全 文 ：·综述与专论· 2012年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
蛋白质的结构和功能研究需求高产量、高纯度
的重组蛋白分离纯化方法。目前常用亲和层析、离
子交换层析、疏水层析等层析技术分离纯化重组
蛋白。其中亲和层析是最为高效的分离纯化方法，
即用谷胱甘肽巯基转移酶蛋白、钙调蛋白结合肽、
FLAG 标签、S 肽标签和 His 标签等标记目的蛋白，
通过偶联特异亲和配基的吸附介质分离纯化目的蛋
收稿日期 : 2012-05-14
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31070822）, 辽宁省教育厅高校科研究计划项目（L2010015）
作者简介 : 林衡 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 重组蛋白 ; E-mail: heng.lin616@gmail.com
通讯作者 : 许崇波 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 基因工程与微生物分子生物学 ; E-mail: xuchongbo@dlu.edu.cn
胡学军 , 男 , 副教授 , 研究方向 : 重组蛋白 ; E-mail: huxuejun@dlu.edu.cn
类弹性蛋白标签在重组蛋白分离纯化中的应用
林衡1，2  许崇波2  孙利慧2  胡学军2
（1 大连大学生命科学与技术学院，大连 116622 ；2 大连大学医学院，大连 116622）
摘 要 ： 类弹性蛋白（elastin-like polypeptide，ELP）是一种非常有前途的重组蛋白分离纯化标签。这种人工合成的蛋白质
多肽是由五肽重复序列单元（VPGXG）串联组成，具有温度诱导的可逆相变特性。ELP 与目的蛋白融合后，赋予重组蛋白相类似
的可逆相变性质。多次可逆相变循环（inverse transition cycling，ITC）之后，就可以从蛋白溶液混合液中选择性地分离出 ELP 融合
蛋白，再经特异性酶切或者改变环境条件引发内含肽发生自我剪切去除 ELP 标签，从而得到单一的目的蛋白，实现简单快速分离
纯化重组蛋白。目前，该技术已成功应用于原核大肠杆菌和植物表达系统中。大肠杆菌表达 ELP-绿色荧光融合蛋白的最高产量可
达 1.6 g/L。这种非色谱分离纯化重组蛋白的方法具有技术简单、操作快速、成本低、易于扩大等优点。重点从该技术的原理、技
术路线以及发展方向进行综述。
关键词 ： 类弹性蛋白标签 可逆相变 重组蛋白 分离纯化
Application of Elastin-like Polypeptide Tag for Recombinant
Proteins Purification
Lin Heng1，2 Xu Chongbo2 Sun Lihui2 Hu Xuejun2
（1 College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622 ；2 College of Medicine，
Dalian University，Dalian 116622）
Abstract:  Elastin-like polypeptide（ELP）is an extremely promising recombinant protein purification tag. The artificial polypeptides
consist of repeats of the pentapeptide（VPGXG）with a reversible phase transition at a specific temperature. ELP fusion protein retains this
behavior when a target protein is fused to the ELP at the gene level. Once isolating a recombinant ELP fusion protein from the protein solution by
repeating inverse transition cycling（ITC）, the ELP tag can be proteolytically removed, or self-cleave mediated by intein in response to solution
condition shift, then we can recover the pure target protein. At present, the method is used successfully in expression systems such as E.coli and
plants. The highest yield of GFP-ELP fusion protein is 1.6 g/L in E.coli. This non-chromatographic purification method is simple, rapid, cost-
effective, and easy to scale up. This review summarizes mechanism, technical route and development direction of this method.
