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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
小 GTP 酶广泛地参与真核生物细胞中的各项生
命活动，发挥着十分重要的作用［1］。Arf 家族是一
类最先被报道的小 GTP 酶，主要功能是参与膜运输
和细胞骨架的装配，其成员包括 Arf1-6［2］。其中，
Arf6 在它的信号通路中，通过调节细胞膜和细胞骨
架的动力学活性来实现胞内生物膜系统的循环和细
胞骨架的装配［3］。越来越多的研究揭示，Arf6 还对
胞外分泌的调节［4，5］、胞质分裂［6］、肿瘤细胞的迁
收稿日期 ： 2013-01-29
作者简介 ：谢长林，男，硕士，研究方向 ：蛋白质结构与功能 ；E-mail ：xclkush1988@163.com ；芮斌同为第一作者
通讯作者 ： 唐雅珺，女，博士，讲师，研究方向 ：蛋白质结构与功能 ；E-mail ：tangyj@ustc.edu.cn
文汉，男，硕士，副教授，研究方向 ：生物大分子提取 ；E-mail ：lifwen1000@163.com
人源 EFA6A 蛋白 Sec7 结构域的克隆表达与纯化
谢长林1  芮斌1  江娜1  赵晨2  唐雅珺2  文汉1
（1. 安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036 ；2. 中国科学技术大学生命科学学院，合肥 230026）
摘 要 : 作为小 GTP 酶 Arf6 的鸟甘酸交换因子（GEF），人 EFA6A 蛋白主要包含 PH 和 Sec7 两个结构域，Sec7 是行使 GEF
功能的核心区域。通过分析 Jpred、Uniprot 等生物信息学软件的预测结果，从全长 1 024 aa 中选取的重组 Sec7 结构域的边界为
506-719，共 214 aa。以人脑 cDNA 文库为模板，通过优化 PCR 程序成功扩增出 Sec7 基因，经 Nde I 和 Xho I 双酶切后亚克隆至原
核表达载体 p28a 中，成功构建 p28-Sec7 重组子，测序结果与 NCBI 中公布的序列 100% 吻合。将重组质粒 p28- Sec7 转化至 BL21-
Gold（DE3）宿主菌中，终浓度 0.3 mmol/L IPTG、16℃、24 h 诱导表达，重组蛋白经过 Ni 柱和分子筛两步纯化。试验结果显示，
重组 Sec7 成功表达，性质均一，纯度高于 95%，表达量为 70 mg/L。
关键词 : Arf6 人 EFA6A Sec7 表达 Ni-NTA 柱 分子筛
Cloning，Expression，Purification of Sec7 Domain of
hEFA6A Protein
Xie Changlin1 Rui Bin1 Jiang Na1 Zhao Chen2 Tang Yajun2 Wen Han1
（1. College of Life Science of Anhui Agriculture University, Hefei 230036 ；2. College of Life Science of University of Science &
Technology China, Hefei 230026）
Abstract:  As a GEF for the small GTPase Arf6, hEFA6A contains two domains which are pH domain and Sec7 domain. Sec7 domain is
the key central domain that executes the function as a GEF. By analyzing the prediction results from Jpred and Uniprot, we chose the boundary
contained 214 aa （506-719） from the full-length （1 024 aa） of hEFA6A. Sec7 gene fragment was cloned from homo brain cDNA library and
ligated to p28a vector after Nde I and Xho I double digestion. Then the constructive vector p28a-Sec7 was transferred to BL21-Gold （DE3）
competent cell for expression. The final concentration of IPTG was 0.3 mmol/L and E.coli cells were cultivated at 16℃ for 24 hours. The
recombinant protein was then purified by Ni-NTA affinity chromatography and GE superdexS200 gel filtration column. Our results showed that
Sec7 gene and the constructive vector p28a-Sec7 were acquired successfully. The sequence of Sec7 was completely matched with the sequence
reported in NCBI. We had a high expression of 70 mg/L and harvested the 95% purity target protein successfully.
