全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
1974 年，Grozdicker 等［1］在鉴定温度敏感表型
的腺病毒 DNA 突变体时，利用限制性内切酶酶解
后得到的 DNA 片段的差异，首创了 DNA 分子标记。
所谓分子标记是指根据基因组 DNA 存在丰富的多态
性而发展起来的可直接反映生物个体在 DNA 水平上
的差异的一类遗传标记，它是继形态学标记、细胞
学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。
DNA 分子标记以 DNA 为表现形式，消除了环境的
影响，不存在基因表达与否和组织器官特异性，因
此已被广泛应用于遗传图谱的构建、遗传育种、基
因定位、物种亲缘关系等研究方面。本文综述了近
年来出现的几种 DNA 分子标记——ACGM、SRAP、
TRAP、SCAR、RSAP 及 SCoT 的原理、特点及其在
收稿日期 ：2012-08-31
基金项目 ：广东省农业科学院茶叶研究所所长基金
作者简介 ：晏嫦妤，女，博士研究生，助理研究员，研究方向 ：茶树资源及分子生物学 ；E-mail ：sally8191@126.com
几种 DNA 分子标记技术及其在茶树种质资源
研究中的应用
晏嫦妤1，2，3  李家贤1，2  黄华林1，2  吴华玲1，2  乔小燕1，2  何玉媚1
（1. 广东省农业科学院茶叶研究所，广州 510640 ；2. 广东省茶树资源创新利用重点实验室，广州 510640 ；
3. 华南农业大学食品学院，广州 510642）
摘 要 ： 对近年来发展的几种 DNA 分子标记技术 ACGM、SRAP、TRAP、SCAR、RSAP 及 SCoT 的原理、特点进行介绍，
综述这些 DNA 分子标记技术在茶树种质资源研究中的应用，并对其在茶树种质资源研究中的应用前景进行了分析。
关键词 ： ACGM SRAP TRAP SCAR RSAP ScoT 分子标记 茶树种质资源
Several DNA Molecular Marker Technologies and Its Application of
Tea Germplasm Research
Yan Changyu1，2，3 Li Jiaxian1，2 Huang Hualin1，2 Wu Hualing1，2 Qiao Xiaoyan1，2 He Yumei1
（1. Tea Research Institute，Guangdong Academy of Agriculture Science，Guangzhou 510640 ；2. Guangdong Key Laboratory of Tea Plant
Resources Innovation & Utilization ，Guangzhou 510640 ；3. College of Food Science，South China Agricultural University，
Guangzhou 510642）
Abstract:  The principles and features of several DNA molecular markers in recent years are introduced, such as ACGM, SRAP, TRAP,
SCAR, RSAP and SCoT. The application of several DNA molecular markers tea germplasm research were reviewed, and prospects of several
DNA molecular markers applied to tea germplasm research were analyzed.
Key words:  ACGM SRAP TRAP SCAR RSAP ScoT DNA molecular markers Tea germplasm
茶树种质资源研究中的应用，并对其在茶树种质资
源研究中的应用前景进行了分析。
1 几种分子标记的技术原理和特点
1.1 扩增共有序列遗传标记（Amplified consensus
genetic markers，ACGM）
ACGM 标记是 Brunel 等［2］于 1999 年依据模式
植物拟南芥（Arabidopsis）与芸薹属（Brassica）物
