全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-05-09
作者简介 ：李爽，男，硕士，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail:lishuang509@163.com
通讯作者 ：吕暾，男，博士，研究方向 ：蛋白质设计 ；E-mail:lvtun@fzu.edu.cn
犬细小病毒 VP2 基因在枯草芽孢杆菌中的表达及鉴定
李爽 黄文斌 黄爱玲 吕暾
（福州大学生物科学与工程学院，福州 350108）
摘 要: 从犬细小病毒 / 犬瘟热二联苗中提取 CPV 基因组，根据 GenBank 发表的 CPV-VP2 基因序列设计一对引物，对 VP2
基因进行 PCR 扩增，并克隆至 TA Cloning® Kit Dual Promoter （pCR Ⅱ），获得克隆载体 pCR -VP2。将重组质粒亚克隆到枯草芽
孢杆菌表达载体 pHT43 上，获得重组表达载体 pHT43-VP2。经双酶切鉴定及序列比对分析后，将 pHT43-VP2 载体转化入枯草芽
孢杆菌 WB600 中进行诱导表达，产物使用 PAGE 胶蛋白回收法纯化。结果表明，在 69 kD 处存在目的蛋白，ELISA 检测发现，纯
化后的目的蛋白与阳性血清存在特异性反应。
关键词: 犬细小病毒 VP2 蛋白 枯草芽孢杆菌
Expression and Characterization of Canine Parvovirus VP2
Gene in Bacillus subtilis
Li Shuang Huang Wenbin Huang Ailing L Tun
（College of Biological Science and Technology， Fuzhou University，Fuzhou 350108）
Abstract: The genome of CPV was extracted from CPV/CDV vaccine. A pair of primers was designed according to the sequence of CPV-
VP2 gene from GenBank. Polymerase chain reaction （PCR） was used to amplify the VP2 gene. Then the fragment was cloned into TA Cloning®
Kit Dual Promoter （pCR Ⅱ） to obtain a cloning vector pCR Ⅱ -VP2. Then the recombinant plasmid was subcloned into the expression vector
pHT43 named pHT43-VP2. The pHT43-VP2 was verified by restriction enzymes and nucleotide sequence analysis. The expression vector was
transformed into Bacillus subtilis and the expressed product was recovered from PAGE gel. The results showed that VP2 protein expressed has
69 kD of molecular weight. ELISA revealed that the protein expressed in B. subtilis can be recognized by the positive serum of CPV.
Key words: Canine Parvovirus VP2 protein Bacillus subtilis
1977 年， 美 国 首 先 发 现 犬 细 小 病 毒（canine
parvovirus，CPV），该病毒属细小病毒科，细小病毒属，
为单链 DNA 病毒 [1]。CPV 的感染对象主要是犬，特
别是幼犬，具有很强的传染性和较高的死亡率。此外，
CPV 一年四季均可发病，且冬、春多发 [2]。该病毒
在全球其他地区陆续被发现，并造成严重经济损失，
成为对犬类危害最大的传染病之一。
完整的 CPV 颗粒直径 21-24 nm，外观呈六边
形，衣壳蛋白无囊膜，不含脂质和糖类 [3]。CPV 是
最小的 DNA 病毒，基因组全长仅 5 323 bp，Rhode[4]
和 Reed[5] 分别克隆了 CPV 全基因组，并测定了核苷
酸序列。CPV 基因组含有两个开放阅读框架 ：3 端
开放阅读框架编码非结构蛋白 NS1 和 NS2，即早期
转录的调节蛋白 ；5 端开放阅读框架编码结构蛋白
