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Screening of Actinomyces on Antagonism to Rhizoctonia solani Isolated from Saline-alkali Soils in Hexi Corridor

河西走廊盐碱土壤中抗立枯丝核菌的放线菌筛选



全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是一种严重危
害农作物的土传病原菌(也可侵染叶片),可引起多
种农作物的病害[1]。由立枯丝核菌引起的立枯病发
生比较普遍,危害严重,可引起多种蔬菜瓜果和农
作物的病害,如油菜立枯病、水稻纹枯病等。目前
尚缺乏对立枯丝核菌有效的抗病品种,主要通过农
艺措施和化学药剂拌种的方法进行防治[2]。但目前
使用化学杀菌剂防治时由于其药效持续时间短,因
收稿日期 : 2013-09-16
基金项目 :国家自然科学基金资助项目(31260134,30960078)
作者简介 :王蓓,女,硕士研究生,研究方向 :微生物拮抗性 ;E-mail :wangbei0523@126.com
通讯作者 :牛世全,男,教授,硕士生导师,研究方向 :微生物资源和微生物生态 ;E-mail :sqniu@nwnu.edu.cn
河西走廊盐碱土壤中抗立枯丝核菌的放线菌筛选
王蓓  牛世全  达文燕  李海云  胡娇龙  赵国杰
(西北师范大学生命科学学院 旱区微生物资源与生态研究所,兰州 730070)
摘 要 : 从甘肃省河西走廊盐碱土中分离所得 50 株放线菌中,筛选出对立枯丝核菌有生防潜能的放线菌,旨在为生物防治
作物病害提供新的菌种资源。通过平板对峙法、生长速率法及活体组织法筛选拮抗菌,并对其进行形态及分子鉴定。经过平板初筛,
有 4 株菌株对立枯丝核菌有拮抗作用,编号Ⅰ 18-5-2、Ⅲ 22-3-12、Ⅳ 16-3-2、DC009-1-23,其中Ⅳ 16-3-2 和 DC009-1-23 有较高的
拮抗性,抑菌圈直径分别为 20.5 mm 和 15.5 mm ;进而对这 2 菌株进行发酵液复筛,菌丝的生长抑制率分别为 89.02% 和 80.49% ;
活体组织试验表明,Ⅳ 16-3-2 和 DC009-1-23 对立枯丝核菌的防治效果分别达 54.29% 和 45.71% ;通过形态培养特征和 16S rDNA
序列鉴定,将菌株Ⅳ 16-3-2 初步鉴定为变异链霉菌,DC009-1-23 为丁香链霉菌。
关键词 : 立枯丝核菌 放线菌 盐碱地 生物防治
Screening of Actinomyces on Antagonism to Rhizoctonia solani Isolated
from Saline-alkali Soils in Hexi Corridor
Wang Bei Niu Shiquan Da Wenyan Li Haiyun Hu Jiaolong Zhao Guojie
(Institude of Arid Microbial Resources and Ecology,College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070)
Abstract:  This study selected several actinomycetes from 50 strains of the saline-alkali soils of Hexi Corridor in Gansu Province which
have been proved to be resistant to Rhizoctonia solani by antagonistic test, which would provide new strains resources in crop disease control.
Pair culture method, growth rate method and tissue culture method were used to select antagonistic bacteria. The results of antagonistic test
showed that there were 4 strains with antagonism to Rhizoctonia solani, which were named Ⅰ 18-5-2, Ⅲ 22-3-12, Ⅳ 16-3-2 and DC009-1-23.
From above four strains, Ⅳ 16-3-2 and DC009-1-23 had a higher antagonism and the diameters of inhibiting bacteria circle were 20.5 mm and
15.5 mm. By rescreening these two strains with higher antagonism from fermentation broth, the result showed that their mycelial growth inhibition
rates were 89.02% and 80.49%. Biopsy tests showed that the control efficiency of IV 16-3-2 and DC009-1-23 to Rhizoctonia solani reached
54.29% and 45.71%, respectively. According to morphological characteristic and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence, the
strain Ⅳ 16-3-2 was preliminarily identified to be Streptomyces variabilis while the strain DC009-1-23 was identified to be Streptomyces lilaceus.
