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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
新型抗生素产业化应用的一个重要障碍在于抗
生素产生菌的产素水平低，一般的发酵工艺优化只
能在较低程度上提高产素水平，而通过一系列物理、
化学、生物方法对菌种进行改良可有效地提高抗生
素产生菌的产素水平。
炭样小单孢菌 JXNU-1（Micromonospora carbon-
acea JXNU-1）是本实验室从南昌瑶湖农田土样中分
离到的一株稀有放线菌。该菌产生的单一组分抗生
素具有广谱的抗菌活性，结构中含有糖基，同时具
有典型核苷类物质的吸收光谱特征［1-3］。本研究针
对炭样小单孢菌 JXNU-1 原始菌株的产素水平较低，
采取热诱变处理，结合硫酸庆大霉素抗性筛选，以
期提高菌株的产素水平，为开发应用该炭样小单孢
菌抗生素奠定基础。
收稿日期 ：2012-09-18
基金项目 ：江西省科技支撑计划项目（20112BBF60026），公益性行业（农业）科研专项（201203072）
作者简介 ：李瑾，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物药物技术研究 ；E-mail ：56040001@qq.com
通讯作者 ：龙中儿，男，博士，教授，研究方向 ：基础和应用微生物学 ；E-mail ：Longzhonger@163.com
抗生素高产炭样小单孢菌的热诱变育种
李瑾  黄运红  李鹿鸣  彭伟梦  龙中儿
（江西师范大学生命科学学院，南昌 330022）
摘 要 ： 采用热诱变处理，结合庆大霉素抗性筛选法筛选，对产抗生素的炭样小单孢菌 JXNU-1 进行选育，最终获得抗生素
高产菌株 JXNU-1-16-R4。结果显示，其抗生素产率比出发菌株提高了 98.53%。
关键词 ： 炭样小单孢菌 热诱变 抗性筛选
Screening of Prolific Micromonospora carbonacea in Antibiotics
Production by Heat Mutagenesis
Li Jin Huang Yunhong Li Luming Peng Weimeng Long Zhonger
（College of Life Science，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022）
Abstract:  Heating mutagenesis effect, combined with gentamicin resistance screening, was used in breeding of prolific Micromonospora
carbonacea in antibiotics production from the strain of Micromonospora carbonacea JXNU-1. The overproducing strain JXNU-1-16-R4 was
screened with the production of antibiotics is 98.53% more than that of the original strain.
Key words:  Micromonospora carbonacea Heat mutagenesis Resistance screening
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 出发菌株炭样小单孢菌（Micromonos-
pora carbonacea）JXNU-1，活性检测靶菌金黄色葡
萄球菌（Staphylococcus aureas）。上述菌种均由江西
师范大学生命科学学院微生物学实验室于 4℃斜面
保存。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 高氏Ⅰ号培养基 用于斜面保存炭样小
单孢菌。可溶性淀粉 20 g，KNO3 1 g，NaCl 0.5 g，
K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，
琼脂 20 g，加热溶解于水后以蒸馏水定容至 1 000
mL，pH7.2-7.4，121℃灭菌 20 min。
1.1.2.2 牛肉膏蛋白胨培养基 用于斜面保存细菌。
牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，加
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期148
热 溶 解 后 以 蒸 馏 水 定 容 至 1 000 mL，pH7.0-7.2，
121℃灭菌备用。
