全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-06-15
基金项目 : 广东省自然科学基金项目（06104396）
作者简介 : 彭远远 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 乳腺癌骨转移机制 ; E-mail:shuiye1988@163.com
通讯作者 : 王捷 , 男 , 教授 , 硕士生导师 , 研究方向 : 乳腺癌骨转移机制 ; E-mail:jie.w@tom.com
骨唾液酸蛋白通过整合素 αvβ3 调控 ILK 信号通路
彭远远1,2 王捷1
（1华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006 ； 2 广州军区广州总医院医学实验科，广州 510010）
摘 要： 旨在探究骨唾液酸蛋白（BSP）是否通过整合素 αvβ3 对整合素连接激酶（ILK）信号通路进行调控。BSP 基因沉默
乳腺癌 MDA-MB-231 细胞，流式细胞仪在细胞水平检测 BSP 不同水平的细胞株中整合素 αvβ3 的表达量。Western blotting 检测磷
酸化 ILK 水平的变化，MTT 法检测细胞增殖能力。与对照组 231BO-Scrambled 细胞相比，BSP 基因沉默组 231BO-BSP27 细胞中
整合素 αvβ3 的表达水平明显下调（61.32 ± 1. 94）%（P <0. 01）。整合素 αvβ3 鼠抗单克隆抗体（LM609）处理前的 BSP 基因沉默
组 231BO-BSP27 细胞与 21BO-Scrambled 细胞相比，ILK 磷酸化水平下调明显（39. 38 ±1. 38）%（P <0. 01）；LM609 处理后的
231BO-BSP27 细胞与 21BO-Scrambled 细胞相比，ILK 磷酸化水平下调明显（33. 78 ±1. 51）%（P <0. 01）。向乳腺癌细胞 231BO-
scrambled 和 231BO-BSP27 中添加 LM609，MTT 试验结果显示两株乳腺癌细胞的增殖能力均有降低（P ＜ 0.05）。BSP 通过整合素
αvβ3 对乳腺癌 MDA-MB-231 细胞 ILK 信号通路进行调控，并影响细胞增殖。
关键词： 骨唾液酸蛋白 BSP 整合素 αvβ3 ILK 信号通路
Effect of Bone Sialoprotien Through Integrin αvβ3 on ILK Signaling
Pathway of Breast Cancer MDA-MB-231 Cells
Peng Yuanyuan1,2 Wang Jie1
（1School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006 ；2Department of Medical Experiment,
Guangzhou Generatl Military Army Hospital, Guangzhou 510010）
Abstract: It was to investigate whether bone sialoprotein（BSP） through integrin αvβ3 effect on the ILK signaling pathway in breast
cancer MDA-MB-231 cells. BSP-silencd MDA-MB-231 cells, flow cytometric analyzed the expression of integrin αvβ3 in breast cancer MDA-
MB-231 cells. Western blotting was used to detect the phosphorylation of ILK, and the proliferation of cells was analyzed by MTT assay. Results
showed that compared with control group 231BO-Scrambled cells, integrin αvβ3 expression in 231BO-BSP27 cells was significantly lower
（61.32±1. 94） %（P <0. 01）, and expression level of ILK phosphorylation was also lower （39. 38 ±1. 38） %（P <0. 01）. Treat LM609 （alpha
v beta 3 rat fight monoclonal antibody） to 231BO-Scrambled cells and 231BO-BSP27 cells respectively, expressd ILK were obviously down-
regulated phosphorylation level（33. 78 ±1. 51）%（P <0. 01）. MTT experiment indicate LM609 caused proliferation inhibition in 231BO-
scrambled cells and 231BO-BSP27 cells （P <0. 05）. It proved that bone sialoprotein through integrin αvβ3 affect the ILK signaling pathway in
breast cancer MDA-MB-231 cells.