Key words:  Rhizoctonia solani Actinomycetes Saline-alkali soils Biological control
而农民使用药剂的次数和剂量逐步增加,其有害物
质在蔬菜、土壤中的蓄积量也逐渐增加,这种情况
在温室大棚蔬菜栽培中尤为突出,对人体健康和生
态环境构成极大危害[3]。
真菌病害生物防治是克服病害化学防治造成环
境污染、破坏生态平衡等缺点的有效途径[4]。应用
于立枯丝核菌的生防因子很多,其中主要包括真菌、
细菌(包含放线菌)等[1]。放线菌是产生抗生素的
2014年第1期 157王蓓等 :河西走廊盐碱土壤中抗立枯丝核菌的放线菌筛选
主要微生物来源,在微生物产生的 10 000 多种生物
活性物质中,有 50% 以上是放线菌产生的,堪称为
次级代谢物的宝库,应用放线菌的生物资源有着巨
大的社会效益和生态效益[5]。放线菌的抗生作用体
现在次级代谢产物即抗生素对病原菌直接的抑制和
致死作用。由于土壤中发现放线菌新种的几率越来
越小,因此研究者把目光集中到特殊生境区域[6-10]。
本研究从甘肃省河西走廊盐碱土中分离放线菌,
以期从中筛选出对立枯丝核菌有生防潜能的放线菌,
这将为生物防治作物病害提供新的菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株 :由本研究所分离自甘肃省河西走廊
盐碱土壤中。供试靶标菌 :立枯丝核菌,由甘肃省
农科院植保所提供。主要培养基 :PDA 培养基,高
氏一号培养基,小米浸液培养基。
1.2 方法
1.2.1 放线菌的活化 采用高氏一号培养基,28℃
培养 14 d 后转接于相应的斜面培养基备用。
1.2.2 放线菌对立枯丝核菌的直接拮抗作用 对分
离到的 50 株放线菌,采用平板对峙法[11]进行平板
初筛。分别将在 PDA 培养基上培养 3 d 的立枯丝核
菌菌饼(直径 8 mm)接种于另一 PDA 平板中心,
并将培养 5 d 的放线菌边缘菌饼(直径 8 mm)对称
接种在距中心 2.5 cm 处,重复 3 皿,以不接放线菌
为对照。(25±1)℃培养 3 d 后测量其抑菌圈大小。
1.2.3 放线菌发酵液对立枯丝核菌抑菌活性的测定
1.2.3.1 发酵液的制备 待测菌株在高氏一号斜面
培养基上 28℃恒温培养 7-10 d,待其产生足量的孢
子后制备菌悬液[12-16]。
1.2.3.2 抑制菌丝生长速率法 将放线菌菌株发酵
液原液与 PDA 培养基按照 1∶9 的比例混合后,倒
入直径为 9 cm 培养皿内制成带菌培养基,重复 3 次,
以混合无菌水的 PDA 培养基为对照。将病原菌饼
(8 mm)接种于带菌培养皿内,菌丝面朝下,28℃
培养 3 d,用十字交叉法测量菌落扩展直径,求出菌
丝生长抑制率[17,18]。
菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径 - 处理
菌落直径 / 对照菌落直径)×100%
1.2.4 活体组织试验 采用组织法[19]测定发酵液
对立枯丝核菌的室内药效,剪取生长良好的油菜叶
片,清洗掉表面的杂物,晾干后在含有 0.1% Tween-
20 供试发酵液中浸渍 3 min,自然晾干。挑取病原
菌饼倒扣在叶片中部,每个叶接种 1 个菌饼,未经
发酵液处理的叶片作为空白对照,每处理重复 5 次。
将处理好的叶片放置在 9 cm 培养皿中保湿 48 h,检
查病斑的大小。
抑制活性(%)=(1- 处理病斑生长直径 / 对照
病斑生长直径)×100%
1.2.5 菌 株 的 鉴 定 形 态 学 鉴 定 :采 用 插 片
法[20,21],将菌株划线接种在高氏一号培养基上,
在接种点附近斜插入灭菌的盖玻片(1 cm×1 cm),
28℃培养 7 d 后,取出盖玻片在光学显微镜下观察
菌丝及孢子丝形态。
分子学鉴定:供试菌株 DNA 提取参照黄大林[21]
的方法。
16S rDNA 序 列 扩 增 和 分 析。 引 物 序 列 :
P1 :5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3P2 :5-
