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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
收稿日期 : 2012-04-01
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30972188）
作者简介 :樛跃 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 微生物分子生物学与基因工程 ; E-mail: 1221sep@163.com
通讯作者 : 许崇波 , 男 , 教授 , 研究方向 : 微生物分子生物学与基因工程 ; E-mail: xcb921@163.com
A 型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens typeA）
是引起创伤性气性坏疽和食物中毒的主要病原菌之
一，其致病因子是该菌产生的 α 毒素（CPA）。CPA
A型产气荚膜梭菌 α毒素 Thr-272基因定点
突变与结构分析
跃 许崇波
（大连大学医学院，大连 116622）
摘 要： 利用定点突变技术，将 A型产气荚膜梭菌 α毒素（CPA）第 272位苏氨酸（ACA）定点突变成脯氨酸（CCG），构
建了含 CPA突变基因表达质粒的重组菌株 BL21（DE3）（pMCPA-T272P）。经酶切鉴定和序列测定证实，构建的重组质粒 pMCPA-
T272P含有 CPA-Thr272Pro突变基因，且基因序列和阅读框架正确。重组菌株 BL21（DE3）（pMCPA-T272P）表达产物经 SDS-
PAGE分析，其表达量占菌体总蛋白相对含量的 18.34%。应用 ExPASy服务器上的 SOPMA法对 CPA和 CPA-Thr272Pro突变体分子
进行二级结构预测，同时模拟了其 3D结构。结果显示，CPA和 CPA-Thr272Pro突变体蛋白的二级结构主要是由 α-螺旋和无规则卷
曲组成，3D结构非常相似。CPA和 CPA-Thr272Pro突变体蛋白的圆二色（CD）光谱分析发现二者的 CD光谱有一些微小变化。磷
脂酶 C活性检测结果表明，CPA-Thr272Pro突变体蛋白失去了 α毒素的磷脂酶 C活性。免疫试验结果表明，用 CPA-Thr272Pro突变
体蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的 A型产气荚膜梭菌标准株 C57-1毒素攻击。
关键词： 产气荚膜梭菌 α毒素基因 定点突变 基因表达 圆二色光谱
Site-directed Mutagenesis and Structure Analysis of Clostridium
perfringens Alpha-toxin Gene Thr-272
Jiu Yue Xu Chongbo
（College of Medicine，Dalian University，Dalian 116622）
Abstract: A site 272 （Thr → Pro） mutation which might influence the bioactivity of alpha toxin of Clostridium perfringens was induced
by site-directed mutagenesis technique. The recombinant plasmid pMCPA-T272P containing alpha toxin-coding mutant gene was obtained
and transformed into Escherichia coli BL21（DE3）. The recombinant plasmid pMCPA-T272P which had expected mutation was confirmed
by endonuclease-digestion and sequence analysis. The expressed product of the recombinant strain BL21（DE3） （pMCPA-T272P） was
about 18.34% of total cellular proteins estimated in SDS-PAGE analysis. The induced secondary structure and three-dimensional structure
（3D） of CPA and CPA-Thr272Pro mutant proteins were predicted by using SOPMA method on ExPASy website. The results showed that the
secondary structure of CPA and CPA-Thr272Pro is composed of alpha helices and random coils and their three-dimensional structure was very
similar. Circular Dichroism （CD） spectra of CPA and CPA-Thr272Pro proteins were a little difference by CD analysis. CPA-Thr272Pro mutant
protein did not exhibit any phospholipase C （PLC） activity in bilogical activities of the toxin. Immunization in a mouse model with inactivated
recombinant strain induced protection against at least 1MLD of the toxin from Clostridium perfringens type A.
