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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
收稿日期 : 2012-04-27
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目（31070650）, 北京市自然科学基金资助项目（5102023）
作者简介 : 刘云华 , 女 , 硕士 , 副教授 , 研究方向 : 植物生物技术 ; E-mail: liuyunhua0451@163.com
通讯作者 : 常振战 , 男 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 蛋白质晶体结构 ; E-mail: changz@bjmu.edu.cn
细胞色素 P450 74 酶家族（CYP74）由于有不保
守的 I-螺旋而表现出与典型的细胞色素 P450 有较大
不同［1］。该家族酶使用过氧化氢基团作为氧分子供
体，既不需要 O2，也不需要依赖于 NADPH 的细胞
色素 P450 还原酶来协助其完成活性［2］。利用这种
非典型的反应机制，CYP74 酶可以通过几个不同的
分支途径催化脂肪酸过氧化氢物的代谢用于氧脂素
（oxylipin）的生物合成，包括由关键酶丙二烯氧化
物合成酶（allene oxide synthase，AOS）催化合成茉
莉酸的丙二烯氧化物合成酶途径，由过氧化氢裂解
酶（hydroperoxide lyase，HPL）催化产生叶醛的过氧
化氢裂解酶途径，以及由联乙烯醚合酶（divinylether
银胶菊丙二烯氧化物合成酶的表达纯化及其活性分析
刘云华1， 2 周秋虎2 张灵芝3 常振战2
（ 1 黑龙江生态工程职业学院生物技术系，哈尔滨 150025 ；2 北京大学基础医学院生物物理系，北京 100191 ；
3 北京大学药学院天然药物学系，北京 100191）
摘 要： 植物来源细胞色素 P450的表达和结晶都十分困难，成为成功解析该类蛋白晶体结构的瓶颈。探索了使用大肠杆菌
表达系统表达、纯化银胶菊丙二烯氧化物合成酶（allene oxide synthase，AOS）的方法。氨基酸序列比对分析显示，银胶菊 AOS缺
失 N-末端的膜锚定序列和信号肽序列，推测其在大肠杆菌中应表达为水溶性蛋白质。试验中纯化得到的银胶菊 AOS是一个分子量
为 54.5 kD的八聚体分子，均一性好，不含去垢剂，达到毫克量级，适合下一步的晶体培养研究；还原一氧化碳差示光谱显示该酶
在 450 nm处有特征吸收峰，酶活性测定得到该酶的米氏常数为 45.3 μmol/L，显示该重组 AOS具有很高的酶活性。
关键词： 银胶菊（Parthenium argentatum） 丙二烯氧化物合成酶 细胞色素 P450 表达纯化 酶活性分析
Expression，Purification and Activity Assay of Allene Oxide Synthase
from Parthenium argentatum
Liu Yunhua1， 2 Zhou Qiuhu2 Zhang Lingzhi3 Chang Zhenzhan2
（1Department of Biotechnology，Heilongjiang Vocational Institute of Ecological Engineering，Harbin 150025；2Department of Biophysics，
School of Basic Medical Sciences，Peking University，Beijing 100191；3Department of Natural Medicines，
School of Pharmaceutical Sciences，Peking University，Beijing 100191）
Abstract: Expression and crystallization of Cytochrome P450 from plants is difficult, and becomes the bottleneck of structural study
for plant P450s. It was researched the expression and purification of AOS from guayule using E. coli expression system. In order to realize
expression and purification of the AOS, its amino acid sequence was aligned with that of other CYP74A enzymes. Results showed that the AOS
was the absence of the amino-terminal membrane anchor and the putative transit sequence. It could be expressed in E. coli as water-soluble
form. Experimental purified recombinant AOS was an active octamer of molecular mass of 54.5 kD, it was milligram quantities of homogeneous,
detergent-free AOS protein which would be used for crystallographic study. The reduced-CO difference spectrum of recombinant AOS had a
characteristic band at 450 nm. Enzymatic activity assay was performed. Value of Km was 45.3 μmol/L, that is, the purified AOS exhibited high
activity.