Key words: Bone sialoprotein Integrin αvβ3 ILK Signaling pathway
骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）是一种高
度硫酸化、磷酸化和糖基化的矿化组织特异性非胶
原蛋白，属于 SIBLING（small integrin binding ligand
N-linked glycoprotein）蛋白质家族。BSP 参与了乳腺
癌细胞的骨转移，其过度表达可以促进肿瘤的增殖
和转移，其在乳腺癌细胞中的抑制表达可以有效抑
制乳腺癌骨转移的发生。整合素 αvβ3 是整合素家族
的重要成员，属于 β3 亚族。αvβ3 在乳腺癌细胞中高
表达，能够介导内皮细胞与周围组织结合、内皮细
胞与肿瘤细胞粘附。整合素 αvβ3 能够通过胞外区与
2012年第1期 173彭远远等 ：骨唾液酸蛋白通过整合素 αvβ3 调控 ILK 信号通路
特异性配体 BSP 的 RGD 序列结合，进而将胞外信
号传递至胞内，介导相关信号通路。本实验室已经
证明，沉默 BSP 能够抑制 ILK 磷酸化水平的表达及
ILK 信 号 通 路 下 游 分 子 caspase-3、VEGF 等 的 活
性［1］。最新研究证明，整合素 αvβ3 能激活整合素连
接激酶（ILK）信号通路，进而对 AKT 丝氨酸 473 位
点磷酸化导致 AKT 激活，增强 VEGF 的表达进而促
进肿瘤血管形成［2］。但 BSP 是否通过与整合素受体
αvβ3 作用，调控 ILK 信号通路进而促进肿瘤细胞增
殖和转移尚不清楚。本研究旨在探讨 αvβ3 是否介导
了 BSP 对 ILK 信号通路的活化，为揭示 BSP 调控
信号通路进而促进肿瘤转移的机制提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
特 异 性 亲 骨 转 移 人 乳 腺 癌 细 胞 株 MDA-MB-
231BO、BSP 基因沉默乳腺癌细胞株 MDA-MB-231BO-
BSP27、导入无关质粒 pSilencer-scrambled 的对照乳
腺癌细胞株 MDA-MB-231BO-Scrambled，分别简称
为 231BO、231BO-BSP27、231BO-Scrambled， 由 广
州军区广州总医院医学实验科保存［3］。兔抗人 p-ILK
抗 体， 二 抗 HRP- 山 羊 抗 兔 IgG 均 购 自 Cell Signal
Technology 公 司， 兔 抗 GAPDH 多 克 隆 IgG 抗 体 购
自康维世纪公司。αvβ3 鼠抗单克隆抗体 LM609, 购于
Millipore 公司。兔抗鼠的 FITC 标记的二抗，购于
Cell signal technology 公司。德国美天旎公司的流式
细胞仪，数据分析软件 ：macsquantify。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 用含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖
培养基在 37℃、5% CO2 饱和湿度细胞培养箱内培养
乳腺癌细胞株 231BO、231BO-Scrambled 和 231BO-
BSP27，常规更换培养液、消化传代。
1.2.2 流式细胞技术检测细胞表面整合素 αvβ3 的表
达水平 取乳腺癌细胞 231BO-BSP27 和 231BO-Scra-
mbled 的细胞培养瓶，弃旧培养基，消化液消化细胞。
将细胞悬液置于 1 000 r/min, 5 min 的离心机中，收集
细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于 0.5 mL PBS 中，细胞
计数板计数将细胞浓度调整为 1×106/mL。加封闭液
200 μL 于细胞沉淀中。离心洗涤细胞，1 000 r/min，
5 min。离心后弃上清。离心洗涤后将细胞重悬于 1
100 稀释的一抗工作液中，用 PBS 稀释一抗，吹打
均匀，避光在冰盒上孵育 30 min。加入 PBS 离心洗
涤细胞沉淀 2 次。加入用 PBS 稀释的 1 50 的 IgG-
FITC 标记的二抗 200 μL，吹打均匀，避光在冰盒
上孵育 30 min。PBS 离心洗涤 2 次。将细胞重悬于
200 μL PBS 中，混匀，置于流式检测管中。每种细