Key words: Clostridium perfringens Alpha-toxin gene Site-directed mutagenesis Gene expression Circular Dichroism （CD） spectra
是由 370 个氨基酸组成的单链多肽，分子量约 43
kD，它是一种依赖于 Zn2+ 的多功能性金属酶，具有
磷脂酶 C（PLC）和鞘磷脂酶两种酶活性，能同时水
2012年第10期 187樛跃等 ：A 型产气荚膜梭菌 α 毒素 Thr-272 基因定点突变与结构分析
解组成细胞膜的主要成分——磷脂酰胆碱和鞘磷脂，
破坏细胞膜的完整性，导致细胞裂解，从而具有细
胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性［1-3］。
本研究选择影响 CPA 生物活性氨基酸的相关碱基位
点进行定点突变［4-6］，构建了 CPA 突变体基因，且
在大肠杆菌中得到了较高水平的表达，同时测定了
其二级结构、3D 结构和圆二色（CD）光谱，并检
测了其生物学活性，旨在为进一步研究 CPA 基因
结构与功能的关系奠定了基础，同时为下一步研制
CPA 基因工程亚单位疫苗提供了理想的基因材料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、载体和试验动物 重组菌株BL21（DE3）
（pXETA02）系许崇波构建［7］；表达载体 pET-32a
和受体菌 BL21（DE3）均购自 Novagen 公司。昆明
系小鼠购自大连大学实验动物中心，16-18 g，雌雄
各半。
1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶（BamH I、
EcoR I、Nco I）、PCR 试 剂 盒 购 自 TaKaRa 公 司。
Wizard PCR preps DNA Purification System、T4 DNA 连
接酶购自 Promega 公司。
1.2 方法
1.2.1 PCR 引物的设计与合成 根据 A 型产气荚膜
梭菌 CPA 基因序列设计 PCR 引物：P1 为 5-CCGAC-
GACGACGACAAGGCCATGGCAATGAAAAGAAAGA-
TTT-3，P2 为 5-CATGTAGTCATCCGGTCCAGCAT-
CTTTCTCAC-3，P3 为 5-CCGGATGACTACATGTAT-
TTTGG -3（突变引物），P4 为 5-ACGGAGCTCGAA-
TTCTTTTATATTATAAGTTGAATTT-3，P1、P4 分别
含有 Nco I、EcoR I 酶切位点（下划线部分）和保护
性碱基，P3 为突变引物，含有突变碱基（双下划线
部分），引物由 TaKaRa 公司合成。
PCR 反应体系（50 μL）：5×buffer 10 μL，模板
pXETA02 DNA 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上、下
游引物（0.2 μmol/L）各 0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，Taq
DNA 聚 合 酶（2.5 U/μL）0.5 μL。PCR 反 应 程 序 ：
94℃预变性 3 min ；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，
共进行 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。
1.2.2 CPA 基因的定点突变与重组表达质粒的构
建 提取的 pXETA02 为模板，以 P1 和 P2 为引物
扩增 CPA 基因上游 0.9 kb，以 P3 和 P4 为引物扩增
CPA 基因下游 0.3 kb，分别纯化回收 PCR 产物并用
T4 DNA 连接酶连接，然后以连接产物为模板，以
P1 和 P4 为引物再进行扩增，即可得到带有突变位
点的大小约为 1.2 kb 目的基因。按照文献［8］介
绍的方法构建含 CPA-Thr272Pro 突变基因的重组表
达质粒 pMCPA-T272P，并由 TaKaRa 公司测定 CPA-
Thr272Pro 突变基因的核苷酸序列。
1.2.3 包涵体提取、变性与复性 将 250 mL 重组菌
株培养液于 4℃ 7 000 r/min 离心 10 min 后弃上清，
用 50 mL 的 20 mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液悬浮
