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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
收稿日期 ： 2014-01-23
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31160440，31260533，31360529）, 甘肃省科技支撑计划项目（1011NKCA051）, 兰州市科技计划项目
（2011-1-113），西北民族大学研究生科研创新项目（ycx13175）
作者简介 ：金方园，E-mail ：373995197@qq.com
通讯作者 ：杨具田，教授，硕士生导师，E-mail ：jutianyang988@163.com ；臧荣鑫，教授，硕士生导师，E-mail ：rongxinzang2000@163.com
兰州大尾羊 MAPK13 基因 cDNA 克隆及
生物信息学分析
 金方园1  徐红伟2  达小强1  臧荣鑫1  柏家林1  曹忻2  蔡勇2   
冯玉兰1  杨具田2
（1. 西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030 ；2. 西北民族大学实验中心，兰州 730030）
摘 要 ： 克隆兰州大尾羊促分裂素原活化蛋白激酶 MAPK13 基因，并分析其序列及其编码蛋白的生物学特性，为研究绵
羊 MAPK13 基因的功能和生产应用提供参考。根据绵羊 MAPK13 基因 CDS 序列设计特异引物，利用 RACE 和 RT-PCR 技术克隆获
得兰州大尾羊 MAPK13 基因全长序列，并结合生物信息学方法分析其生物学特性。克隆获得兰州大尾羊 MAPK13 基因 cDNA 序列
全长 1 397 bp，其 CDS 区片段长 1 102 bp，编码 367 个氨基酸。预测兰州大尾羊 MAPK13 蛋白分子量为 42.29 kD，理论等电点为
8.82，为非跨膜的疏水性蛋白，亚细胞定位主要在细胞质中，无信号肽，不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有 19 个磷酸化位点，
3 个糖基化位点，3 个磷酸化功能结构域，4 个其他结构域，1 个 LCR 片段，二级结构以 α-螺旋为主。同源性分析显示兰州大尾羊
MAPK13 基因序列与已发布的绵羊 MAPK13 mRNA 序列（登录号 ：NM_001139455.1）相比，其第 852 位发生碱基转换（C  A），导
致编码蛋白第 265 位氨基酸发生碱基转换（S  T），同时，第 951 位发生碱基转换（T  G），但其所编码氨基酸不变。构建的基因
进化树分析结果显示兰州大尾羊与牛亲缘关系最近。兰州大尾羊与其他物种 MAPK13 基因在结构上相似性较高，说明该基因具有
高度的保守性，其序列包含的 S_TKc 结构域可将 ATP 的 γ 磷酰基转移到蛋白质丝氨酸 / 苏氨酸残基上，导致一系列肥胖相关基因
的功能失调和表达变化，为进一步研究 MAPK13 基因与成脂分化过程的相关性提供了参考。
关键词 ： 兰州大尾羊 MAPK13 基因 cDNA 末端快速扩增 生物信息学
Cloning and Bioinformatics Analysis of MAPK13 Gene in Lanzhou
Fat-tailed Sheep
Jin Fangyuan1 Xu Hongwei2 Da Xiaoqiang1 Zang Rongxin1 Bai Jialin1 Gao Xin2 Cai Yong2
Feng Yulan1 Yang Jutian2
（1. College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030 ；2. Science Experimental Center，
Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030）
Abstract:  The objective of this study is to reveal the biological function of mitogen-activated protein kinases（MAPK）gene in sheep
and provide theoretical data for application by cloning MAPK and analyzing its sequence as well as genetic features. The specific primers on the
CDS template of MAPK13 gene were designed and then the MAPK13 gene sequence of Lanzhou fat-tail sheep was cloned using RACE and RT-
PCR technology. After that, its genetic characteristics were analyzed by bioinformatics methods. The 1 397 bp full-length cDNA of MAPK13
of Lanzhou fat-tailed sheep was obtained, in which the length of CDS is 1 102 bp. It encodes 367 amino acids in total. It was predicted that the