Key words: Guayule （Parthenium argentatum） Allene oxide synthase Cytochrome P450 Expression and purification Enzyme
activity assay
2012年第8期 77刘云华等 ：银胶菊丙二烯氧化物合成酶的表达纯化及其活性分析
synthase，DES）催化产生二乙烯基醚的联乙烯醚合
酶途径［3］。
CYP74 酶家族通常基于氨基酸序列相似性，分
为 CYP74A、CYP74B、CYP74C 和 CYP74D 四 个 亚
家族。有时也可以根据功能来分类［4］。所有的对
13-过氧化氢物有底物特异性的丙二烯氧化物合成
酶，即 13-AOS 都归为 CYP74A 亚家族，其中包括对 9-
和13-过氧化氢物表现出双重底物特异性的 AOS，如
大麦 AOS［5］以及拟南芥 AOS［6］；所有的对 13-过氧
化氢物有底物特异性的过氧化氢裂解酶，即 13-HPL
都归为 CYP74B 亚家族 ；CYP74 家族的其他一些成
员，如黄瓜来源［7］和甜瓜来源［8］的 HPL，以及对 9-
过氧化氢物有非绝对底物特异性的番茄 AOS［9］都归
为 CYP74C 亚家族 ；而所有对 9-过氧化氢物有高度
特异性的联乙烯醚合酶，即 9-DES，则归为 CYP74D
亚家族。
银胶菊植物体内产生大量的橡胶，以颗粒形
式存在，是医用乳胶制品的备用来源［10］，有巨大
的潜在经济价值。橡胶颗粒含有多种蛋白质，其中
含量最丰富的是橡胶粒子蛋白（RPP）［11］。连二亚
硫酸钠还原一氧化碳差示光谱分析表明，RPP 是
一种细胞色素 P450 酶 ；因其与亚麻 AOS 氨基酸序
列显现出高度一致性［2，12］，又根据酶活性分析结
果，RPP 被鉴定为丙二烯氧化物合成酶，分类为
CYP74A2［13］。除了上述的亚麻 AOS 和银胶菊 AOS
外，科学家也陆续纯化或克隆出了其他植物的 AOS，
如拟南芥［14］、番茄［15］、烟草［16］、马铃薯［17］、巴
西橡胶树［18］等双子叶植物的 AOS，以及大麦［5］、
水稻［19］等单子叶植物中的 AOS。纯化得到的重组
AOS 大多用 13（S）-hydroperoxy（9Z，11E）-octade-
cadienoic acid（13-HPOD），13（S）-hydroperoxy（9Z，
11E，15Z）-octadecadienoic acid（13-HPOT）和 / 或
15（S）-hydroperoxy（11E，13E，17Z）-eicosatrienoic
acid（15-HPET）作为底物测定酶活性 ［14， 15， 18］。
P450 数 据 库（http ：//drnelson.utmem.edu/P450.
stats.2010htm）汇集了 3 000 多种植物来源细胞色素
P450 的序列，但是到目前为止，只有少数植物来源
的 P450 酶的晶体结构得到解析［20］，原因在于植物
来源 P450 的表达和结晶都十分困难。Hughes 等［21］
纯化得到了毫克量级、不含去垢剂的 CYP74A1 和
CYP74C3 蛋白，并培养出了 CYP74A1 针状晶体，但
是那些晶体的 X-射线衍射的分辨率都很低，仍然无
法解析其晶体结构。
通过氨基酸序列比对分析，推测银胶菊 AOS 在
大肠杆菌中应表达为水溶性蛋白质。进一步利用大
肠杆菌表达系统大量表达、纯化银胶菊 AOS，对其
酶活性进行分析，旨在为下一步的晶体培养研究提
供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 菌株 E. coli BL21（DE3），带有
组氨酸标签的表达质粒 pET-AOS 由美国 USDA 的潘
志强博士提供。
1.1.2 化学试剂 5-氨基乙酰丙酸（ALA）和 3-［3-
（胆酰胺丙基）二甲氨基］-1-丙烷（CHAPS）购自