沉淀。重复离心一次，加入 300 mL 的 1 mol/L Tris-
HCl（pH8.0）缓冲液悬浮沉淀，置于冰水浴中进行
超声波破碎，超声波破碎条件为 ：功率 400 W，超
声 5 s，间歇 5 s，共 45 min。然后于 4℃ 10 000 r/min
离心 30 min 后弃上清，用洗涤液［20 mmol/L Tris-
HCl （pH8.0），0.5 mol/L 尿素］重悬沉淀。重复离心
一次，用 500 mL 洗涤液重悬沉淀，所得产物即为包
涵体。
根据变性液与包涵体之比为 1 40 加入变性
液［20 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），8 mol/L 尿素，0.1%
β-巯基乙醇］，迅速重悬，置于 37℃ 变性 2 h 后，于
12 000 r/min 离心 10 min，吸取的上清移入处理后的
透析袋中，密封后，放进已加入 150 mL 复性液［20
mmol/L Tris-HCl （pH8.0），尿素浓度梯度分别为 6、4、
2 和 0 mol/L］的烧杯中开始进行梯度透析复性。每
间隔 6 h 换一次复性液，将复性后的包涵体蛋白放
入离心管中，4℃保存备用［9］。
1.2.4 CPA-Thr272Pro 突变基因表达产物的 SDS-
PAGE 分析 按文献［8］介绍的方法进行。
1.2.5 α 毒素 CPA 和 CPA-Thr272Pro 突变体蛋白分
子的二级结构预测 按照文献［10］介绍的方法，
应 用 ExPASy 服 务 器（http://www.expasy.org/tools）
SOPMA 法预测 α 毒素 CPA 和 CPA-Thr272Pro 突变体
蛋白分子的二级结构。
1.2.6 α 毒素 CPA 和 CPA-Thr272Pro 突变体蛋白分
子的 3D 结构预测 以蛋白质结构数据库（PDB）中
已解析的 A 型产气荚膜梭菌 CPA 的三维结晶结构
（3D）为模板，利用“http:// www.expasy.org/swissmod/
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期188
SWISS-MODEL.html”同源模型构建 α 毒素 CPA 和
CPA-Thr272Pro 突变体蛋白分子的 3D 结构，应用
Rasmol 分析软件绘制其 3D 结构图［11］。
1.2.7 圆二色（CD）光谱分析 采用 J810-150S 型
圆二色光谱仪，在 25℃恒温下测定 CD 光谱并记录
数据。将 0.6 mL 蛋白溶液（10 μmol/L）置于光径为
0.1 cm 的比色杯中，扫描范围为 190-250 nm，狭缝
宽度为 1 nm，扫描速度为 50 nm/min，响应时间为 2 s，
扫描次数为 3 次。
1.2.8 磷脂酶 C 活性检测 取 3 只 0.5 mL Eppendorf
管，各加入 100 μL 卵黄（含卵磷脂）稀释液，再分
别加入 100 μL α 毒素、CPA-Thr272Pro 突变体蛋白、
生理盐水，混匀后，于 37℃孵育 24 h，观察是否有
浑浊环出现，检测磷脂酶 C 活性［7］。
1.2.9 免疫攻毒试验 按文献［7］的方法制备重
组菌株 BL21（DE3）（pMCPA-T272P）灭活菌体免
疫用抗原和文献［12］的方法制备 A 型产气荚膜梭
菌标准株 C57-1 类毒素免疫用抗原。取 160 只小鼠，
随机分为 2 组，每组 80 只，一组用灭活菌体抗原腹
腔免疫 0.5 mL/只，另一组用 A 型产气荚膜梭菌标准
株 C57-1 类毒素 0.5 mL/只，间隔 14 d 后，以上述方
法进行第二次免疫，14 d 后进行攻毒试验。同时设
立生理盐水对照组。将过夜培养的 A 型产气荚膜梭
菌标准菌 C57-1 培养上清作倍比稀释，每个剂量腹
腔注射小鼠 6 只，观察小鼠死亡情况 ；用 1MLD A
型产气荚膜梭菌标准株 C57-1 培养上清攻击免疫小
鼠，观察小鼠的存活情况。
2 结果
2.1 CPA-Thr272Pro突变基因重组表达质粒的构建
与鉴定
以提取的 pXETA02 质粒为模板，以 P1 和 P2
为引物扩增 CPA 基因上游 0.9 kb，以 P3 和 P4 为引
物扩增 CPA 基因下游 0.3 kb，利用 Wizard PCR preps
DNA Purification System 回收上下游片段，并用 T4
DNA 连接酶连接，然后以连接产物为模板，以 P1
和 P4 为引物再进行扩增，即可得到带有突变位点的