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA -3。
PCR 反应体系为 25 μL,含上下游引物各 1 μL、
12.5 μL Premix ExTaq DNA 聚合酶(由日本 TAKARA
公司生产)、2 μL DNA 模板、8.5 μL ddH2O。扩增程
序为 95℃预变性 5 min,95℃变性 30 s,58℃复性 30 s,
72℃延伸 2 min 进行 32 个循环,72℃延伸 5 min。
PCR 扩增产物送华大基因公司测序,所得序列
与 GenBank 数据库中序列进行 BLAST 分析比对,采
用 MEGA3.1 软件构建系统发育树,并且进行同源性
分析。
2 结果
2.1 抗立枯丝核菌放线菌的离体筛选
2.1.1 50 株放线菌对立枯丝核菌拮抗作用测定结
果 采 用 平 板 对 峙 法 对 50 株 放 线 菌 进 行 拮 抗 性
初筛。试验结果如表 1,有 4 株菌株即Ⅰ 18-5-2、
Ⅲ 22-3-12、Ⅳ 16-3-2、DC009-1-23 对立枯丝核菌有
不同程度的拮抗活性。其中Ⅳ 16-3-2、DC009-1-23
有较大的抑菌活性,抑菌圈直径大于 15 mm(图 1)。
2.1.2 两株活性菌株发酵液对立枯丝核菌的抑制作
用 利用生长速率法对初筛中对立枯丝核菌具有较
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期158
高 拮 抗 性 的 2 株 放 线 菌( Ⅳ 16-3-2、DC009-1-23)
进行活性复筛。这 2 株放线菌发酵上清液的 10 倍稀
释液对立枯丝核菌的生长抑制活性筛选结果如表 2
所示,菌株Ⅳ 16-3-2、DC009-1-23 对立枯丝核菌的
抑制活性均达到 80% 以上,抑菌效果显著。
表 2 两株高拮抗性放线菌发酵液对供试靶标菌抑制率平均值
编号 菌落直径(mm) 抑菌率(%)
CK 90 —
Ⅳ 16-3-2 17 89.02
DC009-1-23 24 80.49
显著性 P<0.05 P<0.05
2.1.3 活体组织测定结果 对菌株Ⅳ 16-3-2、DC009-
1-23 进一步进行活体组织试验,测定菌株Ⅳ 16-3-2、
DC009-1-23 发 酵 液 原 液 对 油 菜 立 枯 病 菌 的 药 效,
结果如表 3 所示,其中Ⅳ 16-3-2 株菌的发酵液原
液对油菜立枯病的药效达到 50% 以上,药效显著
(图 2)。
2.1.4 菌株Ⅳ 16-3-2、DC009-1-23 的鉴定
2.1.4.1 Ⅳ 16-3-2、DC009-1-23 的形态特征 Ⅳ 16-
3-2 在高氏一号培养基上气丝蓝灰色,基丝黄色,孢
子丝卷曲长链,孢子椭圆形。DC009-1-23 在高氏一
号培养基上气丝近于藕荷色,基丝甘草黄色,孢子
丝直,孢子椭圆形至柱形,表面光滑(图 3)。菌
株 Ⅳ 16-3-2、DC009-1-23 是 典 型 的 链 霉 菌 属 菌 丝
形态。
表 1 拮抗放线菌对立枯丝核菌的初筛平板拮抗效果
菌株 抑菌圈直径(mm)
Ⅰ 18-5-2 14.0
Ⅲ 22-3-12 12.0
Ⅳ 16-3-2 20.5
DC009-1-23 15.5
A
・ᷟэṨ㧼
・ᷟэṨ㧼
DC009-1-23IV 16-3-2
B
A :菌株Ⅳ 16-3-2 对立枯丝核菌的平板拮抗 ; B :菌株 DC009-1-23 对立枯丝
核菌的平板拮抗
图 1 菌株 IV 16-3-2、DC009-1-23 对立枯丝核菌的拮抗作用
表 3 组织法测定 2 株活性菌株对油菜立枯病的药效
编号 病斑直径(mm) 药效(%)
CK 17.5 —
Ⅳ 16-3-2 8.0 54.29
DC009-1-23 9.5 45.71
显著性 P<0.001 P<0.05
A :菌株Ⅳ 16-3-2 对离体叶菌丝扩展的抑制作用 ;B :菌株 DC009-1-23 对离
体叶菌丝扩展的抑制作用
图 2 菌株 IV 16-3-2、DC009-1-23 对离体叶菌丝扩展的抑
制作用
A
B
A B