种间编码序列的保守性，首次提出的能够探知拟南
芥和芸薹属间共有遗传信息的一种新型分子标记。
ACGM 是建立在亲缘关系较近的物种间同源基因中
编码序列（外显子）存在高度保守性，而非编码区（内
含子）存在潜在多态性基础之上的一种基于 PCR 技
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期64
术的分子标记。它以一种植物已知功能基因的保守
编码序列为依据设计简并引物，而在另一种亲缘关
系较近、需探知基因功能的植物总 DNA 中进行同源
序列扩增，并通过分析扩增产物来进一步确定功能
相同基因（直向同源基因）的存在与否、拷贝分布、
拷贝数多少以及序列间同源性等。它最大的优点是
探知新的功能基因而无需克隆，可以在很大程度上
节省构建文库和人工诱变突变体的时间，具有简便、
快捷的特点［3］。
1.2 相关序列扩增多态性（sequence-related amp-
lified polymorphism，SRAP）
SRAP 标 记 是 一 种 基 于 PCR 的 标 记 系 统， 是
由美国加州大学蔬菜作物系 Li 与 Quiros 博士［4］于
2001 年在芸薹属植物开发出来的。其原理是基于基
因外显子 GC 含量丰富，运用 CCGG 序列可特异性
扩增出包含这些组分的序列。而启动子和内含子 AT
含量丰富，可以与含有核心 AATT 序列的引物特异
性结合。SRAP 就是利用这一特点设计引物对基因开
放阅读框架进行扩增。SRAP 标记技术结合了 RAPD
和 AFLP 两者的优点，具有简便、稳定、高重复性、
易测序等特点，并且应用少量的引物便可组配得到
多对引物，提高了引物使用效率，降低了引物合成
成本。但是由于 SRAP 标记是对开放读码框进行扩
增的，因而对基因组相对较少的着丝粒附近以及端
粒的扩增会较少，可能使得所构建的连锁图谱缩短
或出现连锁群断开的现象。如果结合可扩增这些区
域的 SSR 标记，便可获得覆盖整个基因组的连锁图，
更好地运用于基因分离鉴定及调控研究等方面［5，6］。
1.3 靶位区域扩增多态性（target region amplified
polymorphism，TRAP）
TRAP 是一种基于 PCR 技术的分子标记，是由
美国农业部北方作物科学实验室 Hu 与 Vick［7］于
2003 年提出来的。TRAP 技术是基于已知的 cDNA
或 EST 序列信息。目前已获得许多物种基因组序列
的丰富信息，包括人类、拟南芥，以及重要作物水
稻和多种微生物的基因组序列草图绘制成功，有大
量的 EST 序列可供使用，从而使得可以利用生物信
息学工具和 EST 数据库信息产生出许多靶基因序列
的 TRAP 多态性标记，而且极易将性状与标记相关
联。TRAP 由 SRAP 技术改进而来，该技术使用长
度为 16-20 核苷的固定引物（fixed primer）与随机
引物（arbitrary prime），固定引物以 GenBank 中的靶
EST 序列设计而来 ；另一个为随机引物，针对外显
子或内含子的特点，分别设计为富含 GC 或 AT 核心
区的任意序列。通过对目标区域 PCR 的扩增，产生
围绕目标候选基因序列的多态性标记［8］。TRAP 标
记具有操作简单、重复性高、稳定性好、效率高等
特点。而且，由于 TRAP 技术是基于已知的 cDNA
或 EST 序列信息，极易将庞大的 EST 序列信息和植
物重要农艺性状相联系，在种质资源基因鉴定和作
物理想农艺性状基因标记上很有帮助。
1.4 序列特定扩增区域标记（sequence characteri-
zed ampli fied region，SCAR）
SCAR 标 记 是 Paran 和 Mihcelmore［9］ 建 立 的
一种可靠、稳定、可长期利用的标记技术，是在
RAPD 标记基础上发展起来的。先用随机引物对基
因组 DNA 进行 RAPD 扩增，筛选特异片段，获取特
异的 RAPD 标记，进行克隆和测序，然后根据测序
结果设计引物，对基因组 DNA 进行 PCR 特异扩增，
这样便将与原 RAPD 片段相对应的单一位点鉴别出
来。SCAR 标记技术对比 RAPD 技术有以下优越性 ：
（1）由于使用较长的特异性引物和较高的退火温度，
可有效解决 RAPD 标记结果不稳定、重复性差等
问题 ；（2）可将显性的 RAPD 标记转化为共显性的