Key words:  Arf6 hEFA6A Sec7 Expression Ni-NTA column Gel filtration
移［7］、细胞的吞噬作用［8］发挥着重要的作用。同其
他小 GTP 酶一样，一些特异性的 GEFs 和 GAPs 调
节 Arf6 的活性，和它一起参与到细胞内的各项生命
活动中。GEF 的催化机制是通过剥落结合在 Arf6 上
的 GDP，使 Arf6 能够重新与 GTP 结合，并从失活
态转变为活性态［9］。
人 EFA6 家 族 都 是 Arf6 的 GEF， 包 含 4 个 成
员 ：EFA6A、EFA6B、EFA6C 和 EFA6D。EFA6A 在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期82
脑组织中高表达，GEF 缺陷型 EFA6A 在神经细胞形
态上有利于树突的形成［10］。过表达 EFA6A 会促进
海马神经元细胞的神经棘生长［11］。它通过调节 Arf6
和胞外信号调节蛋白的活性，促进细胞的迁移和侵
袭［12］。EFA6A 在神经胶质瘤细胞迁移中也发挥作用，
另一方面它通过调节自身在神经细胞中的表达量来
参与到神经细胞的精加工活动中［9］。EFA6A 包含 3
个结构域 ：负责定位于膜上的 PH 结构域、调节肌
动蛋白细胞骨架装配的 Coiled-coil Motif 结构域和具
有催化鸟苷酸交换作用活性的 Sec7 结构域。这些结
构域在 EFA6 家族中都是十分保守的［13］。
本研究拟从人脑 cDNA 文库中克隆出 Sec7 结构
域的基因序列，再亚克隆至 p28a 表达载体中。将重
组质粒转化至宿主菌 BL21-Gold（DE3）中，IPTG
诱导表达，旨在为其结构和功能的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与细菌 p28a 质粒 ：pet28a（Thrombin）
改 造 后 的 新 型 载 体， 宿 主 菌 DH5α 和 BL21-Gold
（DE3）菌、人脑 cDNA 文库。以上均由中国科技大
学施蕴渝教授实验室提供。
1.1.2 酶 和 试 剂 Primer Star 来 自 TaKaRa 公 司，
限制性内切酶 Nde I、Xho I 和 T4 DNA 连接酶来自
Fermentas 公司。质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒是
OMEGA 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 生物信息学软件分析、引物的设计与合成
从 Uniprot 搜索 EFA6A 的边界信息，初步选取 450-
740 aa 长度的氨基酸序列作为 Sec7 结构预测的起始
片段。依据 Jpred 预测的结果，分析 PDB（Protein
Date Bank）中同源 Sec7 的结构特点，确定本研究重
组表达的 Sec7 的边界为 506-719，共 214 aa。根据
已测序的人 EFA6A 的基因序列，设计一对针对 Sec7
基因片段的引物，在上游引物加入 Nde I 酶切位点，
在下游引物中加入 Xho I 酶切位点，引物由上海英骏
有限公司合成。上游引物：5-ACGTCATATGGAGGA-
CAGCCTTGGGCTGGGGGCAG-3，下游引物：5-GCT-
ACTCGAGTCAGCGTCTCAGCTCCTCCTCGTCT-3（下
划线为 Nde I 及 Xho I 酶切位点）。
1.2.2 Sec7 基 因 的 克 隆 运 用 Touchdown PCR 法
（程序如表 1）从人脑 cDNA 文库中钓取目的基因。
程序结束后用 1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳回收纯化
目的基因片段。目的基因片段经 Nde I 和 Xho I 双酶
切后，亚克隆至表达质粒 p28a 中，16℃过夜连接，
将连接产物转化至感受态细胞 DH5α 中，卡纳抗生
素平板筛选后挑取 3 个单克隆，将初步鉴定为阳性
的克隆送至上海华大基因测序。
表 1 Touchdown PCR 程序
1.2.3 Sec7 的诱导表达 比对测序结果，经序列吻
合的特异性重组子编号保种。运用试剂盒抽提重组
质粒并转化至感受态细胞 BL21-Gold（DE3）中。挑
取单菌落接种于含 50 mg/L 卡那抗生素的 5 mL LB
培养基中 37℃过夜培养。隔天，1∶20 扩大培养至
100 mL LB 中，37℃培养至 OD 为 0.8-0.9 后，加入
终浓度为 0.3 mmol/L IPTG、诱导温度 16℃、时间 24 h。
1.2.4 Sec7 的 Ni-NTA 柱和分子筛纯化 目的蛋白