A :菌株Ⅳ 16-3-2 的显微形态(100×);B :菌株 DC009-1-23
的显微形态(100×)
图 3 IV 16-3-2、DC009-1-23 在高氏培养基上的菌丝形态
2.1.4.2 菌 株 系 统 发育 分 析 经 PCR 扩 增、 测 序
及与 GenBank 核酸数据库比对,构建系统发育树
2014年第1期 159王蓓等 :河西走廊盐碱土壤中抗立枯丝核菌的放线菌筛选
和同源性分析结果显示(图 4),菌株Ⅳ 16-3-2 与
Streptomyces variabilis(变异链霉菌)关系紧密,位
于 同 一 分 支, 同 源 性 高 达 98%、DC009-1-23 与
Streptomyces lilaceus(丁香链霉菌)关系最紧密,位
100
99
100
93
54
100
0.005
Streptomyce gobitricini NR041183
Streptomyces lilaceus AB184457
DC009-1-23
Streptomyces lavendulae FJ481058
Streptomyces halstedii HQ238390
Streptomyces niveoruber EU570418
IV16-3-2
Streptomyces luteosporeus JN999919
Streptomyces variabilis FJ486381
图 4 邻接法构建菌株Ⅳ 16-3-2、DC009-1-23 的 16S r DNA 序列系统发育树
于同一分支,相似度高达 99%。
3 讨论
本试验采用平板对峙法和生长速率法对分离的
放线菌进行初筛和复筛,平板对峙法的拮抗活性与
菌丝生长速率、营养竞争和抗菌活性物质等多种因
素有关 ;而生长速率法是菌体产生的胞外活性物质
对病菌生长抑制作用的表现,是抗生素研究的基础。
菌株Ⅳ 16-3-2 和 DC009-1-23 对立枯丝核菌的生防作
用较为明显,其中Ⅳ 16-3-2 对离体油菜叶的防治效
果突出。拮抗菌的盆栽试验及菌株活性物质的提取
还有待进一步研究。
我国已经登记注册的农用抗生素有几十种,绝
大多数抗生素产生菌为链霉菌属,其中链霉菌已成
为放线菌中数量最多而且产生抗生素种类也最多的
一个属[1]。本研究在传统分类原则的基础上,通过
分子生物学方法对目的生防菌株进行了分类鉴定,
两株菌株也均为链霉菌属[22,23]。
Byung 等将玫瑰放线菌(Actinomadura roseola)
等液培后分离提取出抗生素 Da2B,它对立枯丝核
菌有明显的抑制作用。井冈霉素是防治水稻纹枯病
非常理想的生物农药,它是由吸水链霉菌井冈变种
(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis Yen) 产
生的。井冈毒素对水稻纹枯病的防效高、持效期
长[24]。本研究中 DC009-1-23、Ⅳ 16-3-2 两株拮抗
菌发酵液的抑菌率均高达 80% 以上,对于发酵液中
拮抗物质的提取有待于进一步研究。
极端环境下如盐碱地、高寒地带等环境中的放
线菌,由于生存环境特殊,代谢途径与常规放线菌
不同,因而成为新的拮抗物质的重要来源[9]。从河
西走廊盐碱土壤中分离所得放线菌有较多对立枯丝
核菌有生防作用的菌株,这些拮抗菌在供试病原菌
的生物防治上有重要的应用价值,应进行深入研究。
甘肃省河西走廊盐碱地这种独特类型的土壤中,还
有大量的链霉菌资源等待进一步开发。
4 结论
经过平板初筛,有 4 株菌株对立枯丝核菌有拮
抗作用,其中Ⅳ 16-3-2 和 DC009-1-23 有较高的拮
抗性,抑菌圈直径分别为 20.5 mm 和 15.5 mm ;菌
株Ⅳ 16-3-2、DC009-1-23 对立枯丝核菌的抑制活性
均达到 80% 以上,抑菌效果显著 ;菌株Ⅳ 16-3-2 发
酵液原液对油菜立枯病的药效达到 50% 以上,药
效显著 ;将菌株Ⅳ 16-3-2 初步鉴定为变异链霉菌,
DC009-1-23 为丁香链霉菌。
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(责任编辑 李楠)