Sigma-Aldrich，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）
购自 Promega 公司，Ni2+-NTA 亲和树脂购自 Qiagen。
1.1.3 主要仪器 双光束扫描岛津紫外可见分光光
度计（UV-1601 型），岛津 UV-3101 PC 分光光度计，
HiprepSephacryl S 200HR 制 备 柱，Vivaspin20 浓 缩
管等。
1.1.4 应用软件 GraphPad Prism 和 ClustalW 软件。
1.2 方法
1.2.1 银胶菊 AOS 的氨基酸序列分析 为了构建
质粒进行银胶菊 AOS 原核表达和纯化研究，利用
ClustalW 程序将银胶菊 AOS 与亚麻、巴西橡胶树、
番茄、马铃薯、烟草及拟南芥等双子叶植物的 AOS
进行氨基酸序列比对分析。
1.2.2 银胶菊 AOS 的表达和纯化 用 pET-AOS 质
粒转化入大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞，挑取
单菌落接种到含有 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 液体培
养基中进行活化，在 37℃，250 r/min 条件下过夜震
荡培养 ；取 1 mL 活化培养物接种到含有 50 μg/mL
卡那霉素的 1 L LB 培养基，置于 2 L 烧瓶中，37℃，
250 r/min 过夜震荡培养 ；在 OD600=0.4-0.6 时，加
入浓度为 1 mmol/L 的 IPTG 诱导 AOS 过度表达 ；在
25℃，250 r/min 继续培养 48 h，在离心力 6 000×g、
4℃条件下离心 15 min，收获细菌。
将浅红色细菌悬浮在 5% 培养基体积的裂解液
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期78
（50 mmol/L Na3PO4，250 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪
唑，0.5% Triton-X-100，pH8.0）中，加入溶菌酶（0.2
mg/mL）、脱氧核糖核酸酶 I（1.2 μg/mL）、MgSO4（2
mmol/L）和苯甲基磺酰氟（PMSF，1 mmol/L），在 4℃
搅拌 30 min 后超声破碎细胞，在离心力 29 000×g
下离心 1.5 h，获得上清液。将含有重组 AOS 的上清
液流经事先用 20 倍柱床体积裂解液平衡过的 Ni2+-
NTA 亲和柱（2 mL 柱床体积），然后用 600 mL 清
洗 缓 冲 液（50 mmol/L Na3PO4，250 mmol/L NaCl，
20 mmol/L 咪唑，pH8.0）洗净亲和柱，清洗杂蛋
白，用洗脱缓冲液（50 mmol/L Na3PO4，250 mmol/L
NaCl，250 mmol/L 咪 唑，pH8.0） 以 0.5 mL/min 流
速洗脱目标蛋白。将目标蛋白浓度最高的组分合
并，用经过凝胶过滤缓冲液（50 mmol/L 的 K3PO4，
150 mmol/L NaCl，5% 甘油，pH8.0）事先平衡好的
HiprepSephacryl S 200HR 制备柱进行凝胶过滤。合
并蛋白浓度较高的呈红颜色的组分，用 Vivaspin20
浓缩管（30 kD 的分子量截留）浓缩到适宜浓度。
1.2.3 银胶菊AOS的一氧化碳差示光谱分析 1 L LB
培养基中当 OD600=0.55 时，加入浓度为 0.5 mmol/L
的IPTG诱导重组AOS表达，并加入浓度为0.5 mmol/L
的 ALA 作为血红素辅基的前体化合物，在 25℃，
250 r/min 条件下震荡培养 48 h，6 000×g 离心力下
离心 15 min，收获细菌。将细菌沉淀悬浮于 100 mL
细胞裂解液（500 mmol/L K3PO4，500 mmol/L NaCl，