SCAR 标记，解决由于 DNA 降解对 RAPD 带来的影响；
（3）获得的条带单一，克服了 RAPD 标记的不稳定
和统计不便等缺点。因此，SCAR 标记技术已成为
转化 RAPD 标记的一种稳定可行的方法［10-12］。
1.5 限制性位点扩增多态性（restriction site ampli-
fication polymorphism，RSAP）
RSAP 为杜晓华等［13］建立的一种检测基因组上
广泛分布的限制性酶切位点多态性的 DNA 分子标记
系统。它的原理是采用 2 条长度均为 18 bp 的引物，
引物的 5 端为 12-14 个碱基的随机序列，接着是
4-6 个碱基的限制性酶切位点序列，2 条引物采用不
同的限制性位点和随机序列，PCR 扩增程序借鉴了
SRAP 技术，前 5 个循环采用较低的退火温度以保证
扩增效率，随后 35 个循环采用较严谨的退火温度对
2013年第1期 65晏嫦妤等 ：几种 DNA 分子标记技术及其在茶树种质资源研究中的应用
已扩片段特异性扩增，以保证扩增产物的稳定。扩
增产物从 6％变性聚丙烯酰胺凝胶中分离，银染显
色。RSAP 标记有以下优点 ：（1）无需酶切，仅用一
个简单的 PCR 反应即可实现对 DNA 限制性位点多
态性进行检测，比以往基于限制性位点的标记技术
操作更加简便 ；（2）引物可以两两随机配对，加上
步骤较少，一定程度上降低了成本 ；（3）扩增的限
制性位点散布于整个基因组区 ；（4）具有中等产率、
稳定可靠的特点和较广泛的适用性。
1.6 起始密码子多态性（start codon targeted polym-
orphism，SCoT）
SCoT 分子标记技术是一种目标分子标记技术，
是由 Collard 和 Mackill［14］在水稻研究中提出的，其
依据植物基因中的 ATG 翻译起始位点侧翼序列的保
守性，设计单引物并对基因组进行扩增，扩增产物
用简单的琼脂糖分离检测。引物设计是 SCoT 标记的
核心。一系列研究表明，基因的起始密码子的附近
序列非常保守，具有一致性。SCoT 标记的引物就是
根据植物基因中的 ATG 翻译起始位点侧翼区域的保
守性来设计的。在 SCoT 标记中的单引物与 RAPD、
ISSR 单引物的作用几乎相同，同时充当上下游引物，
不同的是 SCoT 单引物可同时结合在双链 DNA 的正
负链上的 ATG 翻译起始位点区域，从而扩增出两结
合位点之间的序列。SCoT 分子标记作为一种新型分
子标记有几大特点 ：（1）建立在 PCR 基础上的单引
物扩增，操作简单，易于各种物种 SCoT 标记技术
体系的建立 ；（2）和 ISSR 标记相比，它是一种目的
基因分子标记，能有效产生和性状连锁的标记，方
便分子标记辅助育种 ；（3）使用了较长的引物长度，
理论上比 RAPD 标记重复性好 ；（4）引物设计简单，
可在原有引物序列基础上做少许改动来设计更多新
引物，设计好的 SCoT 标记引物可以在物种间通用。
2 几种分子标记在茶树种质资源研究中的应用
分子标记对于研究茶树的遗传多样性和鉴定优
质品种资源具有重要作用。多种分子标记如 RFLP、
RAPD 和 AFLP 等已经应用于茶树种质鉴别，遗传
多样性分析，遗传稳定性和遗传作图等领域。目前，
上述新型分子标记技术在植物分类学［15］、遗传多样
性［16］、遗传图谱构建［17］和辅助育种［18］等方面的
研究广为应用，但在茶树种质资源方面的研究应用
较少，主要集中在遗传多样性及特异标记方面。
沈程文等［19］采用表型鉴定与 SRAP 分子标记，
对 25 份广东茶树种质和 5 份对照品种的遗传多样性
进行系统评价和分类，表明 21 对 SRAP 引物共扩增
出 127 条带，其中 114 条为多态性带，占 88.67% ；
平均每个引物组合的谱带数和多态性带数分别为
6.05 条和 5.43 条，当遗传距离为 0.39 cm 时，茶树
种质可分成 A、B、C 3 类，其中 A 类占 83.33% ；当
遗传距离为 0.31 cm 时，又可将 A 群划分为Ⅰ、Ⅱ、
Ⅲ 3 个亚群，其中第Ⅰ亚群包括 13 个品种，第Ⅱ亚
群包括 2 个品种，第Ⅲ亚群包括 10 个品种。该研究
证实了 SRAP 分子标记在检测茶树种质资源多态性
方面具有较高的效率，并且该分子标记是针对开放
阅读框进行扩增，增加了扩增结果与表型性状的相
关性。
唐玉海［20］利用 TRAP 技术对 16 个茶树品种进