Key words:  Elastin-like polypeptide tag Reversible phase transition Recombinant proteins Purification
白［1］。虽然利用这些亲和标签分离纯化的重组蛋白
可以满足大多数生物应用需求，但是该技术操作费
时，需要特殊的分离设备和试剂，大规模生产成本
较高。
ELP 是 一 种 新 型 的 重 组 蛋 白 分 离 纯 化 标 签。
ELP 是根据弹性蛋白疏水区域的重复氨基酸序列
（VPGVG）人工合成的蛋白质聚合物，主要结构由
2012年第12期 41林衡等 ：类弹性蛋白标签在重组蛋白分离纯化中的应用
五肽重复序列单元（VPGXG）n 串联组成，其中客
座残基 X 可以是除脯氨酸以外的任一氨基酸，n 代
表 ELP 链中五肽重复次数。ELP 具有温度诱导的
可逆相变性质，当溶液温度低于相变温度（inverse
temperature transition，Tt）时，ELP 以单体形式溶于
水溶液中。若温度高于 Tt，ELP 呈聚集态并从水溶
液中析出 ；但当温度恢复到 Tt 以下时，ELP 又会重
新溶解 ；并且溶液温度只改变 2-3℃即可发生两相
之间的转变［2-5］。
Meyer 等［6］在一系列 ELP［V5A2G3］-n（n=10-
180）基因上融合硫氧还蛋白基因，经大肠杆菌表达
后的 ELP 融合蛋白同样具有可逆相变性质，利用
ITC 技术从菌体裂解液中分离出了至少 40 mg/L 硫
氧还蛋白 -ELP 融合蛋白，凝血酶切除 ELP 标签后，
收集到硫氧还蛋白。Scheller 等［7］应用此方法第一
次在转基因烟草叶中分离出 80 mg/kg ELP 融合的蜘
蛛丝蛋白。Banki 等［9］首次引入可以自我剪切的内
含肽系统。与传统的蛋白酶切 ELP 标签方法相比，
不存在酶切反应慢和酶非特异切除目的蛋白的情况，
也无需切除反应后分离蛋白酶程序，大幅度降低了
分离纯化成本，提高了重组蛋白的纯化效率。目前
ITC 方法已成功分离出绿色荧光蛋白、氯霉素乙酰
转移酶、白介素 -1 受体拮抗剂等多种重组蛋白［8， 10］。
这种通过 ITC 分离纯化含 ELP 标签的重组蛋白
方法，技术简便，操作快速，蛋白纯化量不受树脂
吸附能力的限制，只需常规离心机或过滤装置即可
分离出与亲和色谱纯度相当的目的蛋白［11］。因此，
这种经济简便的重组蛋白分离纯化方法越来越成为
该领域的研究热点。
1 ELP 的相变机理
ELP 在发生相变过程中，其二级结构发生了明
显的变化。当溶液温度低于 Tt 时，ELP 的（VPGXG）
重复单元在 Pro-Gly 处是 β-转角结构，此时构象无序
且伸展 ；当温度高于 Tt 时，ELP 单链由重复 β-转角
转变成较紧凑的右手 β-螺旋结构，随后不同 ELP 链
间形成更为紧凑的 β-折叠构象。ELP 二级结构的变
化是由多肽 - 多肽、多肽 - 溶剂之间相互作用转变
所驱动的。当温度低于 Tt 时，水与 ELP 极性基团以
氢键结合，同时在疏水基团的斥力作用下，疏水基
团周围水分子之间的氢键键合作用增强，形成有序
的水分子，此时 ELP 以单体形式溶解于水溶液中 ；
当温度高于 Tt 时，氢键作用减弱，疏水基团周围的
有序水分子变成无序状态。疏水基团之间的疏水作
用反而增强，导致疏水基团相互集聚，ELP 便从水
溶液中析出［5，12，13］，这个相变过程是完全可逆的。
其相变机理，如图 1 所示。
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图 1 ELP 的相变机理图
ELP 的 Tt 取决于其序列、长度、浓度以及溶液
的离子组成和 pH。一般的，客座氨基酸残基 X 疏水
性越强，ELP 的 Tt 越低
［14］。对于由相同五肽重复序
列组成的不同长度 ELP，随着分子质量增加，Tt 降低。
对于既定的 ELP，随着 ELP 浓度增加，Tt 呈对数式
降低［15］。溶液中盐浓度越高，水分子和疏水基团之
间的极性越强，疏水水合作用越弱，Tt 越低。而且
ELP 链中离子化残基部分越多，Tt 随盐浓度的变化
趋势越明显。盐离子种类对 Tt 影响的强弱顺序则与
感胶离子序一致［16，17］。另外，溶液 pH 在一定程度
上也影响 Tt，当 pH 为客座氨基酸 pKa 值时，蛋白
离子化残基部分最少，Tt 最低
［13］。
2 ELP 标签在重组蛋白分离纯化中的应用
利用 ITC 技术分离含 ELP 标签的重组蛋白具体
操作如下 ：首先利用基因工程技术使 ELP 基因融合
一段目的蛋白基因，经大肠杆菌或者植物表达系统