胞分 3 管，分别设置阳性检测、阴性对照（细胞 +
二抗）、空白对照（只含未标记的细胞）。
1.2.3 Western blotting 检测 BSP 对磷酸化 ILK 表达
水平的调控 用细胞裂解液分别提取乳腺癌细胞
231BO-Scramble 和 231BO-BSP27 的 总 蛋 白，BCA
测定法进行蛋白定量。蛋白样品变性后进行 SDS-
PAGE 凝胶电泳，然后转移至 PVDF 膜 ；含 5% 脱脂
奶粉的 TBST 室温摇动封闭 1 h ；加入 TBST 稀释的
兔抗人 p-ILK 单克隆抗体抗体（1 500 稀释）和兔
抗人 GAPDH 多克隆抗体（1 3 000 稀释），4℃摇床
过夜 ；加 TBST 稀释的 HRP（辣根过氧化物酶）标
记的二抗（1 2 000 稀释），37℃孵箱孵育 1 h ；加入
ECL 超敏发光液，X 线胶片曝光成像。Quantity One
软件进行分析，计算条带灰度值，以 GAPDH 作为
内参，计算 p-ILK 蛋白的相对表达量。
1.2.4 MTT 法检测细胞增殖 选取对数生长期细胞
（3.5×104 /mL）， 每 孔 200 μL 接 种 于 96 孔 细 胞 培
养板，置 37℃、5% CO 2 饱和湿度细胞培养箱内培
养。培养 12 h 后，弃上清，每孔分别加入 200 μL 含
LM609（1 250 稀释）的无血清培养基，设 3 个复孔，
并设无血清培养基 200 μL 作为对照。37℃、5% CO2
饱和湿度细胞培养箱内作用 24 h 后，每孔加 5 mg/mL
MTT 20 μL，置于 37℃、5% CO 2 培养箱继续孵育
4 h 后，吸除原有培养液，每孔加 DMSO （二甲基亚砜）
150 μL，选择 570 nm 处的波长，在酶标仪上测定光
密度值（OD），连续测定 8 d。
1.2.5 统计学处理 数据以均数 ± 标准差（x±s）
表示，采用 SPSS13. 0 统计软件包进行分析，组间
比较采用单因素方差分析，两两比较采用 t 检验，
P ＜ 0.05 或 P ＜ 0. 01 表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 231-BSP27细胞中 BSP蛋白表达的下调
与 231BO-Scrambled 细胞相比，231BO-BSP27
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期174
细胞中 BSP 蛋白水平明显降低，其抑制率达到（74.
32 ±2. 18）%（ 图 1）， 且 差 异 具 有 统 计 学 意 义
（P ＜ 0.01）。
2.2 BSP对MDA-MB-231细胞表面整合素 αvβ3表达
水平的影响
流式检测结果（图 2）显示，BSP 低表达水平的
乳腺癌细胞 231BO-BSP27 中 FITC 标记的整合素 avβ3
的阳性表达率 P1/P3（98.54 ±0.22）远低于 BSP 正
常表达水平的乳腺癌细胞 231BO-Scrambled 中 FITC
标 记 的 整 合 素 αvβ3 的 阳 性 表 达 率 P1/P3（37.42 ±
2.55）。表明胞内 BSP 表达水平与整合素 αvβ3 的表达
水平呈正相关关系。图 1 231BO-BSP27 细胞中 BSP 蛋白的表达下调
图 2 流式细胞术检测结果
A.231BO-BSP27 细胞阴性对照组 ；B.231BO-BSP27 细胞阳性试验组 ；C.231BO-Scrambled 细胞阴性对照组 ；
D.231BO-Scrambled 细胞阳性试验组
2012年第1期 175彭远远等 ：骨唾液酸蛋白通过整合素 αvβ3 调控 ILK 信号通路
2.3 LM609对MDA-MB-231细胞ILK磷酸化水平的
影响
LM609 处 理 前 的 231BO-BSP27 细 胞 中 p-ILK
相 对 表 达 水 平 与 231BO-Scrambled 细 胞 相 比 减 少
（39. 38 ±1. 38）%（P ＜ 0.01），（图 4）；LM609 处理
后 的 231BO-BSP27 中 p-ILK 相 对 表 达 水 平 与
231BO-Scrambled 细胞相比减少（33. 78 ±1. 51）%
（P ＜ 0.01），（图 4）。 BSP 低表达水平的乳腺癌细
胞中，磷酸化 ILK 的表达水平表达受到下调，BSP