molecular weight of MAPK13 protein of Lanzhou fat-tail sheep is 42.29 kD and its theoretical isoelectric point is 8.82. It is a non-transmembrane
hydrophobin with no signal peptide, which locates mostly in cytoplasm by the result of subcellular level prediction and does not belong to the
secretory protein. Its amino acid sequence contains 19 phosphorylation sites, 3 glycosylation sites, 3 phosphorylation domains, 4 other domains
and 1 LCR domain. Also, its secondary structure is mainly randomly curly. Nucleotide sequence analysis revealed that the gene nucleotide
2014年第8期 95金方园等 ：兰州大尾羊 MAPK13 基因 cDNA 克隆及生物信息学分析
促 分 裂 素 原 活 化 蛋 白 激 酶（Mitogen-activated
protein kinases，MAPK）链是真核生物信号传递网络
中的重要途径之一［1］。MAPK 通路主要包括 ERK、
p38MARK 和 JNK 三条途径，主要作用于脂肪细胞
组织中，其逐级磷酸化过程［2］涉及成脂分化的调
控，与胰岛素抵抗、脂肪细胞分化密切相关［3］。p38
delta MAPK 也称为 MAPK13，是脂肪细胞分化的主
要候选基因。兰州大尾羊（Lanzhou fat-tailed sheep）
是清朝同治年间（1 862-1 875 年）由陕西大荔一带
引进的同羊与兰州当地蒙古羊杂交选育而成的地方
绵羊品种，因其尾部脂肪过度沉积，导致尾大、脂
肪充实而得名［4，5］。绵羊 MAPK13 基因克隆及其
相关功能研究报道较少。1997 年，Cohern 等［6］用
Ser/Thr 磷 酸 酶 处 理 使 MAPKK 失 活， 提 出 了 存 在
MAPKK 激酶的假说。Emanuelli［7］研究证实，胰岛
素抵抗，二型糖尿病和肥胖均与 MAPK 有关。2005
年，Bost 等［8］研究发现，ERK 小鼠脂肪细胞含量
少于野生型小鼠，与对照组相比，高脂饲料喂养的
ERK 小鼠有较高的餐后代谢率，不易患胰岛素抵抗
和 肥 胖。2009 年， 赵 芳 等［3］ 研 究 表 明，ERK1/2，
JNK 和 p38MAPK 三条 MAPK 信号通路通过独立作
用及复杂的协调作用，参与调控脂肪细胞分化过程
的各个环节，其调节作用具有多样性。2013 年，吕
雯［9］脂肪细胞等研究表明，ERK 和 p38MAPKK 两
种 MAPK 信号通路对脂分化的调节在不同的试验模
型中表现为正调控和负调控两种不同形式 ；而另一
成员 JNK 能使胰岛素受体底物１的丝氨酸发生磷酸
化，进而干扰胰岛素信号，从而抑制骨髓间充质干
细胞（BMSCs）的成脂分化，即对脂肪细胞分化发
挥负调控作用。关于 MAPK 通路对脂肪细胞分化发
挥 正 调 控 作 用，Haridas Nidhina［10］ 研 究 表 明， 香
草精通过激活 ERK 通路，上调了前体脂肪细胞中
PPARg 的表达，增加了细胞葡萄糖的摄取量，促进
了成脂分化。关于 MAPK 通路对脂肪细胞分化发挥
负调控作用，Chuang［11］研究表明，ERF 信号通路
可以诱导白细胞介素表达，使其下游 PPARg 被磷酸
化，导致 PPARg 下游生脂相关的靶基因表达水平
降低，从而抑制了脂肪细胞分化。此外，Bordicchia
等［12-15］的研究，也表明 MAPK 基因与脂肪代谢关
系密切。基因调控是细胞分化的核心问题。目前，
虽然有关 MAPK13 基因的研究在报道中较多，但兰
州大尾羊是具有耐粗饲、抗病能力强、饲料利用率
高、适应性强、肉质鲜美等优良地方绵羊品种，其
尾部脂肪细胞分化与其它绵羊差异显著。迄今为止，
MAPK13 等脂肪细胞分化基因克隆及表达的相关报
道较少［16］。脂肪细胞分化过程与脂肪细胞特异性
功能基因的表达调控密切相关，涉及多种脂肪特异
性转录因子的激活。本研究以兰州大尾羊为研究对
象，应用 RT-PCR 技术获得 cDNA，利用 RACE 法对
MAPK13 基因进行克隆和序列分析，为进一步研究
MAPK13 基因对兰州大尾羊尾部脂肪细胞分化的影
响提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 2012 年 3 月于永登明鑫良种肉羊
繁育场选购 6 月龄兰州大尾羊（羯羊），颈静脉放血
后，快速切取尾部脂肪组织，切成小块，用锡箔纸
包裹后液氮速冻，-80℃保存备用。兰州大尾羊脂
尾肥大，方圆平展，自然下垂飞节上下，尾有中沟
将尾部分为左右对称两瓣，尾尖外翻，并紧贴中沟，
尾面着生被毛，内面光滑无毛，呈淡红色。由于该
品种濒临灭绝，纯种存栏不足百只，利用正常繁育
