成功。
基因的表达结果（图 5）表明，在未转基因植株中
没有检测到目的基因，组成型过量表达的转基因植
株中 BAS1 基因在根系、叶片均有表达，而根系特
异表达载体使 BAS1 基因仅在根系特异表达，在叶
中基本不表达。进一步分析油菜素内酯受体激酶基
因 BRI1 的表达情况，相较于未转基因植株，组成型
表达 BAS1 的转基因植株中 BRI1 基因的表达量下降，
M 1 2 3
2000
bp
1000
750
M ：DNA Marker DL2000 ；1-3 ：构 建 的 pCAMBIA2301-RB7-rbc 载
体酶切产物
图 1 pCAMBIA2301-RB7-rbc 酶切鉴定
M 1 2 3
2000
bp
1000
750
M ：DNA Marker DL2000 ；1-3 ：构 建 的 pCAMBIA2301-RB7-BAS1-
rbc 载体酶切产物
图 2 重组载体 pCAMBIA2301-RB7-BAS1-rbc 酶切结果
2.3 转基因植株鉴定及BAS1基因在烟草中的表达
对转基因植株（T0 代）进行 PCR 检测，结果
（图 3）显示有 10 棵 T0 代转基因苗扩增出了 1 790
bp 的条带，表明油菜素内酯基因 BAS1 已整合到烟
草基因组中。转基因植株生长状况（图 4）显示，
BAS1 组成型表达的转基因烟草植株出现矮化，但是
根系特异表达的转基因烟草生长正常。
T1 代转基因植株收获得到的种子在含有 Kan 的
MS 培养基上筛选阳性苗，并进行表达分析。BAS1
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + -
2000
bp
1000
750
M ：DNA Marker DL2000 ；1-10 ：转基因植株 PCR 检测结果 ；
+ ：pCAMBIA2301-TobRB7-BAS1-rbc 质粒 ；- ：阴性对照
图 3 转基因植株 PCR 检测
1 2 CK
1：过量表达 BAS1 基因的转基因烟草；2：根系表达 BAS1 基因的转基因烟草；
CK ：未转基因植株
图 4 转基因植株的生长状况
BAS1
Leaf CK 1 2
BRI1
Actin
BAS1
Root CK 1 2
BRI1
Actin
CK ：非转基因植株 ；1 ：过量表达 BAS1 基因的转基因烟草 ；
2 ：根系表达 BAS1 基因的转基因烟草
图 5 转基因植株的 RT-PCR 分析
2015,31(6) 109束红梅等：油菜素内酯基因 BAS1根系表达载体的构建及烟草的遗传转化
根系特异表达 BAS1 的转基因植株 BRI1 基因的表达
量也下降，但在叶片中下降幅度较小。
3 讨论
油菜素内酯在植物生长发育及耐逆响应中起作
用，前人通过对油菜素内酯合成途径的相关基因的
研究发现，多个基因参与耐逆调控［15-17］。Zeng 等［15］
通过对油菜素内酯 det2 突变体的耐盐性研究发现，
相较于野生型拟南芥品种，det2 突变体对盐分更为
敏感，外施油菜素内酯可以提高 det2 突变体的耐盐
性。过量表达 DWF4 可提高种子的萌发和幼苗抗低
温能力［17］。说明油菜素内酯合成基因 det2、DWF4
可以调控植物耐逆性。但植物体内油菜素内酯含量
除了取决于合成途径基因，还与降解失活途径和信
号转导途径有关［18，19］。目前对植物体内油菜素内
酯的降解失活途径研究还不够系统，只鉴定出少数
几个基因［7-9］。BAS1 基因作为油菜素内酯失活基因，
其过量表达影响植株表型，但关于该基因是否参与
植物耐逆性调控尚未明确。因此 BAS1 基因表达载
体的构建为研究 BAS1 基因在耐逆调控方面的功能
奠定基础。
根系是受盐碱、干旱胁迫的直接器官，并且油
菜素内酯不同于其他植物激素，其在植物体内不能
进行长距离运输，只在合成部位起作用［6］。因此为
了解逆境下 BAS1 基因在根系中的作用，构建 BAS1
基因的根系表达载体是十分必要的。为使基因在根
系高效表达，根系启动子的选择是一个重要方面。
目前在植物中获得了一批根系特异启动子［20，21］，本
研究选用烟草根组织特异性表达基因 TobRB7 启动子
构建根系特异表达载体。TobRB7 基因已知启动子区
段长为 1 878 bp，且在 -823-+70 bp 区域该启动子正
反方向插入均表现出较强的根组织特异性表达调控
功能［11，12］。将 BAS1 基因与其整合获得含有 BAS1
基因的根系表达载体，从转基因植株的鉴定结果
看出构建的重组植物表达载体 pCAMBIA2301-RB7-
BAS1-rbc 使 BAS1 基因在烟草根系特异表达。并且
从油菜素内酯信号途径基因的表达结果看出，外源
BAS1 基因的导入影响转基因植株内源油菜素内酯受
体激酶基因 BRI1 的表达，但根系特异表达 BAS1 的
转基因植株主要是根系相关基因的表达受到影响。
说明获得的 BAS1 根系特异表达的转基因植株虽然
地上部表型没受影响，但根系油菜素内酯信号基因
的表达受到影响，因此为了解 BAS1 基因在根系的
功能，还需对该转基因植株的生理变化以及耐逆响
应进行深入研究。
4 结论
本实验基于根系是盐碱、干旱胁迫的首要器官
以及油菜素内酯在耐逆调控中的作用，利用克隆分
离到的油菜素内酯失活基因 BAS1 以及根系特异启
动子，构建 BAS1 根系表达载体，并将重组表达载
体成功转入烟草中，获得转基因植株，经 PCR 鉴定
pCAMBIA2301-RB7-BAS1-rbc 表达载体已成功整合
到烟草基因组中。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）