全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第3期
收稿日期 ： 2014-01-08
基金项目 ：国家质检总局科技计划项目（2011IK255）
作者简介 ：邝筱珊，女，工程师，硕士，研究方向 ：食品安全检测 ；E-mail ：carrolkuang@163.com
通讯作者 ：冯家望，男，研究员，硕士，研究方向 ：食品安全检测 ；E-mail ：fjwzhuhai@yahoo.com.cn
近 10 多年来，转基因植物培育取得巨大突破，
在改善农作物抗虫特性中发挥了明显的作用，也显
露出巨大的潜力。然而，人们对转基因植物的安全
性仍然存在着争论。面对生物基因工程技术对我国
经济利益带来的冲击和国外转基因产品对生态环境
和消费者可能带来的风险，转基因植物的快速筛
查方法的研究具有重要的意义［1］。转基因植物的
品种多样，在检测未知转基因植物之前需要进行
筛选检测以确认是否含有转基因成分进而鉴定其
品 系［2］。 新 霉 素 -3- 磷 酸 转 移 酶 基 因（Neomycin
LAMP 实时浊度法检测转基因植物 NPT Ⅱ基因
邝筱珊  胡松楠  王小玉  唐食明  成晓维  冯家望
（珠海出入境检验检疫局技术中心，珠海 519015）
摘 要 ： 根据转基因植物常用的选择标记基因 NPT Ⅱ（HE582394.1）的序列，设计 6 条特异性 LAMP 引物，利用实时浊度
仪对反应体系中扩增产物的实时监控筛选出最佳引物，最终建立转基因植物 NPT Ⅱ基因的 LAMP 检测方法，并对该方法的特异性、
灵敏度、稳定性进行了评价。结果表明，该方法能够特异性检出含有 NPT Ⅱ基因的植物及其加工产品，特异性高，灵敏度达 0.5%。
对转基因玉米 MON863（含 NPT Ⅱ基因）含量为 10%、1%、0.5%、0%（W/W）的样品 DNA 分别进行扩增，其稳定性好，无假阳
性和假阴性。所建立的 LAMP 方法适用于特异性筛选检测含 NPT Ⅱ基因的植物及其加工样品。
关键词 ： 环节导等温扩增法（LAMP）实时浊度仪 新霉素 -3- 磷酸转移酶基因 转基因 检测
Development of a Real-time Turbidimeter-based LAMP Method for
Detection of NPT Ⅱ Gene in the Genetically Modified Plant
Kuang Xiaoshan Hu Songnan Wang Xiaoyu Tang Shiming Cheng Xiaowei Feng Jiawang
（The Inspection Technical Center of Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai 519015）
Abstract:  According to NPT Ⅱ gene（HE582394.1）, the common selective marker gene of genetically modified plant（GMP）,
six specific primers were designed. A loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method for screening GMP was established. Real-
time monitoring of the LAMP reaction was achieved by a turbidimeter. Specificity, sensitivity, stability and repeatability of this method were
tested. The results showed that the method can specifically detect NPT Ⅱ gene, and the detection sensitivity of the method was 0.5%. With the
genetically modified maize MON863（NPT Ⅱ positive）samples of 10%, 1%, 0.5%, 0%（W/W）as templates, stability and repeatability
testing was conducted, and false negative rate was 0. The results showed that the LAMP method is suitable for specifically detecting NPT Ⅱ gene
in GMP.