诱导 24 h 后，6 000 r/min 离心 10 min 收菌，50 mL
Binding Buffer （20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，
pH8.0）重悬菌体后超声破碎 8 min，13 000 r/min 离
心 30 min 取上清。当离心破碎液时，再生 Ni-NTA
柱，待离心结束后，取上清，流穿 Ni-NTA 柱。上
清 流 穿 结 束 后，Binding Buffer 洗 脱 10 mL，Wash
Buffer（30 mmol/L imidazole+Binding Buffer）洗脱 50
步骤 时间 温度
Step 0 3 min 94℃
Step 1 30 s 98℃
Step 2 30 s 60℃
Step 3 60 s 72℃
Loop to step 1 for 8 cycles
Step 4 30 s 9℃
Step 5 30 s 55℃
Step 6 60 s 72℃
Loop to step 4 for 8 cycles
Step 7 30 s 94℃
Step 8 30 s 45℃
Step 9 60 s 72℃
Loop to step 7 for 10 cycles
Step 10 2 min 72℃
2013年第5期 83谢长林等 ：人源 EFA6A 蛋白 Sec7 结构域的克隆表达与纯化
mL，Elution Buffer （300 mmol/L imidazole +Binding
Buffer）洗脱 20 mL。将含有目的蛋白的 Elution 溶液
浓缩至 5 mL，上样 Superdex200 柱，目的峰接样后
12%SDS-PAGE 蛋白电泳胶查看目的蛋白状态。
2 结果
2.1 生物信息学软件分析结果
Sec7 结 构 域 在 GEF-EFA6 家 族 中 非 常 保 守，
PDB 中已知的同源 Sec7 的结构一般由 9-11 个 α 螺
旋 组 成。Uniprot 中 提 供 的 Sec7 边 界 信 息 为 521-
706。Jpred 预测的 Sec7 结构域边界为 541-716，包含
10 个 α 螺旋，与同源的 Sec7 的 α 螺旋数相符。综合
所有信息学软件的分析结果，为了保证所有的 α 螺
旋能够被完整表达，此次试验向 N、C 两端各自延
长了数量不等的氨基酸，最终确定边界为 506-719
（图 1）。
2.3 表达载体的构建、PCR鉴定和测序
双酶切目的片段回收纯化后与 p28a 载体连接，
将重组质粒转化至感受态 DH5α 中，过夜 37℃培养。
挑取 3 个单克隆，菌液 PCR 结果均为阳性克隆（图
3），同时送样测序。测序结果表明，3 个阳性克隆
的目的基因序列与 Sec7（506-719）基因序列完全
吻合。
506 719
CCCN
521
541
706
716
Sec7 PH
521-706 为 Uniprot 给定的边界，541-716 为 Jpred 预测的边界，506-719 为
本研究选择的边界
图 1 EFA6A 的结构域全图
2.2 Sec7基因的克隆
以人脑 cDNA 文库为模板，利用特异性引物进
行 PCR 引物扩增，扩增产物经 1%（W/V）琼脂糖
凝胶电泳检测，在约 700 bp 左右的地方有一条特异
性的 DNA 条带（图 2），与预期的结果一致。
5000
bp
1 M
3000
2000
1000
750
500
250
100
1 ：Sec7 基因目的片段 ；M ：DNA Marker
图 2 PCR 电泳结果
1 ：①号单克隆菌液 PCR 结果 ；2 ：②号单克隆菌液 PCR 结果 ；
3 ：③号单克隆菌液 PCR 结果 ；M ：DNA Marker
5000
bp1 2 3 M
3000
2000
1000
750
500
250
图 3 菌液 PCR 鉴定结果
2.4 Sec7蛋白的Ni-NTA柱、分子筛纯化和SDS-
PAGE电泳分析
将表达质粒转化至感受态 BL21-Gold（DE3）细
胞中，诱导表达后，经 Ni-NTA 柱纯化的蛋白组份
跑 SDS-PAGE 电泳。结果（图 4）表明，上清液在
约 25 kD 处有一条明显的特异带，与目的蛋白分子
量基本吻合。从流穿液的电泳结果来看，目的蛋白
与 Ni 柱的结合效果良好，且 Elution 洗脱液中目的
蛋白纯度较高。500 mmol/L EDTA 洗脱液中没有发
现目的蛋白的存在，说明目的蛋白已经被洗脱干净。
116.0
kD
1 2 3 4 5 6 7 M
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
1 ：上清流穿液 ；2 ：上清液 ；3 ：Binding Buffer 洗脱液 ；4 ：Wash Buffer 洗