羊只开展研究工作受到了限制，因而屠宰了 1 只羯
羊进行了研究。该羊尾脂重 1.71 kg，占体重的 3%，
sequence of Lanzhou fat-tail sheep has some different from the known sheep MAPK13 mRNA（Genbank No. ：NM_001139455.1）. Base
transition occur in the 852th site is（C vs. A）, respectively, the corresponding amino acids in the 265th is（S vs. T）. Base transition occur
in the 951th site is（T vs. G）, but the corresponding amino acids do not change.The phylogenetic tree indicates that Lanzhou fat-tail sheep is
close to bos. The fact that the structure of MAPK13 of Lanzhou fat-tail sheep highly similar with other species indicates that the gene is highly
conservative. The S_TKc domain in the sequence can transfer the gamma phosphoryl of ATP to the serine / threonine residues of protein, leading
to function imbalance and expression change in a series of obesity related gene.
Key words:  Lanzhou fat-tailed sheep MAPK13 gene RACE Bioinformatics analysis
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期96
具有理想羊只的特征。以下实验于西北民族大学实
验中心进行。
1.1.2 主要试剂 RNAiso Plus（TaKaRa）、SMART-
erTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）、DH5α
感受态细胞（TaKaRa）、普通琼脂糖凝胶 DNA 回收
试剂盒、pGM-T 克隆试剂盒、质粒小提试剂盒、X-gal、
IPTG、DNA Marker，6×loading buffer、 胰 蛋 白 胨、
酵母提取物、琼脂粉、氯仿、异丙醇、0.1％ DEPC、
75％乙醇、RNase-free 水、5×TBE 缓冲液、琼脂糖、
氯化钠等均购自天根生物公司。
1.2 方法
1.2.1 脂肪组织总 RNA 的提取 通过 TRIzol 法提取
总 RNA。
1.2.2 引物设计与合成 根据绵羊 MAPK13 mRNA
序列（登录号 ：NM_001139455.1），按照 SMARTerTM
RACE cDNA Amplification Kit 要求［17］，利用 Primer 5.0
软件设计引物，由上海生工合成。
表 1 PCR 引物信息
引物名称 引物序列（5-3） 扩增长度（bp）
GSP1 GGGCTCAAAGAAGGGG 90
NGSP1 CTTGTAGAAGCCCTTTTTCC
GSP2 GATTTTGGGTTGGCACGGCATACG 741
NGSP2 CAACCAGACCGTGGACATCTGGTC
CDS1 AAGCTTATGAGCTTCACCCGG 1 102
（Hind III 酶切位点）
CDS2 CTCGAGTCACTGCAACTTCATGCC
（XhoI 酶切位点）
1.2.3 cDNA 第一链合成 cDNA 第一条链的合成根
据 SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 说 明 书
进行操作。
1.2.4 RACE 反 应 及 产 物 回 收 根 据 SMARTerTM
RACE cDNA Amplification Kit 中 3-Full RACE Core
Set 和 5-Full RACE Core Set 2 5-full race 试剂盒进行
兰州大尾羊 MAPK13 的 3 端与 5 端序列的扩增，具
体操作步骤参考产品说明书，用 CDS 区引物 CDS1
和 CDS2 按常规方法进行 RT-PCR 扩增。反应结束后
各取 3-RACE PCR 产物、5-RACE PCR 产物和 CDS
区 PCR 产物 5.0 μL，用 12 g/L 琼脂糖凝胶电泳。目
标 3-RACE cDNA、5-RACE cDNA 和 CDS 区 PCR
产物经 DNA 凝胶回收试剂盒进行回收和纯化，连接
至 pDM19-T 载体，提取质粒并送上海生工生物工程
公司测序。
1.2.5 数 据 分 析 利 用 DNASTAR 软 件 对 已 获 得
的 MAPK13 序列片段进行拼接，对拼接的 cDNA 序
列进行分析并推导其氨基酸序列 ；利用 ProtParam
（http ：//us.expasy.org/tools/protparam.htmL）分析氨基
酸序列的理化性［18］；利用 IBCP（http ：//npsa-pbil.
ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）
预测蛋白质的二级结构［19］；利用 PHYRE2（http ：//
www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）
预测蛋白质的三级结构［20］；利用 TMHMM（http ：//
genome.cbs.dtu.dk/services /TMHMM/） 分 析 蛋 白 质
的跨膜结构［21］；利用 Protscale（http ：//web.expasy.
org/protscale/）分析蛋白质亲疏水性 ；利用 NetPhos
（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/） 分 析 蛋 白
质磷酸化位点 ；利用 NetNGlyc（http ：//www.cbs.dtu.
dk/services/NetNGlyc/）分析蛋白质糖基化位点 ；利
用 TargetP（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）
分析蛋白潜在信号肽 ；利用 SignalP4.0（http ：//www.
cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析蛋白分泌途径 ；利
用 PSORT II Prediction（http ：//psort.hgc.jp/form.html）
预测蛋白质的亚细胞定位 ；利用 Smart（http ：//smart.
embl-heidelberg.de/）分析预测氨基酸序列的保守结
构域 ；利用 Blast 和 DNAman 软件分析其同源性及构
建系统发育树［22］。
2 结果
2.1 兰州大尾羊MAPK13基因cDNA末端快速扩增
（RACE）
根据 SMARTerTM RACE cDNA 扩增试剂盒中 5-
full race 试剂盒和 3-full race 试剂盒说明书进行的
M 1 M 2 M 3
90
741
1102
bpbpbp
M：DL2000 DNA Marker；1：5-RACE cDNA片段；2：3-RACE
cDNA片段；3：CDS片段
图1 MAPK13基因5-RACE、3-RACE和中间CDS扩增产
物电泳图
2014年第8期 97金方园等 ：兰州大尾羊 MAPK13 基因 cDNA 克隆及生物信息学分析
操作步骤。NGSP1 扩增得到 90 bp 5-RACE cDNA，
NGSP2 扩增得到 741 bp 3-RACE cDNA ；CDS 区引物
CDS1 和 CDS2 扩增获得 1 102 bp 中间片段（图 1）。
2.2 兰州大尾羊MAPK13基因cDNA 序列分析
将中间片段、5-RACE 和 3-RACE 序列测序拼
接后获得兰州大尾羊 MAPK13 基因 1 397 bp 的全长
cDNA 序列。MAPK13 基因核苷酸序列及其编码蛋
白的氨基酸序列如图 2 所示，兰州大尾羊 MAPK13
基因的开放阅读框为 1 101 bp，起始密码子为 ATG
位于 58 nt，终止密码子为 TAG 位于 1 158 nt，编码
367 个氨基酸。编码区两侧翼分别具有 5-UTR 57 bp
（1-57 nt）和 3-UTR 214 bp（1 158-1 397 nt）。其中
C+G%=57.55%，分子量 42.29 kD。
2.3 兰州大尾羊MAPK13蛋白质结构分析
2.3.1 基因蛋白理化性质分析 DNAstar 软件分析
表明，兰州大尾羊 MAPK13 基因 cDNA 编码蛋白质
367 个氨基酸残基中，有 52 个碱性氨基酸（K，R），
占氨基酸总数的 14.2% ；47 个酸性氨基酸（D，E），
占氨基酸总数的 12.8%；124 个疏水氨基酸（A，I，F，
W，V），占氨基酸总数的 33.8%；87 个极性氨基酸（N，
C，Q，S，T，Y），占氨基酸总数的 23.7%。
2.3.2 基因蛋白二级结构与三级结构预测 ProtPar-
am 程序分析表明兰州大尾羊 MAPK13 蛋白的的分
子量为分子量 42.29 kD，理论等电点为 8.82。兰州
大 尾 羊 MAPK13 蛋 白 中，α-螺 旋（Alpha helix） 占
41.26% ；随 机 卷 曲（Random coil） 占 39.89% ；延
伸 链（Extended strand） 占 18.85%（ 图 2）。 通 过
PHYRE2 预测其三级结构（图 3）。
2.3.3 MAPK13 蛋白的保守结构域 根据 Smart 软件
推测，MAPK13 蛋白质其第 306-319 个氨基酸残疾
有一段 LCR 序列（表 2，图 4）。
10 20 40 50 60 7030
图 2 MAPK13 基因编码的氨基酸序列及其二级结构分析
S_TKc㔃ᶴฏ CㄟNㄟ
图 3 MAPK13 蛋白质三级结构模型
active site
Query seq.