大小约为 1.2 kb 的 CPA 突变基因，回收 CPA 突变基
因片段，然后将其插入到 pET-32a 载体上，转化至
受体菌 BL21（DE3）中，涂种于含 Amp 的 LB 琼脂
平板上，过夜培养。挑取其中 3 个阳性的重组菌落，
经 37℃过夜培养后，采用碱变性法快速抽提质粒，
然后进行 1.0% 琼脂糖凝胶电泳，结果重组质粒的迁
移率比载体质粒慢，表明已有外源 DNA 插入。把其
中一个重组质粒命名为 pMCPA-T272P，Nco I+EcoR
I 和 BamH I+EcoR I 酶切该质粒，经 1.2% 琼脂糖凝
胶电泳，结果（图 1）表明，构建的重组表达质粒
pMCPA-T272P 含有 CPA-Thr272Pro 突变基因。
M. DNA 分子质量标准 ；1. 重组质粒 pMCPA-T272P 的 BamH I+EcoR I 双
酶切产物 ；2. 重组质粒 pMCPA-T272P 的 Nco I+EcoR I 双酶切产物 ；3. 重
组质粒 pXETA02 的 BamH I+EcoR I 双酶切产物
图 1 重组表达质粒 pMCPA-T272P的酶切鉴定
2.2 CPA-Thr272Pro突变基因的核苷酸序列分析
为了进一步确定所克隆的基因是否为 CPA-
Thr272Pro 突变基因，将含有 CPA-Thr272Pro 突变基
因的 pCPA-T272P 质粒送往 TaKaRa 公司进行核苷酸
序列测定。结果表明，编码第 272 位苏氨酸残基的
密码子 ACA 已经突变成编码脯氨酸的密码子 CCG，
说明成功克隆了 CPA-Thr272Pro 突变基因并准确地
实施了预期的定点突变。
2.3 CPA-Thr272Pro突变基因表达产物SDS-PAGE
分析
将用于表达 T7 启动子的 BL21（DE3）菌株作
为 CPA-Thr272Pro 突变基因的表达宿主菌，经转化
挑取单个菌落培养，菌体经处理后，用 SDS-PAGE
分析，结果（图 2）表明，CPA-Thr272Pro 突变基
因可在这种宿主菌中得以表达，且在低分子量蛋白
Marker 44 kD 处明显表达。经凝胶成像仪扫描分析，
IPTG 诱导 4 h 后的重组菌株 BL21（DE3）（pMCPA-
T272P）中的 CPA-Thr272Pro 突变基因表达产物表达
2012年第10期 189樛跃等 ：A 型产气荚膜梭菌 α 毒素 Thr-272 基因定点突变与结构分析
量占菌体总蛋白相对含量的 18.34%。 的 SOPMA 法对 CPA 和 CPA-Thr272Pro 突变体分子
进行二级结构预测，结果（图 3）显示，CPA 蛋白
含 有 118 个 α-螺 旋、78 个 β-折 叠、44 个 β-转 角、
130 个无规则卷曲，CPA-Thr272Pro 突变体含有 120
个 α-螺旋、80 个 β-折叠、43 个 β-转角、127 个无规
则卷曲。从预测的 CPA 及 CPA-Thr272Pro 突变体分
子的二级结构结果来看，二者的二级结构除第 272
突变位点和相邻第 273 位点由无规则卷曲变成 β-折
叠外，第 243 位点和第 319 位点由无规则卷曲变成
α-螺旋，第 267 位点由无规则卷曲变成 β-转角，第
336 位点和第 337 位点由 β-转角变成无规则卷曲，
其余的二级结构没有发生变化，说明 CPA 和 CPA-
Thr272Pro 突变体蛋白分子的二级结构基本一致，但
个别位点的还是发生了变化。
2.5 CPA及CPA-Thr272Pro突变体分子3D结构预测
以蛋白质结构数据库（PDB）中已解析的 A 型
产气荚膜梭菌 CPA 的三维结晶结构（3D）为模板，
M. 蛋白分子质量标准；1.BL21（DE3）（pET-32a）诱导全菌体；
2. BL21（DE3）（pMCPA-T272P） 诱导全菌体 ；3. BL21（DE3）
（pMCPA-T272P）的包涵体提取物
图 2 重组菌株 BL21（DE3）（pMCPA-T272P）
表达产物的 SDS-PAGE分析
2.4 CPA及CPA-Thr272Pro突变体分子二级结构预测
应用 ExPASy 服务器（http://www.expasy.org/tools）
h. α-螺旋 ；e. β-折叠 ；t. β-转角 ；c. 无规则卷曲
图 3 CPA和 CPA-Thr272Pro突变体蛋白的二级结构预测及比较
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期190
利 用“http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.