5 mmol/L CHAPS，20 mmol/L 咪唑，1 mmol/L PMSF，
2 mmol/L MgSO4，5% 甘油，pH7.4）中，超声粉碎，
随后在 29 000×g 离心力下离心 90 min。
大肠杆菌表达的 AOS 一氧化碳差示光谱测定参
照 Liu 等［22］的方法操作，使用双光束扫描岛津紫
外可见分光光度计（UV-1601 型），简述如下 ：取 3
mL 上清液，加入几毫克连二亚硫酸钠将其还原。在
样品比色皿和参考比色皿中分别加入等体积的上述
制备物（每个加 0.7 mL），校正基线，将 CO 轻轻吹
过样品比色皿中的液体大约 1 min，记录从 500 nm
到 400 nm 的差示光谱。
1.2.4 纯化银胶菊 AOS 的酶活性分析 在体积为
1 mL，pH8.5 的 50 mmol/L 磷酸钾溶液中，使用光
程为 1 cm 的石英比色皿，对纯化的银胶菊 AOS 进
行酶活性分析。以 13（S）-hydroperoxy（9Z，11E）-
octadecadienoic acid（13-HPOD）为底物，在比色皿
中加入一系列不同量的 AOS，使用岛津 UV-3101 PC
分光光度计，在 234 nm 下自光吸收下降开始记录 3
min，用 GraphPad Prism V5.0 软件分析收集的数据。
2 结果
2.1 AOS的氨基酸序列分析
比对结果（图 1）分析表明，7 种植物 AOS
的氨基酸序列的同源性达到 38% 左右，且共享许
多保守区域。例如，A 框内的靠近氨基端的保守
PPGP/N/A 四肽，E 框内的 L-螺旋上的血红素结合
位点 CAG。就氧分子结合部位 I-螺旋而言，B 框显
示 CYP74A 的 I-螺旋为 GGxKI（x 代表任意一个氨基
酸），与细胞色素 P450 单加氧酶的 I-螺旋 GxxxT（xxx
代表任意 3 个氨基酸）相比，CYP74A 酶中的异亮
氨酸取代了苏氨酸。银胶菊 AOS 的特殊性是缺失氨
基末端的膜锚定序列和信号肽序列，因而位于橡胶
颗粒的 AOS 很可能以水溶性的形式存在，用大肠杆
菌表达重组银胶菊 AOS 就可能获得水溶性的蛋白。
2.2 表达纯化
为了高水平表达、纯化银胶菊 AOS，先研究了
表达该酶的外在条件，经过反复试验，最终在前文
所述的培养温度、时间、摇床速度、IPTG 和 ALA
的浓度等表达条件下获得了较理想的表达结果，获
得了毫克量级的 AOS。用 BL21（DE3）菌株表达
pET-AOS，并经 Ni2+ -NTA 层析柱纯化，可以从每升
培养物得到约 15 mg 的 AOS（根据 Bradford（1976）
方法测定）。
我们经过两个层析步骤纯化重组的带有组氨酸
标签的 AOS ：（1）Ni2+ -NTA 柱色谱是一个高效的
纯化步骤，能够对 AOS 进行显著的富集 ；（2）用
HiprepSephacryl S 200HR 制备柱凝胶过滤，可以得
到高纯度的 AOS。SDS-PAGE（图 2）显示，蛋白纯
度可达 95% 以上。凝胶过滤层析结果（图 3）表明，
纯化的 AOS 是一个分子量为 54.5 kD 的八聚体分子。
2.3 一氧化碳差示光谱分析
纯化得到的重组 AOS 的还原 CO 差示光谱在
450 nm 处有特征吸收峰，说明本研究纯化到的确
为细胞色素 P450 酶。同时记录到少量的细胞色素
P420，它是变性的 AOS 形式（图 4）。
2012年第8期 79刘云华等 ：银胶菊丙二烯氧化物合成酶的表达纯化及其活性分析
图 1 双子叶植物来源的 CYP74A亚家族成员的序列比对
亚麻（LuAOS，AAA03353.1）；银胶菊（PaAOS，CAA55025.1）；巴西橡胶树（HbAOS，DQ004684）；番茄（LeAOS，CAB88032.1）；马铃薯（StAOS，
CAD29735.1）；烟草（NaAOS，CAC82911.1）；拟南芥（AtAOS，CAA73184.1）； 指示 CYP74A 亚家族蛋白质内的保守残基的起始端 ；框 A 显示