1 50 100 150 200 250 300 350 366
ATP binding site
swbstrate binding site
activation loopA-loop
表 2 MAPK13 保守结构域分析
名称 起始位点 结束位点
S_TKc 25 308
RIO 3 196
TyrKc 25 308
RasGAP 45 328
CPSase_sm_ 179 247
IENR1 208 263
MgtE_N 238 335
Low xomplexity 306 319
红色区域表示 S_TKc 结构域（第 25-308 个氨基酸残基），蓝色区域表示 LCR 结构域（第 306-319 个氨基酸残基）；
颜色标识见电子版
图 4 MAPK13 保守结构域分析
2.3.4 蛋白基因跨膜结构与亲疏水性分析 TMHMM
分析也表明兰州大尾羊 MAPK13 蛋白无跨膜螺旋，
为非跨膜蛋白。利用 ExPASy 的 Protscale 分析蛋白疏
水性（图 5）发现，该基因编码蛋白疏水性最大值
为 2.078，最小值为 -3.044。该氨基酸序列内绝大多
数为疏水性残基，表明绵羊 MAPK13 基因编码蛋白
为不溶性蛋白。
2.3.5 亚细胞定位 根据 TargetP 和 SignalP 软件预
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期98
测，推测该蛋白无信号肽，不是分泌蛋白，大部分
在游离核糖体上合成（表 3）。将 MAPK13 蛋白序列
输入 PSORT II Prediction，可以基本确认该基因蛋白
不属于分泌蛋白，主要在细胞质（45%）和过氧化
物酶体（36.5%）中发挥生物学作用，少量作用于溶
酶体（10%）和线粒体基质（10%）（表 4）。
表 3 TargetP 预测 MAPK13 亚细胞定位
名称 长度 线粒体靶向肽 mTP 分泌通路信号肽 SP 其他
序列 367 0.289 0.062 0.680
表 4 PSORT II Prediction 预测 MAPK13 亚细胞定位
名称 百分比（%）
细胞质 45
过氧化物酶体 36.5
溶酶体 10
线粒体基质 10
2.3.6 蛋 白 基 因 磷 酸 化 与 糖 基 化 位 点 分 析 根
据 NetPhos 2.0 Server 软 件 分 析， 结 果（ 图 6） 表
明 MAPK13 蛋白含有 12 个丝氨酸 Ser，3 个苏氨酸
Thr，4 个酪氨酸 Tyr 可以成为蛋白质激酶磷酸化的
位点。根据 NetNGlyc 1.0 Server 软件分析，结果表明
其含有 3 个糖基化位点 ：N15、N201、N347。
2.4 兰州大尾羊MAPK13基因及其编码蛋白与其
他动物同源性比较
用 Blast 进行核苷酸同源性在线分析，结果表
明兰州大尾羊 MAPK13 基因核苷酸序列与牛、人、
海象、犬、猴、虎鲸、海豚和鼠核苷酸序列间的同
源 性 分 别 为 97%、92%、91%、91%、91%、90%、
90% 和 88%，说明兰州大尾羊与绵羊和牛的亲缘关
系较近，与鼠类亲缘关系最远。用 DNAman 软件进
行氨基酸同源性分析，结果（图 7）表明，兰州大
尾羊 MAPK13 氨基酸序列与牛、猴、犬、海象、海豚、
虎鲸、鼠和人核苷酸序列间的同源性分别为 99.2%、
87.8%、94.8%、93.7%、91.8%、92.1%、92.1% 和
81.1%，其中与牛同源性较高，与鼠和人类同源性
较差。系统发育树（图 7）也表明，兰州大尾羊与
牛的进化水平更为接近，与人类较远。兰州大尾羊
MAPK13 基因序列与已发布的绵羊 MAPK13 mRNA
3
2
1
0
Sc
or
e
-1
-2
-3
-4
50 100 150 250 350300200
Position
水平线表示氨基酸残基数，垂直线代表相对的亲水区。零点以上为疏水区，