Key words:  Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）real-time turbidimeter NPTII Genetically modified organisms
Detection
phosphotranferase gene，NPT Ⅱ）是转基因植物研发
时常用的选择标记基因，如转基因油菜籽、番茄、
马铃薯、玉米等，因此 NPT Ⅱ是转基因植物筛选检
测时的关键基因之一［3］。
目前常用的转基因产品检测方法主要有酶联免
疫检测（ELISA）［4］、试纸条［5］、定性 PCR［6］、荧
光定量 PCR［7］、免疫 PCR［8］ 检测等技术。ELISA
方法针对外源蛋白进行检测，当外源蛋白不表达或
者因加工造成破坏时便无法检出 ；定性 PCR、免
疫 PCR 法灵敏度低，操作繁琐。荧光定量 PCR 法
2014年第3期 61邝筱珊等 ：LAMP 实时浊度法检测转基因植物 NPT Ⅱ基因
是目前使用最广泛的方法，灵敏度高却需要高成本
的试剂及仪器设备。生物传感器［9］和基因芯片技
术［10］受成本高、影响因素较多等均未得到广泛使
用。 环 介 导 等 温 扩 增 法（Loop mediated isothermal
amplification，LAMP）［11］针对靶基因的 6 个区域设
计 4 条特异的引物，利用链置换 DNA 聚合酶在恒温
条件保温几十分钟，完成核酸扩增反应。该技术具
有反应时间短、不需要 PCR 仪、加染料或直接通过
肉眼即可判断结果等特点，大大缩短了检测时间。
本研究针对转基因检测常用的筛选基因 NPT Ⅱ设计
特异性 LAMP 引物，建立 LAMP 快速检测方法，并
对该方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试 验 材 料 转 基 因 标 准 品 ：转 基 因 玉 米
MON810、NK603、MON863、GA21、MON88017、
C B H 3 5 1 、 B T 1 1 、 B T 1 7 6 、 M M 8 8 、 T 2 5 A 、
MON88017、MON832、MON802、MON80100， 转 基
因 大 豆 GTS40-3-2、MON89788、DP356043， 转 基
因油菜 RT73、转基因甜菜 H7-1、转基因小麦 B73-
6-1，转基因土豆 EH92-527-1，购于上海惠诚生物科
技有限公司。转基因水稻 KF6、BT63、KMD1，由
中国检验检疫科学研究院馈赠。非转基因植物及食
品样品实验室留样或超市购得。
1.1.2 主要试剂及仪器 DNA 提取试剂盒 Biosprint
15 DNA plant kit，QIAGEN 公司。Bst DNA polymerase
large fragment，New England Biolabs 公 司 ；甜 菜 碱
（Betaine），10×ThermolPol 缓 冲 液，Sigma 公 司 ；
dNTPs，宝生物工程（大连）有限公司 ；SYBR Green
I 荧光染料，厦门致善生物科技有限公司 ；LAMP 引
物，宝生物工程（大连）有限公司。
LAMP 实时浊度仪 LA-320C，日本荣研化学株
式会社 ；紫外分光光度计 NanoDrop，美国 Thermo
公司；实时荧光定量 PCR 仪 7500Fast，美国 ABI 公司。
1.2 方法
1.2.1 LAMP 引物设计 根据 LAMP 引物设计的原
则， 针 对 GenBank 公 布 的 NPT Ⅱ 序 列（Accession
no. HE582394.1），使用在线设计软件 Primer Explorer
version4 和 LAMP Designer 软 件 设 计 特 异 引 物， 设
计多套 LAMP 引物，经筛选获得一套特异性引物
（表 1）。
表 1 NPT Ⅱ基因 LAMP 引物序列
引物名称 序列信息（5-3）
外引物 1（F3） CTCGACGTTGTCACTGAAG
外引物 2（B3） TGATGCTCTTCGTCCAGA
内引物 1（FIP） TAGCCGGATCAAGCGTATGCTCATCTCACCTTG-
CTCCT
内引物 2（BIP） CCATTCGACCACCAAGCGACATCCTGATCGACA-
AGACC
环引物 1（LF） TTGCATCAGCCATGATGGATA
环引物 2（LB） CGTACTCGGATGGAAGCC
1.2.2 样品 DNA 提取 将样品置粉碎机中碾磨至粉
末状，商品化粉末标准品直接取样，称取 100 mg 样
品进行 DNA 提取。DNA 提取步骤按试剂盒的说明