html”同源模型构建 CPA 和 CPA-Thr272Pro 突变体
分子 3D 结构，应用 Rasmol 分析软件绘制其 3D 结
构图。结果（图 4）显示，CPA 一共有 10 段 α-螺旋，
8 段 β-折叠，而 CPA-Thr272Pro 突变体的 3D 结构与
CPA 的 3D 结构基本相似。
测定 CD 光谱并记录数据。将 0.6 mL 蛋白溶液（10
μmol/L）置于光径为 0.1 cm 的比色杯中，扫描范
围为 190-250 nm，狭缝宽度为 1 nm，扫描速度为
50 nm/min，响应时间为 2 s，扫描次数为 3 次。测
定 CPA 及 CPA-Thr272Pro 突变体蛋白分子的圆二色
（CD）光谱，二者的 CD 光谱有一些微小变化（图 5）。
2.7 CPA-Thr272Pro突变体蛋白的磷脂酶C活性检测
在 3 只 Eppendorf 管中分别加入 100 μL 卵黄（含
卵磷脂）稀释液，再分别加入 100 μL α 毒素、CPA-
Thr272Pro 突变体蛋白、生理盐水，混匀后于 37℃
孵育 24 h，观察是否有浑浊环出现，从而检测磷脂
酶 C 活性。结果（图 6）表明，1 号管中出现了浑
浊环，而 2 号和 3 号未出现浑浊环，说明 2 号管中
的 CPA-Thr272Pro 突变体蛋白不能分解卵黄中的卵
磷脂，不具有磷脂酶 C 活性。而对照组 1 号管中的
α 毒素出现浑浊环，说明 α 毒素能分解卵黄中的卵
磷脂，具有磷脂酶 C 活性。上述试验结果表明，构
建重组菌株 BL21（DE3） （pMCPA-T272P）表达的
CPA-Thr272Pro 突变体蛋白已经丧失了 α 毒素的磷脂
酶 C 活性。
图 4 CPA（A）和 CPA-Thr272Pro突变体蛋白（B）
3D结构预测
2.6 CPA及CPA-Thr272Pro突变体蛋白分子的圆二
色（CD）光谱分析
采用 J810-150S 型圆二色光谱仪在 25℃恒温下
图 5 CPA（A）和 CPA-Thr272Pro突变体蛋白（B）的圆二色（CD）光谱分析
1. α 毒素 ；2. CPA-Thr272Pro 突变体蛋白 ；3. 生理盐水
图 6 磷脂酶 C活性检测结果
2.8 CPA-Thr272Pro突变体蛋白的免疫攻毒试验
经过筛选，确定最小致死量为 4 倍稀释的 A 型
产气荚膜梭菌标准株 C57-1 培养上清，以此攻击用
重组菌株 BL21（DE3） （pMCPA-T272P）灭活菌体免
疫的小鼠和 A 型产气荚膜梭菌标准株 C57-1 类毒素
免疫的小鼠。结果表明，灭活菌体免疫组保护率为
94%（75/80），类毒素免疫组保护率为 95%（76/80），
而生理盐水对照组 20 只小鼠全部死亡，这说明构建
2012年第10期 191樛跃等 ：A 型产气荚膜梭菌 α 毒素 Thr-272 基因定点突变与结构分析
的 A 型产气荚膜梭菌 CPA-Thr272Pro 突变体蛋白和
A 型产气荚膜梭菌标准株 C57-1 类毒素的免疫保护
效果基本相同。
3 讨论
α 毒素（CPA）是 A 型产气荚膜梭菌主要致病
因子，是引起人畜创伤性气性坏疽和人类食物中毒
的主要病原菌之一。CPA 的氨基酸组成对其生物活
性和毒性有着重要的影响，其中一些氨基酸是对其
生物活性起着十分重要的保守氨基酸。Nagahama
等［13］将第 57 和 65 位的酪氨酸突变成丙氨酸和亮
氨酸之后，结果表明 CPA 突变体丧失 CPA 的鞘磷