VP1 和 VP2，即晚期转录的病毒衣壳蛋白 [6]。
当前研究最为广泛的是 VP2 蛋白。VP2 蛋白是
CPV 的免疫原性蛋白，能够激发动物免疫反应，产
生中和抗体 [7]。VP2 基因全长 1 755 bp，编码 584 个
氨基酸，CPV 的抗原特性和宿主范围由 VP2 上的关
键碱基和氨基酸决定 [8]。CPV 的 B 细胞抗原表位区
存在于 VP2 基因的 N 端，以及 VP2 蛋白转角结构区
loop1 和 loop3，这些氨基酸残基变化导致了 CPV 毒
株抗原漂移 [9]。因此，利用分子生物学的方法，对
VP2 基因进行体外表达，建立间接 ELISA 检测体系，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期172
为 CPV 的诊断和疫苗研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质 粒 和 菌 株 TA Cloning® Kit Dual Promoter
（pCR® Ⅱ）购自 Invitrogen 公司 ；质粒 pHT43 购自于
MO Bi Tec（Germany）；枯草芽孢杆菌 WB600 购自
江南大学 ；犬细小病毒 / 犬瘟热二联苗购自 Intervet
公司 ；大肠杆菌 DH5α、JM109 由本室保存。
1.1.2 主要试剂 限制性内切酶 Sma Ⅰ、Xba Ⅰ，
T4 DNA Ligase、DNA Marker 等购自宝生物工程（大连）
有限公司 ；HRP 标记的羊抗小鼠 IgG 抗体购自天根
生化科技（北京）有限公司 ；IPTG、X-gal、PAGE
胶蛋白微量回收试剂盒购自上海生物工程有限公司；
其他常规生化试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 病毒基因组 DNA 提取 使用酚 / 氯仿抽提法
得到 CPV 基因组。将二联疫苗干粉溶解在适量 TE 中，
加入酚 / 氯仿（1 1），漩涡混匀。离心后上清加入
等体积的氯仿，颠倒混匀。离心后转移上清，并加
入醋酸钠（3 mol/L，pH5.2）和无水乙醇，沉淀得到
核酸。核酸用 70% 乙醇洗涤，弃上清，使液体挥发
干净，重新溶解于适量超纯水中。
1.2.2 引物的设计和 PCR 扩增 根据 GenBank 发表
的 CPV-VP2 序 列， 利 用 Primer Premier 5 和 Oligo 6
等软件进行序列分析，在此基础上设计一对特异引
物 ：上游引物 5-TCAGTCTAGAATGAGTGATGGAGC
AGTT-3 和 下 游 引 物 5-CAGTCCCGGGTTAATATAA
TTTTCTAGG-3，下划线为别为 Xba Ⅰ和 Sma Ⅰ酶切
位点。
在 PCR 管中依次加入 25 μL PCR Mix，20 μL 超
纯水，上下游引物各 2 μL，基因组模板 1 μL，总体
积为 50 μL。PCR 扩增程序为 ：94℃预变性 5 min ；
94℃变性 45 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，循
环 30 次 ；最后 72℃延伸 10 min。反应结束后，取 2
μL PCR 产物经 1% 琼脂糖电泳鉴定，并纯化。
1.2.3 克隆和表达载体的构建及鉴定 纯化的 PCR
产物与克隆载体 pCR® Ⅱ Vector 按 3 1-10 1 的比例
16℃连接过夜，转入大肠杆菌 DH5α，使用蓝白斑
筛选，并用 Sma Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切鉴定。构建成功
的克隆载体命名为 pCR® Ⅱ -VP2，菌液送 Invitrogen
测序。
用 Sma Ⅰ和 Xba Ⅰ将外源基因定向克隆于枯
草芽孢杆菌表达载体 pHT43，转化大肠杆菌 JM109，
并双酶切鉴定。构建成功的表达载体命名为 pHT43-
VP2，菌液送至 Invitrogen 测序。
1.2.4 表达载体转化枯草芽孢杆菌 采用感受态细
胞法 [10]。将构建好的表达载体 pHT43-VP2 转化进入
枯草芽孢杆菌 WB600，同时将空载体 pHT43 转化入
枯草芽孢杆菌 WB600 作为阴性对照。
1.2.5 重 组 载 体 在 枯 草 芽 孢 杆 菌 中 的 表 达 与 纯
化 挑取含 pHT43-VP2 的 WB600 单菌落，37℃过
夜培养。第 2 天按 1 100-1 50 转接到新的 LB 培
养基中，培养至对数期。加入终浓度为 1 mmol/L
的 IPTG，37℃诱导表达 6 h。同时设空载体 pHT43
为阴性对照。产物使用 PAGE 胶蛋白微量回收试剂
纯化。
1.2.6 间接 ELISA 检测方法的建立 使用犬细小病
毒 / 犬瘟热二联苗免疫小鼠，按 50 μg/ 只用量，腹