PPGP/N/A 四肽；框 B 显示 CYP74A 亚家族中 I-螺旋共识序列 GGxKI； 指示序列中异亮氨酸取代了细胞色素 P450 单加氧酶中的苏氨酸；框 C 显示 J-
螺旋 ；框 D 显示包含共识序列 ExxR 的 K-螺旋 ；框 E 显示含有血红素结合位点 CAG（*** 标注）的 L-螺旋区域。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期80
M. 蛋白质 Marker; 1. 上清液 ; 2， 3. 柱子流出液 ; 4， 5. Ni2+ -NTA 洗
脱组分 2， 3; 6， 7. 凝胶过滤组分
图 2 用 BL21（DE3）细胞表达的银胶菊重组
AOS的 SDS-PAGE
在 280 nm，流速 0.5 mL/min 条件下洗脱蛋白 ；箭头标明不同分子量标
准分子的位置：1. 甲状腺球蛋白（670 kD）；2. 丙种球蛋白（158 kD）；3. 卵
清蛋白（44 kD）；4. 肌红蛋白（17 kD）；5. 维生素 B-12（1.35 kD）
图 3 银胶菊重组 AOS的凝胶过滤层析
图 4 银胶菊重组 AOS的还原一氧化碳差示光谱
2.4 AOS的酶活性分析
为了确定纯化得到的重组 AOS 是否具有功能，
我们进行了酶活性测定，结果显示重组 AOS 具有很
高的酶活性。用 Lineweaver-Burk 分析得到 Kcat 值为
2 700 s -1，米氏常数 Km=45.3 μmol/L（图 5）。
图 5 银胶菊重组 AOS的 Lineweaver-Burk图
3 讨论
细胞色素 P450 的研究工作在动物界起步较早，
哺乳动物细胞色素 P450 2C5 是第一个结构得到解析
的真核细胞色素 P450 酶［23］，采用了删除 N端跨膜
螺旋和突变膜结合位点的方法方便蛋白表达而得以
晶体结构解析。兔来源 P450 2B4 是第二个结构得以
解析的真核P450酶，通过截断N-末端的跨膜结构域，
并将几个 N-末端残基突变成 AKKTSSKK 而成功表达
并实现了晶体结构解析。由此我们受到启发，细胞
色素 P450 的外源表达成功与否受制于蛋白 N-末端
的跨膜序列。已有研究证明大多数植物 CYP74A 酶
靠 N-末端的跨膜序列锚定在叶绿体上［5］。为此，采
用 Clustal W 软件将银胶菊 AOS 的氨基酸序列与双
子叶植物来源的 CYP74A 亚家族的氨基酸序列作了
比对分析，发现银胶菊 AOS 缺乏 N-末端的膜锚定序
列和信号肽序列，会导致蛋白的水溶特性，是 AOS
获得成功表达的关键。另外，7 种植物的 CYP74A
亚家族的氨基酸序列呈现出诸多共同的保守区，以
前关于细胞色素 P450 2C2 和其他 P450 酶的研究工
作，都强调了这些保守区在保持 P450 酶稳定性和催
化性能上的重要性［24，25］。
酶活性分析是本研究关键的环节，只有获得的
AOS 酶具有高的活性，之前的表达、纯化才有价值。
本试验中测得的重组 AOS 的 Kcat 值比文献［13］中
报道的 Kcat 值（3 700 s-1）低，可能原因如下 ：一
是本试验中使用的比色皿不是上述文献中使用的标
准石英比色皿 ；二是本试验纯化 AOS 用到的咪唑
是 AOS 的强抑制剂，对 AOS 的酶活性测定有一定
影响。
2012年第8期 81刘云华等 ：银胶菊丙二烯氧化物合成酶的表达纯化及其活性分析
4 结论
本试验成功地使用大肠杆菌表达系统过量表达
了银胶菊丙二烯氧化物合成酶 AOS，纯化得到了毫
克量级、均一性好、酶活性高、不含去垢剂、在大
肠杆菌中表现为水溶性的 AOS 蛋白，可以用于下一
步的晶体学研究。
致谢：作者十分感谢美国 USDA的潘志强博士提供带
组氨酸标签的表达质粒 pET-AOS以及在银胶菊 AOS酶活性
分析上的大力帮助。
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（责任编辑 马鑫）