1.1.2.3 种子培养基 蔗糖 22.5 g，黄豆粉 12.5 g，
K2HPO4 0.2 g，NaCl 1 g，Na2SO4 0.1 g，FeSO4 ·7H2O 0.01
g，CaCO3 2 g， 以 蒸 馏 水 定 容 至 1 000 mL，pH7.2，
121℃灭菌 20 min。
1.1.2.4 发酵培养基 淀粉 20 g，蔗糖 13 g，花生饼
粉 35 g，NaCl 1 g，K2HPO4 0.1 g，Na2SO4 0.1g，FeSO4 ·
7H2O 0.01 g，CaCO3 3 g，以蒸馏水定容至 1 000 mL，
pH7.7，121℃灭菌 20 min。
1.1.2.5 活性检测培养基 底层培养基 ：20 g 琼脂，
加热溶解后以蒸馏水定容至 1 000 mL，121℃灭菌
20 min。上层培养基 ：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，葡
萄糖 5 g，NaCl 5 g，琼脂 15-20 g，加热溶解后以
蒸馏水定容至 1 000 mL，pH7.0-7.2，121℃灭菌 20
min。
1.2 方法
1.2.1 炭样小单孢菌单孢子菌悬液的制备 取培养
7 d 的炭样小单孢菌新鲜斜面，用 10 mL 生理盐水洗
下，将孢子悬液转入另一只带有玻璃珠的三角瓶中，
28℃，200 r/min 震荡 20 min，无菌脱脂棉过滤，制
成 107 个 /mL 单孢子悬液。
1.2.2 炭样小单孢菌敏感抗生素的筛选 取炭样小
单孢菌单孢子悬浮液 0.2 mL 涂布于含有不同抗生素
浓度的抗性平板上，28℃培养 7 d，观察炭样小单孢
菌的生长情况。其中在低浓度区域生长，而高浓度
区域不生长的抗性平板上所含有的抗生素为炭样小
单孢菌的敏感抗生素。
1.2.3 炭 样 小 单 孢 菌 敏 感 抗 生 素 的 最 低 抑 菌 浓
度 将制备好的出发菌株孢子溶液涂布在含各种不
同浓度梯度抗生素的高氏Ⅰ号平板上，28℃培养 7 d，
观察不同平板上的菌落数，并记录不同抗生素作用
浓度。凡是在前一个低浓度平板上已长出菌落而在
后一个较高浓度平板上未长出菌落的，后一浓度即
为某种抗生素对出发菌株的孢子的最低抑菌浓度［4］。
1.2.4 炭样小单孢菌的自然选育 利用菌种的自发
突变，将出发菌的单孢子悬浮液涂布于高氏Ⅰ号平
板后，挑单菌落于斜面保存，摇瓶筛选，从中选育
抗生素相对高产的炭样小单孢菌菌株作为热诱变的
出发菌株。
1.2.5 炭样小单孢菌的热诱变处理 制备经上述自
然选育获得的相对高产菌株的单孢子悬浮液，取 10
mL 置于一定温度的恒温水浴锅中处理（热诱变）一
段时间，并迅速置于冰水中冷却。其中热诱变温度
和时间的选择以 75%-80% 左右的致死率为依据［5］。
1.2.6 炭样小单孢菌突变体的筛选 将热处理过的
单孢子悬浮液经适当稀释后，涂布于含硫酸庆大霉
素（浓度为炭样小单孢菌的最低抑菌浓度）的抗性
平板上，28℃培养 7 d，挑单菌落于斜面保存，并进
行摇瓶发酵初筛和复筛。
1.2.7 炭样小单孢菌的发酵培养 斜面菌种经活化
后，以接种环取 1 环孢子接种于装有 50 mL 种子培
养基的 250 mL 三角瓶中，200 r/min，28℃培养 96 h。
然后以 6% 接种量移种于装有 20 mL 发酵培养基的
250 mL 三角瓶中，同样的条件下培养 108 h。
1.2.8 抗 生 素 的 抗 菌 活 性 测 定 发 酵 液 经 4 000
r/min 离心 20 min，取上清，杯碟法［6］测定抗生素
的抗菌活性，以游标卡尺测定的抑菌圈直径大小表
示抗菌活性的强弱。
2 结果
2.1 炭样小单孢菌的敏感抗生素及其最低抑菌浓度
炭样小单孢菌 JXNU-1 对环丙沙星、利福平、
氧氟沙星、庆大霉素、氨苄西林等常见抗生素都比
较敏感，它们对炭样小单孢菌的最低抑菌浓度如表
1 所示。本试验选择 80 μg/mL 的庆大霉素作为抗性
筛选的条件。
表 1 各种抗生素对炭样小单孢菌的最低抑菌浓度
2.2 炭样小单孢菌的自然选育
从涂布有炭样小单孢菌 JXNU-1 单孢子悬浮液
的平板（28℃培养 4 d）上随机挑选了 50 株（分别
编号 JXNU-1-X）进行摇瓶发酵，其发酵液的抗菌活
性测定结果如图 1 所示。在所选的 50 株菌种中，炭
抗生素 致死浓度 (μg/mL)
环丙沙星 16
利福平 128
氧氟沙星 32
庆大霉素 80
氨苄西林 1
2013年第4期 149李瑾等 ：抗生素高产炭样小单孢菌的热诱变育种
样小单孢菌 JXNU-1-16 的抗生素发酵产率最高，其
抑菌圈直径达到 26.00 mm。试验将该菌作为热诱变
的出发菌株。
浴时间过长或过短，其致死率都不适于诱变育种的
致死率要求，选择热诱变的适宜时间为 10 min。
28
24
20
16
12
In
hi
bi
tio
n
zo
ne
d
ia
m
et
er
mm

8
4
0
1 4 7 10 13 16 19 22 25
Strain No.