脱液（前 1 mL 取电泳样）；5 ：Wash Buffer 洗脱液（后 1 mL 取电泳样）；6 ：
Elution Buffer 洗脱液 ；7 ：500 mmol/L EDTA 洗脱液 ；M ：蛋白 Marker
图 4 Ni-NTA 柱纯化的 SDS-PAGE 电泳图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期84
将 Elution Buffer 的洗脱液浓缩至 5 mL，上样
Superdex200 柱，波长 280 nm 层析图谱结果（图 5），
接样后取目的峰的峰尖处蛋白样品，SDS-PAGE 电
泳查看蛋白状态。
结构域，作为 GEF 的核心结构域，主要承担着催
化鸟苷酸交换反应的功能。目前的 PDB 中还没有
EFA6 家族 Sec7 结构域的结构信息，这局限了我们
了解 Sec7 结构特点及结构与其功能之间的联系。
现有的解析蛋白质结构的方法大都建立在得到
高纯度、稳定、均一的重组蛋白的基础上。运用现
有的生物信息学技术，选择恰当的边界、合适的载
体以及相对应的表达纯化方法是获得理想重组蛋白
的重要手段。
本试验在边界选择方面综合了生物信息学软件
Jpred 的预测结果、Uniprot 提供的信息和 PDB 中同
源 Sec7 的结构特点，选取适宜的结构域边界，设计
引物，通过优化 PCR 的程序，成功从人脑 cDNA 文
库中扩增出了 Sec7 的目的基因片段。根据后续的试
验结果显示，此次边界的选择有利于 Sec7 的高效表
达，突出了现有生物信息学软件对此次试验的指导
意义。
试 验 还 使 用 了 一 种 改 造 后 的 新 型 表 达 载 体
p28a，p28a 载体是由 pET28a（+）载体改造而来。
pET28a（+） 载 体 表 达 的 重 组 蛋 白 一 级 序 列 为 ：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM+ 目的蛋白一级序列
（下划线为 Thrombin 酶识别的氨基酸序列），经酶
切后的重组蛋白一级序列为 GSHM+ 目的蛋白。经
过改造后的 p28a 载体表达的重组蛋白一级序列为 ：
MGHHHHHHM+ 目的蛋白，N 端含有 6 个 His 的标签，
用于 Ni 柱纯化，纯化后标签无需酶切，避免了蛋白
在酶切时发生的沉淀和降解等不利因素，同时也降
低了纯化蛋白的经济成本。
Ni-NTA 柱纯化后，蛋白状态经 SDS-PAGE 检测
纯度较高，但从分子筛的波长 280 nm 层析图谱上看，
在目的峰出现以前仍然有很多的杂质峰，这不仅反
映了 SDS-PAGE 检测方法的缺陷，更突出了分子筛
二次纯化的必要。后者在起纯化作用的同时，也能
反映蛋白的纯度、状态和稳定性，为得到优良的蛋
白样品提供了有力保障。
4 结论
通过优化 PCR 程序成功从人脑 cDNA 文库扩
增出人 EFA6A 的 Sec7 结构域的基因序列。将目的
基因片段亚克隆至 p28a 表达载体中，测序结果与
100
mAu
80
60
40
20
0
0 20 40 60 80 100 mL
116.0
kD1 M
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
图 5 Sec7 蛋白 Superdex200 分子筛 U280 峰图
1 ：FPLC 后 Sec7 蛋白 ；M. 蛋白 Marker
图 6 分子筛纯化 SDS-PAGE 电泳图
尽管 Elution 的 SDS-PAGE 电泳结果显示，Ni 柱
纯化后的目的蛋白纯度较高，但是从波长 280 nm 层
析图谱可以看出，在 Sec7 目的峰出现前仍有较多杂
质的峰，需要分子筛进行后续纯化。将 Sec7 的目的
峰接样，总体积约为 12 mL，取样 SDS-PAGE 电泳结
果（图 6）显示蛋白质条带单一，无杂带出现，经检
测蛋白纯度高于 95%。将分子筛后的样品，超滤浓
缩后至 500 μL，目的蛋白浓度为 7 mg/mL。蛋白质
每经一次纯化理论损失量约为 25%，经换算，Sec7
上清表达量应为 70 mg/L（LB 液体培养基的体积）。
3 讨论
Sec7 结构域在 EFA6 家族里是高度保守的一个
2013年第5期 85谢长林等 ：人源 EFA6A 蛋白 Sec7 结构域的克隆表达与纯化
NCBI 中的序列完全吻合。将表达载体转化至 BL21-
Gold（DE3）中，在终浓度 0.3 mmol/L IPTG、16℃、
24 h 情况下成功表达。重组的 Sec7 表达量高（70
mg/L），易于纯化，状态稳定，性质均一，纯度高于
95%。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）