书进行，所提取的 DNA 经紫外分光光度计检测浓度
并稀释至 100 ng/μL，于 -20℃保存备用。
1.2.3 LAMP 扩增反应 反应总体积为 25 μL，包括
10×Thermol Buffer 2.5 μL、 内 引 物 FIP 和 BIP（40
μmol/L）各 1.0 μL、外引物 F3 和 B3（10 mol/L）各 0.5
μL、FLP 和 BLP（20 μmol/L）各 1.0 μL、dNTPs（10
mmol/L）4.0 μL、甜菜碱（5 mol/L）5.0 μL、硫酸镁
（150 mmol/L）1.0 μL、Bst DNA 聚合酶（8 U/μL）1.0
μL、模板 DNA（约 100 ng/μL）2.0 μL，用灭菌去离
子水补齐到 25.0 μL，充分混匀。采用 LAMP 实时浊
度法，将混合物置于 LAMP 浊度仪反应孔中，63℃
恒温反应 90 min，最后 80℃下保温 5 min 以结束反应，
若发生扩增反应，则会产生白色焦磷酸镁沉淀，根
据浊度仪反映的实时浊度判断结果 ；采用 LAMP 显
色法，则预先将 1 μL 的显色液点在管盖中间，小心
盖紧管盖，避免显色液掉入反应液中，反应完后倒
转离心管，让管盖的显色液加入到混合液中，若发
生扩增反应，则显色液从橙色变成绿色。每次反应
设置阳性对照（MON863），阴性对照（Bt63）及空白
对照（超纯水）。
1.2.4 特异性试验 利用建立的 LAMP 实时浊度法，
分别对多种常见转基因植物及加工产品，非转基因
植物及加工产品进行检验，并与 LAMP 显色法和实
时荧光 PCR 法的结果作比对，以评价该方法的特
异性。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期62
1.2.5 灵敏度试验 取 10% 转基因玉米 MON863 标
准品，与非转基因玉米以不同比例充分混合均匀，
制备成添加浓度分别为 0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、
1% 和 5% 的 MON863 阳性模拟样品，按照 LAMP 实
时浊度法进行检测，以评价该方法的灵敏度。
1.2.6 稳定性试验 利用建立的 LAMP 实时浊度法，
分别对 3 个不同浓度（空白样品 0%、添加水平 0.5%、
1%）的 MON863 阳性模拟样品及 10%MON863 标准
品进行检测，每个样品重复 20 次，并与 LAMP 显色
法和实时荧光 PCR 法的结果作比对。
2 结果
2.1 LAMP引物筛选结果
用 10% 的转基因玉米 MON863 标准品作为阳
性模板进行引物的初步筛选，试验结果显示引物
NPT Ⅱ -5 发生了扩增反应，出峰时间为 45 min 左右，
峰高为 0.15，出峰时间和峰高值都适中。进而引入
环引物对反应进行优化，由图 1 可知，NPT Ⅱ -5 引
入环引物后，出峰时间提前至 20 min 左右，可以初
步将反应时间定在 45 min 进行后续试验。
应，即与显色法结果一致。表明该方法可以检测出
转基因含量低至 0.5% 的玉米 MON863，灵敏度较高。
0:00
0
0.05
0.10
0.15
0.25
0.20
Tu
rb
id
ity
-0.05
9:00 18:00 27:00 36:00
Timemin:sec
CH1
CH2
CH3
CH4
CH3 CH4
CH1 ：NPT Ⅱ 阴 性 对 照（BT11 阳 性 样 本 ）；CH2 ：空 白 对 照（ddH2O）；
CH3-4 ：MON863 阳性样本
图 1 引物 NPT- Ⅱ的 LAMP 试验结果
2.2 特异性试验结果
表 2 显示 LAMP 实时浊度法对多种类型样品的
检验结果与 LAMP 显色法及实时荧光 PCR 法的结果
符合率为 100%，表明该方法特异性良好。
2.3 灵敏度试验
LAMP 实时浊度法结果（图 2）显示转基因玉米
MON863 的 10% 标准品、5% 模拟样品、1% 模拟样品、
0.5% 模拟样品出现阳性扩增，且反应管出现显色反
0:00
0
0.05
0.10
0.15
0.25
0.20
Tu
rb
id
ity
-0.05
9:00 18:00 27:00 36:00
Timemin:sec
CH3 CH5
CH1
CH2
CH3
CH4
CH5
CH6
CH7
CH8
CH6
CH4
CH1
CH1 ：阳性对照（MON863 阳性样本）；CH2 ：空白对照（ddH2O）；
CH3 ：10% MON863 标 准 品 ；CH4 ：5% MON863 样 本 ；CH5 ：1%
MON863 样本 ；CH6 ：0.5% MON863 样本 ；CH7 ：0.1% MON863 样