零点以下为亲水区
图 5 MAPK13 蛋白氨基酸亲水性分析结果
350300250200
Serine
Threonine
Tyrosine
Threshold
150
Sequence position
Ph
os
ph
or
yl
at
io
n
po
te
nt
ia
l
100500
0
1
图 6 MAPK13 磷酸化位点分析
ޠᐎབྷቮ㖺Lanzhou⢋Bos⎧䊑Odobenus⣜Canisሿⲭ啐Mus㱾勨Orcinus⎧䊊Tursiops⥤MacacaӪHomo 100% 99% 97% 95% 92% 91% 88% 84%100%A B80%95% 90% 85% ޠᐎབྷቮ㖺Lanzhou⢋Bos ሿⲭ啐Mus⎧䊑Odobenus⣜Canis 㱾勨Orcinus⎧䊊Tursiops⥤MacacaӪHomo0.05
图 7 MAPK13 基因同源性分析和系统发育树
2014年第8期 99金方园等 ：兰州大尾羊 MAPK13 基因 cDNA 克隆及生物信息学分析
ޠᐎབྷቮ㖺Lanzhou⢋Bos⎧䊑Odobenus⣜Canis㱾勨Orcinus⎧䊊Tursiops⥤Macacaሿⲭ啐MusӪHomo
Consensus
ޠᐎབྷቮ㖺Lanzhou⢋Bos⎧䊑Odobenus⣜Canis㱾勨Orcinus⎧䊊Tursiops⥤Macacaሿⲭ啐MusӪHomo
Consensus
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Consensus
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140
140
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210
210
210
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210
209
280
280
280
280
280
280
260
280
228
350
350
350
350
350
350
330
350
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365
365
365
365
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365
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黑色部分表示氨基酸序列完全相同 ；绿色部分表示有一个以上氨基酸序列不同（颜色标识见电子版）
图 8 兰州大尾羊与其他物种 MAPK13 氨基酸序列间多序列对位排列
序列（登录号 ：NM_001139455.1）相比第 852 位发
生碱基转换（C ←→ A），导致编码蛋白第 265 位
氨基酸发生碱基转换（S ←→ T），同时，第 951 位
发生碱基转换（T ←→ G），但其所编码氨基酸不变
（图 8）。
3 讨论
本研究通过 RT-PCR 和 RACE 技术首次克隆了
兰州大尾羊 MAPK13 基因 cDNA 全长序列 1 397 bp，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期100
其 CDS 区片段长 1 102 bp，编码 367 个氨基酸。兰
州大尾羊 MAPK13 基因核苷酸序列与牛、人、海象、
犬、猴、虎鲸、海豚和鼠核苷酸序列间的同源性分
别 为 97%、92%、91%、91%、91%、90%、90% 和
88%。兰州大尾羊 MAPK13 基因序列与已发布的绵
羊 MAPK13 mRNA 序列（登录号 ：NM_001139455.1）
相比，其第 852 位发生碱基转换（C ←→ A），导致
编码蛋白第 265 位氨基酸发生碱基转换（S ←→ T），