28 31 34 37 40 43 46 49
图 1 50 株菌株摇瓶发酵结果
2.3 炭样小单孢菌的热诱变育种
2.3.1 热诱变温度的选择 炭样小单孢菌单孢子菌
悬浮液的致死率随热诱变温度的变化如图 2 所示。
在 10 min 内，炭样小单孢菌对 50℃以下高温的敏
感性较弱，但随着热诱变温度的不断升高，菌株对
热的敏感也逐渐提高，致死效应也更明显。当热诱
变温度达到 80℃时，致死率达到 99.68%，热诱变
温度达到 90℃时，致死率已达到 100%，且多次重
复均保持同一趋势。最终选择的适宜热诱变温度为
76℃。
0
20
40
60
80
100
120
40 50 60 70 80 90 100
Le
th
al
ity
ra
te
˄%
˅
Temperature˄ć˅
图 2 温度对炭样小单孢菌 JXNU-1-16 热致死率的影响
2.3.2 热诱变时间的选择 炭样小单孢菌单孢子的
热致死率随时间变化如表 2 所示。在 76℃条件下水
浴 10 min，炭样小单孢菌的致死率达到 76.9%，水
表 2 热处理时间对炭样小单孢菌 JXNU-1-16 致死率的影响
热诱变时间（min） 致死率（%）
2.5 11.5
5 40.1
7.5 59.3
10 76.9
15 89.6
20 93.3
30
28
26
24
22
In
hi
bi
tio
n
zo
ne
d
ia
m
et
er
mm

20
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
Strain No.
25 27 29 31 33 35 37 39 CK
图 3 40 株突变菌株的摇瓶发酵结果
2.3.3 热诱变菌株的筛选 将在 76℃处理 10 min 的
炭样小单孢菌 JXNU-1-16 单孢子悬浮液涂布在含有
硫酸庆大霉素 80 μg/mL 的抗性平板上，28℃培养 7
d 后，挑选在抗性平板上生长的突变株 40 株（分别
编号为 JXNU-1-16-RX，X 代表菌株号 1-40）进行
摇瓶发酵，其发酵液的抗生素活性测定结果如图 3
所示。其中炭样小单孢菌 JXNU-1-16-R4 产抗生素能
力最高，抑菌圈达到 29.15 mm，比出发菌株提高了
3.15 mm。
2.3.4 热诱变菌株的抗生素产率 在抑菌圈测定方
法一致的条件下，一定范围内的抗生素浓度（效价）
的对数与抑菌圈直径之间存在着线性关系，即 ：
D=algC+b （1）
式中 ：C 为抗生素浓度 ； D 为抑菌圈直径 ； a，
b 分别为常数。
将出发菌炭样小单孢菌 JXNU-1 发酵液经预处
理除菌后，假设其抗生素浓度为 1，同时将预处理
后的发酵液做一系列的对倍稀释，分别测定其抑菌
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期150
圈直径，回归后即求得常数 a=10.576（图 4）。 针对传统诱变育种中随机筛选方法存在的随机
性大、周期长、工作量大等缺点［7］，以及产抗微生
物一般具有“抗生素生物合成基因簇通常含有 1 个
以上的耐药性基因，且耐药性基因和结构基因的表
达之间有一定的相互调节作用”的共性规律［9］，课
题组首先筛选了出发菌株——炭样小单孢菌 JXNU-1
的敏感抗生素，并检测了敏感抗生素对炭样小单孢
菌 JXNU-1 的最低抑菌浓度，构建了庆大霉素“抗
性筛选”法筛选抗生素高产炭样小单孢菌突变株。
从筛选效果来看，该方法实现了对大量突变株进行