本 ；CH8 ：0.05% MON863 样本
图 2 引物 NPT Ⅱ -5 灵敏度试验结果
2.4 稳定性试验
采用本研究建立的方法分别对 10%MON863 标
准品和 3 个不同浓度（空白样品 0、添加水平 0.5%、
1%）的模拟样品进行检测，每个样品重复 20 次。
结果（表 3）显示 4 个浓度的 LAMP 实时浊度法试
验结果重复性好，与 LAMP 显色法的结果一致，假
阳性率和假阴性率为 0。
3 讨论
随着转基因植物种植面积的持续增加［12］，以及
转基因植物中性状基因叠加的新趋势，转基因植物
的检测工作带来了新的挑战［13］，迫切需要建立一种
快速、准确、特异、灵敏的筛检方法。
本试验建立了转基因植物常用的标记筛选基
因 NPT Ⅱ 的 LAMP 方 法， 在 4 条 LAMP 引 物 的 基
础上加入了 2 条环状引物，进一步促进扩增且减少
了反应时间，1 h 内完成反应。该方法的最低检出
限为 0.5%，满足目前各国及地区对转基因食品进行
标识的最低含量阈值要求［14］。LAMP 法对其它不含
NPT Ⅱ基因的转基因植物及非转基因植物及其加工
产品均无扩增信号，对实际样品的检测结果也与实
时荧光 PCR 法一致，可见该方法具有很高的特异性。
LAMP 技术具有方便简单、灵敏度高、特异性
强、成本较低等优点。仅需在水浴锅或金属加热块
2014年第3期 63邝筱珊等 ：LAMP 实时浊度法检测转基因植物 NPT Ⅱ基因
表 2 LAMP 实时浊度法特异性检测结果
样品类别 样品名称 转基因特征 LAMP 实时浊度法 LAMP 显色法 实时荧光 PCR 法
非转基因样品（10
份）
燕麦（D1） 非转基因 - - -
小麦（D2） 非转基因 - - -
玉米（D3） 非转基因 - - -
大豆（D4） 非转基因 - - -
大米（D5） 非转基因 - - -
豆浆（1567） 非转基因 - - -
米粉（1568） 非转基因 - - -
麦片（1569） 非转基因 - - -
薯片（1570） 非转基因 - - -
米线（1571） 非转基因 - - -
不含 NPT Ⅱ基因
的转基因样品（16
份）
籼米（211） Bt63 - - -
大豆（212） GTS-40-3-2 - - -
大豆（213） DP356043 - - -
大豆（214） MON89788 - - -
玉米（215） BT11 - - -
玉米（216） GA21 - - -
玉米（217） MON88017 - - -
玉米（218） BT176 - - -
玉米（219） T25 - - -
玉米（220） NK603 - - -
玉米（221） CBH351
土豆（1201） EH92-527-1 - - -
小麦（1338） B73-6-1 - - -
油菜（1339） RT73 - - -
甜菜（1340） H7-1 - - -
水稻（1356） KF6 - - -
水稻（1357） KMD1 - - -
含 NPT Ⅱ基因的
转基因成分样品
（10 份）
玉米（B1） MON832 + + +
玉米（B2） MON802 + + +
玉米（B3） MON80100 + + +
玉米（B4） MON863 + + +
玉米（B5） MM88（MON863×MON810） + + +
玉米粉（C1） MON863 + + +
玉米羹（C2） MON863 + + +
玉米球（C3） MM88（MON863×MON810 + + +
饲料（C4） MON863 + + +
玉米片（C5） MON863 + + +
表 3 LAMP 实时浊度法稳定性试验结果
检测方法
阳性样品数 / 试验样品数
标准品（10%） 模拟样品（1%） 模拟样品（0.5%） 空白样品（0%）
LAMP 实时浊度法 20/20 20/20 20/20 0/20
LAMP 显色法 20/20 20/20 20/20 0/20
实时荧光 PCR 法 20/20 20/20 20/20 0/20
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期64
的恒温条件下便能满足反应条件。可以直接肉眼观
察反应后反应液的浊度或者指示剂的颜色变化来判
定结果，比较方便。反应后不需要开盖检测结果，
能避免开盖形成的气溶胶污染，减少假阳性的产生。
LAMP 作为转基因检测技术的强大优势，尤其适合
在食品检测部门和基层检测机构进行快速甚至现场
筛检，值得推广和应用。
4 结论
采 用 LAMP 实 时 浊 度 法 建 立 的 转 基 因 植 物
NPT Ⅱ基因检测方法，45 min 内可完成扩增反应，
对 36 种植物样品的检测结果均与预期相符，检测灵