表达之后，收集菌体或者植物组织。加热或加盐沉
淀细胞裂解液或者植物组织提取液中的 ELP 融合蛋
白，离心收集沉淀。接着用温度低于 Tt 并且离子强
度较弱的缓冲液重新溶解沉淀。为了去除与 ELP 融
合蛋白一起沉淀但不可再溶解的杂质，再将重悬液
离心，上清即为 ELP 融合蛋白。这样就完成了第一
轮 ITC。一般 ELP 基因和目的蛋白基因之间存在蛋
白酶底物基因或者可以自我剪切的内含肽基因，经
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期42
过特异的蛋白酶切或者改变溶液条件引发内含肽剪
切后，ELP 标签便与目的蛋白分开。加热或加盐沉
淀 ELP 标签，离心后上清便是不含 ELP 标签的目的
蛋白。重复多次 ITC 循环可以进一步提高目的蛋白
纯度［18］。利用 ITC 分离纯化重组蛋白具体流程，如
图 2 所示。
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ELPⓦਸ㳻ⲭ1. 2. E. coliਟⓦᙗޘ㳻ⲭ
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keep supernatant centrifugation
⿫ᗳ ᔳк␵ ⿫ᗳ
T>Tt 䟽ᛜ⊹⏰TT图 2 ITC 分离纯化流程图
2.1 ELP标签的选择
选择正确的 ELP 标签对目的蛋白分离纯化条件
和效率至关重要。若 ELP 标签 Tt 太高，加热升温过
高容易影响目的蛋白的稳定性。虽然增加 ELP 链中
疏水氨基酸比例会降低 Tt，但疏水性太强的 ELP 标
签会增加热相变沉淀中杂蛋白的量［18］。而 ELP 标签
过长降低了目的蛋白在 ELP 融合蛋白中所占的比例，
导致目的蛋白的相对表达量下降［19］。另外，鉴于重
组蛋白表达量通常较低，所选 ELP 标签必须在低于
100 μmol/L 浓度下便可发生相变［15］。因此，ELP 标
签优先选择在温和条件下就能高效分离重组蛋白的
最短肽段。几种已成功应用于重组蛋白分离纯化的
ELP 标签，如表 1 所示。
2.2 目的蛋白的选择
目前研究表明，适合应用 ITC 方法分离纯化的
目的蛋白大小一般为 4-30 kD［18］。另外，因为目的
蛋白表面的亲水性基团会影响溶剂和 ELP 标签之间
的相互作用，导致 ELP 标签附近水合作用发生改变，
因此 ELP 融合蛋白 Tt 也受目的蛋白的影响，这种影
响被称为“融合 ΔTt 效应”。与 ELP 标签 Tt 相比，
融合疏水性蛋白质使 Tt 降低，相反融合亲水性蛋白
质使 Tt 升高
［22］。而融合蛋白表面电荷对 ELP 标签
Tt 的影响正在研究当中
［23］。基于这个微环境效应，
可以在目的蛋白上连接配体，进一步调整 ELP 融合
蛋白 Tt，方便分离纯化操作
［22，24］。
2.3 ELP标签与目的蛋白的相对位置
把 ELP 标签设计在目的蛋白 N 端还是 C 端是
没有固定模式的，主要取决于目的蛋白的性质。如
果目的蛋白表达水平很高，N 端的 ELP 标签会干扰
目的蛋白的正确折叠。这种情况下，把 ELP 标签设
计在目的蛋白 C 端可能更合适，因为目的蛋白翻译
结束后才开始翻译 ELP，这样就减少了 ELP 对目的
蛋白折叠的干扰。如果目的蛋白表达水平相对低些，
氨基酸序列 Tt［℃］
a 分子量［kD］ 溶液环境
ELP［V5A2G3］-90
［6］ 51 35 PBS
ELP［V5A2G3］-110
［7］ 37 42.8 1.5 mol/L NaClb
ELP［A］-100［16］ 40 43 2 mol/L NaClb
ELP［V］-30［20］ 37 12.3 3 mol/L NaClb
ELP［V］-28［21］ 22 11.7 4.5 mol/L NaClb
表 1 常用的 ELP 标签
a. Tt 是指 25 μmol/L ELP 溶解在 PBS 中的相变温度 ；b. NaCl 溶解在 PBS 缓冲
液中
2012年第12期 43林衡等 ：类弹性蛋白标签在重组蛋白分离纯化中的应用
把 ELP 标签设计在目的蛋白 N 端，提高了目的蛋白
的可溶性表达量。这可能是由于 ELP 通过与尚未折
叠成熟的目的蛋白链之间的疏水作用，协助了目的
蛋白的正确折叠，并且通过空间位阻效应阻止了目
的蛋白折叠时中间态分子之间的集聚［10，15］。
2.4 ELP融合蛋白的表达
原核大肠杆菌和植物表达系统已成功地表达
了 ELP 融合蛋白。因为 ELP 具有高度重复的基因
序列，所以，实验室常选用缺失 recA 基因的 BLR