腔注射抗原。初次免疫后再加强免疫 3 次，最后一
次免疫 10 d 后大量制备抗 CPV 的小鼠血清。同时用
生理盐水注射小鼠，作为阴性对照。
将 重 组 蛋 白 按 3 μg/mL， 包 被 酶 标 板， 每 孔
100 μL， 用 5% 脱 脂 奶 粉 封 闭。 阳 性 血 清 和 阴 性
血 清 按 1 80、1 160、1 320、1 640 共 4 个 梯 度
做 ELISA 方 阵 试 验，HRP 标 记 的 羊 抗 小 鼠 IgG 以
1 8 000 稀释。加入底物 TMB 溶液，室温避光显色
10-15 min 后终止反应。
2 结果
2.1 VP2基因的扩增
扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析，得到一
条约 1 755 bp 的片段，与预期结果一致（图 1）。
M.DNA Marker ；1.VP2 基因 PCR 扩增产物
图 1 VP2 基因的 PCR 扩增
2011年第12期 173李爽等 ：犬细小病毒 VP2 基因在枯草芽孢杆菌中的表达及鉴定
2.2 克隆载体双酶切
pCR II-VP2 经双酶切后，可见两条大小分别为
1 755 bp 和 4 000 bp 左右的条带，证明目的基因已
经插入 pCR Ⅱ多克隆位点（图 2）。
2.5 蛋白纯化
采用 PAGE 胶蛋白回收的方法，得到纯化的重
组蛋白，有一条清晰的目的片段（图 5）。
稀释倍数 阴性血清 阴性血清 阳性血清 阳性血清 空白
1/80 0.257 0.249 0.493 0.437 0.208
1/160 0.243 0.238 0.454 0.433 0.208
1/320 0.235 0.229 0.421 0.417 0.177
1/640 0.226 0.220 0.406 0.401 0.133
表 1 VP2 蛋白的 ELISA 方阵（OD450）
M.DNA Marker ；1.Sma Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切 pCR II-VP2
图 2 pCR Ⅱ-VP2 双酶切鉴定
2.3 重组表达载体双酶切
pHT43-VP2 经双酶切后，可见两条大小分别为
1 755 bp 和 8 000 bp 左右的条带，证明目的基因已
经插入 pHT43 多克隆位点（图 3）。
M.DNA Marker ；1.Sma Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切 pHT43-VP2
图 3 pHT43-VP2 双酶切鉴定
2.4 诱导表达
采 用 感 受 态 细 胞 法， 将 构 建 好 的 表 达 载 体
pHT43-VP2 转化进入枯草芽孢杆菌 WB600，同时以
空载体作为阴性对照。结果（图 4）显示，在 69 kD
处存在明显条带，与预期结果一致。
M.Protein Marker;1. pHT43 在 WB600 中诱导 ;2. pHT43-VP2 在 WB600 中诱导
图 4 表达产物 SDS-PAGE 分析
M.Protein Marker ；1.pHT43-VP2 在 WB600 中诱导 ；2. 纯化的蛋白
图 5 纯化蛋白分析
2.6 免疫原性鉴定
纯化后的重组蛋白，采用间接 ELISA 法进行检
测，结果（表 1）显示，VP2 蛋白可以与阳性血清
发生特异性反应，证明该蛋白具有免疫原性。
3 讨论
1958 年 Spizizen 等 [11] 发现了易于接受外源基因
的 168 菌株，枯草芽孢杆菌的研究也进入了新的阶
段。迄今为止，α-淀粉酶，碱性磷酸酶等工业酶制
剂已成功在枯草芽孢杆菌得到表达，并大规模生产。
Lope 等 [12] 使用昆虫杆状病毒表达系统成功表
达了 CPV-VP2 蛋白，且微量的表达蛋白就能对犬产
生良好的免疫反应。李慕瑶等 [13] 构建了原核重组表
达载体 pET30a-VP2，转化大肠杆菌并诱导表达，免
疫印迹证明该重组蛋白具有免疫原性。张云霞等 [14]
构建了真核重组表达载体 pPICZαA-VP2，并在毕赤
酵母菌中表达，Western blotting 表明 VP2 蛋白可以
与 CPV 阳性血清反应。
4 结论
本研究成功将 CPV-VP2 基因克隆到 pHT43 表
达载体上，构建了 pHT43-VP2 重组表达载体，并转
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化入枯草芽孢杆菌 WB600 中诱导表达。结果表明，
在 69 kD 处存在目的蛋白，ELISA 检测纯化后的目
的蛋白与阳性血清存在特异性反应，从而为犬细小
病毒基因工程疫苗和新型诊断试剂盒的研制提供理
论基础及试验材料。
参 考 文 献
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