敏度达 0.5%（W/W），对转基因玉米 MON863 含量
为 10%、1%、0.5%、0%（W/W）的样品 DNA 分别
进行 20 次重复扩增，假阳性和假阴性率为 0%。
参 考 文 献
［1］ 郭桦 , 郭祀远 . 转基因食品安全性的探讨［J］. 现代食品科技 ,
2007, 23（8）：71-73.
［2］ 李俊 , 郑秀丽 , 邓平建 , 等 . 商品化转基因植物的外源基因及其
检测技术［J］. 中国农业科技导刊 , 2008, 10（3）：31-39.
［3］ Fuchs RL, Ream JE, Hammond BG, et al. Safety assessment
of the neomycin phosphotransferaseII（NPTII）protein［J］.
Biotechnology, 1993, 11（13）：1293-1543.
［4］ Asensio L, Gonzalez I, Garcia T, et al. Determination of food
authenticity by enzme-linked immunosorbent assay（ELISA）［J］.
Food Control, 2008, 19 ：1-8
［5］ 丁耀魁 , 沈娟 , 马黎黎 . 快速检测试纸条法在大豆转基因检测
中的应用［J］ . 粮油食品科技 , 2010, 18（2）：45-46.
［6］ Morisset D, Stebih D, Cankar K, et al. Alternative DNA amplification
methods PCR and their application in GMO detection：a review［J］.
Eur Food Res Technol, 2008, 277 ：1287-1297.
［7］ Hernandez M, Esteve T, Prat S, et al. Development of real-time PCR
systems based on SYBR® Green I, AmplifluorTM and TaqMan® techno-
logies for specific quantitative detection of the transgenic maize event
GA21［J］. Journal of Cereal Science, 2004, 39（1）：99-107.
［8］ Liu G, Su W, Xu Q, et al.Liquid-phase hybridization based PCR
ELISA for detection of genetically modified organisms in food［J］.
Food Control, 2004, 15（4）：303-306.
［9］ Volpe G, Ammid NH, Moscone D, et al. Development of an immuno-
magnetic electrochemical sensor for detection of BT CRY1AB/CRY-
1AC proteins in genetically modified corn samples［J］.Anal Lett,
2006, 39（8）：1599-1609
［10］ Leimanis S, Hernandez M, Fernandez S, et al. A microarray based
detection system for genetically modified（GM）food ingredients
［J］.Plant Molecular Biology, 2006, 61（1）：123-139.
［11］ Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al.Loop-mediated isothe-
rmal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Research, 2000, 28
（12）：e63.
［12］ Clive J. 2011 年全球生物技术／转基因作物商业化发展态
势［J］. 中国生物工程杂志 , 2012, 32（1）：1-14.
［13］ 李全芬 , 李志辉 , 王慧翌 , 等 . 转基因生物检测技术研究进
展［J］. 中国畜牧兽医 , 2011, 38（1）：152-156.
［14］ 陈超 , 展进涛 . 国外转基因标识政策的比较及其对中国转基因
标识政策制定的思考［J］. 世界农业 , 2007, 11（7）：17-20.
（责任编辑 李楠）