脂酶活性，同时它们在膜损伤方面起着重要的作
用。另外，它们将 56 位的天门冬氨酸突变成丝氨
酸、天门冬酰氨、谷氨酸或谷氨酰氨之后，突变的
毒素完全丧失 CPA 的溶血、磷脂酶 C 和鞘磷脂酶活
性。当第 130 位的天门冬酰氨发生突变后，突变毒
素与天然毒素相比其活性降低了约 100 倍，同时还
证明，第 56 位的天门冬酰氨对毒素的酶催化作用是
必需的，而第 130 位天门冬酰氨对其结构的维持是
必需的。尽管上述不同位点的氨基酸发生突变之后，
对毒素的生物活性有着不同程度的影响，甚至可使
其生物活性完全丧失，但仍然保持着天然毒素的部
分或全部抗原性。Schoepe 等［14］对构建的 A 型产气
荚膜梭菌 CPA 突变体 R212H 进行了免疫原性研究，
结果 CPA 突变体 R212H 免疫小鼠后能够产生保护
性抗体，可以抵抗致死量 α 毒素的攻击。
众所周知，CPA 是一种依赖于 Zn2+ 的金属酶，
具有磷脂酶 C 活性。它的生物学活性有赖于 Zn2+ 的
存在，如果 CPA 结合双价金属离子的氨基酸发生突
变，即可使其丧失结合 Zn2+ 的能力，就可能使其失
去生物学活性。Sakurai 等［4］报道，CPA 第 272 位
苏氨酸位于酶的催化活性位点中，而且是 Zn2+ 的结
合位点。如果将 CPA 第 272 位苏氨酸突变成其他氨
基酸，有可能使 CPA 在此位点上失去结合 Zn2+ 的
能力，同时改变其空间结构，从而导致其生物学活
性的改变。为此，我们利用定点突变技术，对影响
CPA 生物学活性的第 272 位苏氨酸残基的相关碱基
位点实施定点突变，并将 CPA-Thr272Pro 突变基因
置于 T7 启动子下进行了高效表达，以期获得丧失生
物毒性且具有免疫原性的 CPA。在本研究中，已实
现了对其第 272 位苏氨酸→脯氨酸的定点突变，并
在重组大肠杆菌中获得了表达，而且构建的 A 型产
气荚膜梭菌 CPA-Thr272Pro 突变体蛋白具有较好的
免疫原性，同时丧失了其原有的磷脂酶 C 活性。上
述研究为进一步研究 A 型产气荚膜梭菌 CPA 结构与
功能的关系和 CPA 的分子作用机制奠定了基础，同
时为下一步研制 CPA 基因工程亚单位疫苗提供了理
想的基因材料。
4 结论
利用定点突变技术，将 A 型产气荚膜梭菌 α 毒
素（CPA）第 272 位苏氨酸（ACA）定点突变成脯
氨酸（CCG），构建了含 CPA 突变基因表达质粒的
重组菌株 BL21（DE3） （pMCPA-T272P），该重组菌
株表达产物经 SDS-PAGE 分析，其表达量占菌体总
蛋白相对含量的 18.34%。应用 ExPASy 服务器上的
SOPMA 法对 CPA 和 CPA-Thr272Pro 突变体分子进行
二级结构预测，同时模拟了其 3D 结构。结果 CPA
和 CPA-Thr272Pro 突变体的二级结构主要是由 α-螺
旋和无规则卷曲组成，3D 结构非常相似。CPA 和
CPA-Thr272Pro 突变体分子的圆二色（CD）光谱分
析发现二者的 CD 光谱有一些微小变化。磷脂酶 C
活性检测结果表明，CPA-Thr272Pro 突变体蛋白失去
了 α 毒素的磷脂酶 C 活性。免疫攻互试验结果表明，
用 CPA-Thr272Pro 突变体蛋白免疫的小鼠可以抵抗
1MLD 的 A 型产气荚膜梭菌标准株 C57-1 毒素攻击。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）