对乳腺癌细胞 231BO 的 ILK 的活性具有明显的调控
作用 ；同时整合素 αvβ3 的表达量对 ILK 的磷酸化水
平具有明显调控作用，提示 BSP 通过整合素 αvβ3 调
控 ILK 信号通路。
殖能力。提示 BSP 通过与整合素 αvβ3 共同作用调控
ILK 信号通路进而影响细胞增殖。
图 3 BSP 不同表达水平 MDA-MB-231BO 细胞中
整合素 αvβ3 表达水平
图 4 乳腺癌细胞 231BO 中 ILK 磷酸化表达水平的变化
2.4 LM609影响MDA-MB-231细胞的增殖
MTT 试验检测 231BO-Scrambled 和 231BO-BSP27
细胞在 LM609 作用后细胞增殖能力的变化，结果
（图 5）显示，两株乳腺癌细胞经过 LM609 作用后，
连 续 8 d 测 其 在 570 nm 处 的 OD 值， 发 现 与 未 用
LM609 处理相比较，增殖能力均有降低（P ＜ 0.05）。
LM609 能部分的抑制整合素 avβ3 进而抑制细胞的增
图 5 MTT 检测 LM609 对 MDA-MB-231 细胞
增殖能力的影响
3 讨论
1994 年 Bellahcence 首次阐述了 BSP 在易发生
骨转移的人乳腺癌中表达［4］。BSP 是高度磷酸化和
糖基化分泌性蛋白，由 317 个氨基酸组成。多项研
究提示 BSP 在肿瘤的黏附、增殖、侵袭［5］、骨代谢［6］、
免疫反应（炎症和补体逃逸）［7］、血管生成［8］等
多个过程中发挥重要作用，但其具体作用机制还十
分不明确。研究证明，BSP 通过 C 端的 Arg-Gly-Asp
（RGD）序列不仅介导细胞外基质与细胞间的黏附［9］，
同时该序列能够与整合素结合，促进人乳腺癌细胞
的增殖和转移［10］。
整合素 αvβ3 由 αv 亚基和 β3 亚基组成，是整合素
家族的重要成员，分子量为 150 u。整合素与配体的
RGD 序列结合可促使黏附斑（focal adhesion plaque，
FAP）形成［11, 12］，同时还存在多种重要的信号转导
分子，如 ILK、FAK、STAT、Src、PI-3K 等［13］。其中
αvβ3 活化 ILK/AKT 信号通路，进而激活下游有关的多
种分子，如 CyclinD1、Caspase-3、VEGF、MMP-3，从
而调节细胞增殖、存活及分化，在增强肿瘤细胞增殖、
侵袭及转移等方面也发挥重要作用［14］。
整合素连接激酶 ILK 属于丝氨酸 / 苏氨酸蛋白
激酶，ILK 参与肿瘤发生机制中的许多过程，激活
的下游信号通路研究的比较多的包括 PI-3K/AKT、
Wnt［15］。本实验室已经初步证实 BSP 沉默，能够抑
制 ILK 下游信号通路 AKT 的表达，以及 AKT 下游
相关因子 caspase-3、VEGF 等的表达。是否 BSP 通
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期176
过与 αvβ3 结合来调控下游 LIK 激酶，并级联激活下
游与乳腺癌转移相关因子表达从而促进乳腺癌发展，
尚不清楚。
本研究提示，BSP 能够通过与整合素 avβ3 的结
合共同调控乳腺癌细胞内 ILK 信号通 路，进而对其
下游因子调控。整合素 αvβ3 的低表达能够抑制细胞
增殖。但该信号转导途径中所涉及的其他调控分子
还需进一步明确。BSP 对 ILK 信号通路的作用是否
完全依赖于整合素 αvβ3 受体 ,BSP 与整合素 αvβ3 共同
调控的信号通路除了 ILK 之外，还有其他信号通路
吗 , 具体机理是什么 , 这些都是需要进一步证实。深
入研究 BSP 与乳腺癌的关系，对揭示乳腺癌转移演
进的分子机制，以及探索以 BSP 为药物治疗靶点的
肿瘤预防和治疗研究具有重要意义。
4 结论
本研究通过流式细胞仪检测发现，乳腺癌细胞
内 BSP 表达水平和 αvβ3 表达水平呈正相关关系，即
BSP 低表达水平的乳腺癌细胞中整合素 αvβ3 的表达
水平也降低。同时发现整合素 αvβ3 和 BSP 共同调控
ILK 的表达。LM609 能够影响不同 BSP 表达水平的
乳腺癌细胞增殖。本研究结果提示，骨唾液酸蛋白
BSP 通过 RGD 序列与整合素 αvβ3 结合进而调控 ILK
激酶的表达水平，进而通过 ILK 信号通路影响乳腺
癌细胞的增殖。
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（责任编辑 李楠）