有目的的筛选，从而有效提高了高产菌株的筛选效
率，而且操作简单、周期短、安全性好［10］。
诱变剂量的选择是影响诱变育种的另一重要因
素，具体到热诱变过程就是热诱变温度和时间的选
择。在微生物诱变育种实践中，诱变剂量的选择一
般以致死率为依据，选择致死率在 75%-80% 左右
的诱变剂量［5］，试验选择了热诱变炭样小单孢菌的
条件为 76℃处理 10 min，与文献［11，12］报道的条件
不同，主要是因为不同菌种对热的耐受性各不相同。
通过热诱变处理经自然选育后获得的优良出发
菌株炭样小单孢菌 JXNU-1-16 的单孢子悬浮液、庆
大霉素抗性筛选法筛选，试验获得了抗生素高产突
变株炭样小单孢菌 JXNU-1-16-R4，其抑菌圈直径达
到 29.15 mm。实践研究表明，在一定范围内，抗生
素浓度（效价）的对数与抑菌圈直径之间存在着线
性关系［14］，经计算，突变菌株炭样小单孢菌 JXNU-
1-16-R4 的抗生素浓度是出发菌株的 1.9853 倍，即
抗生素产率比出发菌株提高了 98.53%。
4 结论
（1）炭样小单孢菌对环丙沙星、利福平、氧氟
沙星、庆大霉素、氨苄西林都有较强的敏感性，其
对炭样小单孢菌 JXNU-1 的最低抑菌浓度分别为 16、
128、32、80 和 1 μg/mL。
（2）通过研究热对炭样小单孢菌致死率的影
响，确定热诱变的适宜温度为 76℃，作用时间为
10 min。出发菌株炭样小单孢菌 JXNU-1 经热诱变
处理后，以庆大霉素作为筛选因子获得突变株炭样
小单孢菌 JXNU-1-16-R4，其发酵液抑菌圈直径达到
29.15 mm，效价比出发菌株提高了 98.53%。
y = 10.576x + 25.91
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
lgC
D
(m
m
)
R2 = 0.9975
图 4 抗生素浓度与抑菌圈直径的关系图
设两发酵液中抗生素的浓度分别为 C1 和 C2，杯
碟法测其抑菌圈直径分别为 D1 和 D2，则由（1）可得：
D1=algC1+b （2）
D2=algC2+b （3）
将（3）-（2）得 ：
lgC2-lgC1=lg（C2/C1）=（1/a）（D2-D1） （4）
因此，只要确定常数 a，根据抗生素的抑菌圈
直径大小，就可以确定两抗生素的浓度关系。
将 a=10.576、D2（突变株发酵液的抑菌圈直径，
即 29.15 mm）、D1（出发菌株发酵液的抑菌圈直径，
即 26 mm）分别代入（4）式，求得 ：
C2/C1=1.9853
也即突变菌株炭样小单孢菌 JXNU-1-16-R4 的发
酵液中抗生素浓度比出发菌株提高了 98.53%。
3 讨论
抗生素产生菌的产素水平低是新抗生素研发的
重要障碍。为突破这一障碍，诱变育种是目前最常
用方法之一，即通过采用物理、化学等手段来诱变
抗生素产生菌，从中筛选高产菌株。但传统的诱变
育种过程存在两大困难，一是有效诱变方法（剂）
的选择，二是高效筛选方法的建立。常用的物理诱
变方法需要专用设备，且正突变率低，而化学诱变
剂（如烷化剂 EMS、NTG 等）又大多是致癌剂或剧
毒药品［7］。热诱变育种方法所需设备简单，操作方
便安全，且热效应明显，可控性好的明显优势［8］在
本研究中得到充分体现。
2013年第4期 151李瑾等 ：抗生素高产炭样小单孢菌的热诱变育种
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（责任编辑 马鑫）