同时，第 951 位发生碱基转换（T ←→ G），但其所
编码氨基酸不变。系统发育树符合进化规律。由此
可见，兰州大尾羊与各物种 MAPK13 基因序列间具
有高度的保守性，从而预测生物体内由 MAPK13 基
因所指导的生物学功能非常稳定。
预测 MAPK13 分子量为 42.49 kD，为非跨膜的
疏水性蛋白，无信号肽，不属于分泌蛋白。亚细胞
定位主要在细胞质（45%）和过氧化物酶体（36.5%）
中发挥生物学作用，少量作用于溶酶体（10%）和
线粒体基质（10%）。综上推测 MAPK13 蛋白大部分
在游离核糖体上合成，其功能与过氧化物酶体有关。
该预测结果符合其促分裂素原活化蛋白激酶的身份。
MAP 级联反应主要通过丝 / 苏 / 酪氨酸的磷酸
化作用推进。S_TKc 结构域由十几个保守半胱氨
酸残基组成，具有丝 / 苏氨酸激酶催化功能，经上
游 MAPK 激 酶 MKK3 和 MKK6 激 活， 可 将 ATP 的
γ 磷酰基转移到蛋白质丝 / 苏氨酸残基上，是细胞
外信号反应的重要介质［24］。其催化核心的 N 端存
在一个 LLLL 富集区，这个区域可能与 ATP 的结合
有关。TyrKc 酪氨酸激酶结构域与 S_TKc 功能基本
相同，包含活性位点、ATP 结合位点和底物结合位
点，可催化 ATP 的 γ 磷酸基团转移到专一性底物如
蛋白丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基基团［24］。
MAPK 级联放大过程中存在一个 Ras-Raf-MAPKK-
MAPK 信号转导通路，该通路则需要 RasGap 结构
域的参与，Ras 在 PTKs 介导的信号通路中也是一
种关键组分。Ras 蛋白是 ras 基因表达产物，具有
GTPase 活性，分布于质膜胞质一侧，结合 GTP 时
为活化状态，而结合 GDP 时为失活态，所以 Ras 蛋
白也是 GTPase 开关蛋白［25］。Yamakawa［26］通过对
逆转录病毒法处理的小鼠 B 细胞进行筛选，发现
RasGAP 结合蛋白 Dok-1 作为一个酪氨酸磷酸化激
活分子作用于其途径的下游，但其本身并没有被磷
酸化，从而证明 Dok-1 是连接激活素受体与 Smad
蛋白的重要分子。Smads 家族蛋白可以将 TGF-β 信
号从细胞表面受体传导至细胞核，因此，RasGAP
结构域间接地激活或抑制了靶基因的转录［27］。预
测 MAPK13 氨基酸序列有 19 个可以成为蛋白质激
酶磷酸化的位点，某些位点被磷酸化后，可导致
一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化，如
胰岛素增敏激素，脂联素（adiponectin）的表达减
少［28，29］，从而推测其磷酸化反应过程可能与脂肪
代谢相关联。保守结构域预测结果分析表明，兰州
大尾羊 MAPK13 蛋白序列中含有 3 个磷酸化功能结
构域 ：S_TKc 丝 / 苏氨酸激酶结构域、TyrKc 酪氨酸
激酶结构域和 Rio 丝氨酸激酶结构域，1 个 RasGAP
信号传导结构域，1 个 CPSase_sm 谷氨酰胺氨基转
移酶结构域，1 个 IENR1 核酸内切酶结构域，1 个
MgtE_N Mg2+ 转运结构域。说明 MAPK13 基因可能
通过磷酸化调控兰州大尾羊脂肪代谢和局部沉积，
是研究兰州大尾羊尾部脂肪细胞分化的重要候选
基因。
4 结论
应 用 RACE 技 术 首 次 克 隆 了 兰 州 大 尾 羊
MAPK13 基 因 1 397 bp 全 长 cDNA 序 列（ 登 录 号 ：
KF770837），并对其核苷酸与编码氨基酸序列特性
进行了研究，为进一步研究绵羊 MAPK13 基因功能
提供参考。
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（责任编辑 李楠）