（DE3）大肠杆菌菌株作为表达菌株［13］，并且采用
无需 IPTG 等诱导物的过夜自动诱导表达方式，避免
了细菌因增值太快导致的代谢应激效应，也降低了
生产成本。经过表达条件以及后续分离纯化条件的
优化，ELP 标记的绿色荧光蛋白最大产量可达到 1.6
g/L［25］。但是大肠杆菌表达系统缺少真核细胞的翻
译后修饰过程，所以当二硫键或者糖基化是目的蛋
白活性功能必不可少的结构时，就得改用其他的表
达系统。而植物表达系统表达的 ELP 融合蛋白，不
仅保留了生物活性和适当的糖基化模式，而且不存
在人类病原菌，生物安全性好。与不含 ELP 标签的
重组蛋白相比，ELP 融合蛋白经内质网修饰后，会
形成双层膜包被的蛋白体，避免了正常的生理降解，
从而逐渐积累在细胞中，大大提高了目的蛋白的表
达量［26，27］。
2.5 ELP标签的切除方法
为了分离不含 ELP 标签的目的蛋白，在目的蛋
白和 ELP 标签之间插入了一段中间肽序列［15］。这
个中间肽序列编码了蛋白酶切割位点，或者可以自
我剪切的内含肽。常用的蛋白酶有 X 因子和凝血酶，
但是蛋白酶会非特异切除目的蛋白，酶切反应慢，
酶切反应温度可能影响目的蛋白的稳定性，况且需
要后续蛋白酶分离程序。常用的内含肽系统有两种，
一种是基因工程筛选的变异小分子内含肽，特定 pH
和温度可以引发其 C-末端发生快速的自身剪切反应；
另一种则是天然小分子内含肽，在反应体系中加入
硫醇后，在其 N-末端可以发生自我剪切反应。内含
肽系统大幅度提高了 ELP 标签特异性切除效率［28-30］。
3 展望
基于 ELP 标签的 ITC 技术是一种非色谱分离
重组蛋白的方法。与传统柱层析技术相比，该技术
具有操作简便快捷、经济、蛋白产量不受树脂吸附
能力限制等优点。当然也有需要改进的地方，如当
ELP 融合蛋白表达浓度低于 1 μmol/L 时，由于 ELP
相变性质具有浓度依赖性，故目的蛋白分离纯化效
率很低。在溶液中添加 ELP 单体多肽，通过增加溶
液中 ELP 浓度，能提高 ELP 融合蛋白的相变沉淀效
率［31］。再者，选用 pH 和温度敏感的内含肽系统时，
宿主细胞内 pH 和温度很容易使 ELP 融合蛋白在细
胞内发生切除反应。通常通过降低表达温度（12-
15℃）可以减少这种情况的发生［28］。另外，需要继
续优化 ELP 标签、ITC 条件，从而进一步提高重组
蛋白产量和纯度。
最近，基于 ELP 标签的 ITC 技术有了更深入的
发展。在目的蛋白和 ELP 标签之间插入了第二个纯
化标签（如 His6 标签），保证切除 ELP 标签后可以
结合传统层析方法进一步纯化目的蛋白。用半胱氨
酸或者赖氨酸取代 ELP 的客座残基位点，使 ELP 标
签可以在特异位点与小分子交联。例如，ELP 标签
可以结合核苷酸片段，实现了与核酸适配体亲和色
谱技术的联用。最近又衍生了一种联用 ITC 和亲和
捕捉的间接 ITC 技术，通过基因工程或者化学修饰
把 ELP 连接到能特异可逆结合目的蛋白的捕捉分子
上，在 ELP-捕捉分子和细胞裂解液中的目的蛋白结
合之后，再经传统 ITC 分离程序便可纯化出目的蛋
白。此方法无需蛋白酶或者化学反应切除 ELP 标签，
而且 ELP-捕捉分子可以重复利用。例如，利用基因
工程技术在 ELP 链中插入一段可与 Ni2+ 结合的金属
结合区域，ELP-Ni2+ 就可以通过金属亲和捕捉方法
纯化带有寡聚组氨酸（His6）标签的蛋白［23，26］。
现阶段 ITC 技术分离纯化重组蛋白的研究主要
需要解决以下几个问题 ：第一，选择合适疏水性和
极性的客座氨基酸 X、设计各不同客座氨基酸残基
的数量和排列顺序，并严格设计五肽的重复数。第二，
根据“融合 ΔTt 效应”，针对不同疏水性和极性的目
标蛋白，融合不同的 ELP 标签。第三，选择目标蛋
白和 ELP 标签的最佳融合顺序，并选择合适的表达
载体、表达菌株和表达条件，提高 ELP 融合蛋白的
表达浓度。第四，通过添加合适种类和浓度的盐离
子，优化 ITC 分离纯化条件。从而筛选出相变温度低，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期44
分子量小的 ELP 标签，通过优化的 ITC 分离纯化条
件，在温和的条件下分离纯化出高纯度具有天然活
性的目标蛋白。随着 ELP 在重组蛋白分离纯化方面
深入研究，ELP 作为重组蛋白分离纯化标签将会有
更加广阔的应用前景。
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（责任编辑 狄艳红）