行研究，从 35 对 TRAP 引物组合中，选用了 18 对
多态性较好的组合，总共产生了 72 条条带，其中
多态性条带 56 条，占总条带的 77.78％，条带大小
大约在 100-800 bp，平均每个引物扩增 4 条，多态
性最高为 100％，最低为 33％。说明该标记能有效
地应用与茶树种质资源遗传多样性的分析。唐玉海
等［20］还通过与抗旱相关的几个基因设计引物，对
扩增出的条带进行聚类分析显示，叶型较大，明显
不抗旱的云南大叶和优 10 单独聚为一类，而其余几
个叶型较小，抗旱性较好的品种聚为一类，初步揭
示了种质的抗旱性差异。该项研究说明了 TRAP 分
子标记能有效地将茶树的有关性状和分子标记关联
起来，在茶树种质资源鉴定研究中具有较好的前景。
丁 洲 等［21，22］ 开 展 了 茶 树 的 RAPD 标 记 向
SCAR 标记转化的研究。结果表明，用 SCAR 引物
扩增的 DNA 条带清晰明显，与 RAPD 相比，其对反
应条件的敏感程度低。因此，特异性和重复性较好，
是一种可以直接指导茶树生产实践的种质鉴定方法，
解决了 RAPD 标记的不稳定性和 AFLP 标记的繁琐、
高成本的问题，这也进一步证实了 SCAR 标记的优
越性。
刘循等［23］以局部发生的黑刺粉虱 Aleurocanthus
spiniferus（Quaintance） 为 对 象， 利 用 SCAR 标 记
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期66
技术获得了长度为 987 bp 的黑刺粉虱特异性片段
（GenBank 登 录 号 为 FJ613323）， 根 据 此 片 段 的 碱
基序列设计黑刺粉虱特异性引物 1 对（AS-F518/AS-
R938）。该研究以 SCAR 标记技术成功地将黑刺粉虱
与其他种类的粉虱如桔绿粉虱、烟粉虱（B 型、Q 型、
ZHJ-1 型和 ZHJ-2 型）、温室粉虱、螺旋粉虱等进行
了有效区分，体现了其特异性。通过该项研究说明，
SCAR 分子标记技术有望在茶树苗木调运的害虫检
疫和监测 / 检测中得到实际应用。
3 几种分子标记在茶树遗传育种中的应用前
景分析
对于应用分子标记辅助育种的关键是要找到一
些与性状相关联的标记，而 TRAP 标记是基于已知
的 cDNA 或 EST 序列信息，极易将 EST 序列信息和
植物重要农艺性状相联系。到 2012 年 6 月 12 日为
止，在 GenBank 的 dbEST 数据库中登录的茶树 ESTs
已有 28 794 条，因此将 TRAP 技术应用在茶树育种
上找到一些与茶树优良性状相关的标记，对加快茶
树优良性状的鉴定及品种选育具有重要意义。
随着功能基因组学研究的深入和生物信息学的
发展，目的基因分子标记和功能性分子标记越来越
来受到研究者的重视，因其本身可能是目的基因的
一部分或与目的基因紧密联锁，这样通过对某个分
子标记的筛选即能对性状进行筛选，从而加速育种
进程［24］。近几年，目的基因分子标记类型被广泛
开发并应用。SCoT 标记技术是一种除 SRAP、TRAP
等标记外一种能跟踪性状的新分子标记技术，该技
术已被成功应用于水稻［25］、花生［26］和龙眼［27］中。
植物间基因功能的保守性决定了基因序列的保守性，
利用功能基因保守序列开发出来的 SCoT 标记可转移
性更强。来自单子叶植物（水稻）的 SCoT 标记引物，
在双子叶植物花生中的扩增效果也很好，说明 SCoT
标记可在不同物种间共用。因此，该技术有望在茶
树育种中得到应用，推动茶树功能型分子标记的研
究开发。
4 小结
各种 DNA 分子标记技术从诞生到发展至今都有
其自身的优缺点，在各自特定的领域中均具有不可
替代的作用，虽然目前这些分子标记在茶树种质资
源研究中应用较少，但随着茶树分子生物学数据及
资源的不断增多加之生物信息学、基因芯片等新技
术的不断发展及其与分子标记技术的相互融合和相
互渗透，DNA 分子标记技术将在茶树种质资源研究
领域有更广泛的用途和前景。如 ACGM 标记，能够
探知亲缘关系较近的物种间的同源基因的功能，对
于茶树这种遗传背景复杂，且基因序列研究较少的
物种，可以通过一些和茶树亲缘关系较近且功能基
因研究较多的物种进行 ACGM 标记，找到一些新的
功能基因。
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（责任编辑 狄艳红）