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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):195-200
深海是全球最大的独立生态系统，生活于深海
的海洋微生物处于独特的物理、化学和生态环境中，
形成了特殊的遗传机制和代谢系统，使深海微生物
能产生结构新颖、活性独特的次级代谢产物。因此，
深海微生物具有重要的研究和应用价值，可为开发
新的生物活性物质提供优异的种质资源［1-3］。海洋
真菌是海洋微生物的重要组成部分，具有巨大的开
发潜力［4］。为了发掘深海真菌活性次级代谢产物，
本课题组前期对分离自南海沉积物的深海真菌进行
培养条件优化、活性筛选和化学筛选，发现菌株
FS86 具有生长速度快、代谢产物丰富、抗真菌活性
强等特点。本研究以该菌株为研究对象，根据其培
养特征和形态特征及 ITS 序列分析对该菌株进行鉴
定，并测试其发酵提取物对病原真菌和肿瘤细胞株
的抑制活性，旨在为进一步开发新的抗菌、抗肿瘤
活性物质提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 来 源 菌 株 FS86 分 离 自 南 海（12 °
收稿日期 ： 2015-05-08
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31272087），国家“863”计划资助项目（2012AA092104），广东省自然科学基金项目（S20130100145
57），广州市科技计划项目（2013J4100067），广东省海洋经济创新发展区域示范专项项目（GD2012-D01-002）
作者简介 ：吴后吕，男，硕士研究生，研究方向 ：海洋微生物活性代谢产物 ；E-mail ：four_square@163.com
通讯作者 ：章卫民，男，博士，研究员，研究方向 ：药用微生物资源及其活性物质 ；E-mail ：wmzhang58@qq.com
一株深海真菌 FS86 的分离鉴定及其生物活性研究
吴后吕1，2 李浩华2 谭国慧2 陈玉婵2 刘运美1 章卫民2
（1. 南华大学药物药理研究所，衡阳 421001 ；2. 广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用重
点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070）
摘 要 ： 采用平板涂布法从南海深海沉积物中分离出一株真菌 FS86，根据培养特征、形态学特征和 ITS 序列分析，该菌株
被鉴定为球孢枝孢（Cladosporium sphaerospermum）。生物活性测试结果表明，其发酵提取物对 8 种病原真菌和 4 种肿瘤细胞株都具
有明显的抑制作用，其 MIC 值和 IC50 值分别为 0.1-4 mg/mL 和 0.86-2.13 μg/mL。
关键词 ： 深海真菌 ；球孢枝孢 ；分离 ；鉴定 ；抗真菌 ；细胞毒
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.031
Isolation and Identification of a Deep-sea-derived Fungus FS86 and Its
Biological Activities
WU Hou-lü1，2 LI Hao-hua2 TAN Guo-hui2 CHEN Yu-chan2 LIU Yun-mei1 ZHANG Wei-min2
（1. Institute of Pharmacy and Pharmacology，University of South China，Hengyang 421001 ；2. State Key Laboratory of Applied Microbiology
Southern China，Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong Open Laboratory of
Applied Microbiology，Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510070）
Abstract: A strain of fungus FS86 was isolated from deep-sea sediment of South China Sea by the spread plate method. According to the
culture features, morphological characteristics and ITS sequence analysis, the strain was identified as Cladosporium sphaerospermum. Bioassay
results showed that the fermentation extract of the strain FS86 demonstrated significant inhibitory effects against 8 pathogenic fungi and 4 tumor
cell lines with MICs of 0.1-4 mg/mL and IC50 values of 0.86-2.13 μg/mL, respectively.
Key words: deep sea fungus ；Cladosporium sphaerospermum ；isolation ；identification ；antifungal ；cytotoxic
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1196
58.551 E，17° 0.646 N）1598 m 深处的海洋沉积物。
1.1.2 供试菌株及肿瘤细胞株 病原真菌 ：白色
念 珠 菌（Candida albicans）、 黑 曲 霉（Aspergillus
niger）、 黄 曲 霉（Aspergillus flavus）、 绿 色 木 霉
（Trichoderma viride）、 胶 孢 炭 疽 菌（Colletotrichum
gloeosporioides）、 柱 枝 双 孢 霉（Cylindrocladium
scoparium）、新月弯孢菌（Curvularia lunata）、链格
孢（Alternaria alternata）。肿瘤细胞株 ：人肺癌细胞
株 NCI-H460、人乳腺癌细胞株 MCF-7、人神经胶质
瘤细胞株 SF-268、人肝癌细胞株 HepG-2。以上菌株
和肿瘤细胞株均保存于广东省微生物研究所。
1.1.3 培养基 分离培养基 ：含 3% 粗海盐的 PDA
培养基；液体发酵培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖 10 g、
甘露醇 20 g、酵母膏 3 g、蛋白胨 5 g、味精 5 g、粗
海盐 3 g，水 1 L。病原真菌采用 PDA 培养基 ；肿瘤
细胞株采用 RPMI-1640 培养基。
1.1.4 试剂 二甲基亚砜（DMSO），Sulforhodamine
B sodium salt（SRB），均购自 Sigma 公司 ；三氯醋酸
（分析纯），广州化学试剂一厂 ；RPMI-1640 培养基，
吉诺生物医药技术有限公司。
1.1.5 仪器 PYX-DHS 电热恒温培养箱，湖北省
黄 石 医 疗 器 械 厂 ；YXQ.WY21-600 电 热 高 压 蒸 汽
灭菌锅，广州市华南医疗器械有限公司 ；超净工作
台，上海恒益科技有限公司 ；RE-2000 旋转真空蒸
发仪，上海亚荣生化仪器厂 ；2123-2 二氧化碳培养
箱，Shellab 公司；DMI3000B 倒置显微镜，Leica 公司；
MULTISKAN GO 全波长酶标仪，Thermo 公司。
1.2 方法
1.2.1 菌株的分离纯化 无菌操作取适量海洋沉积
物样品用含 3% 粗海盐的无菌水稀释到 10%，28℃
振荡 20 min，取 0.1 mL 均匀涂布在分离培养基中，
28℃恒温箱培养，待菌落长出后，挑取平板中单一
菌落转接至含有新鲜分离培养基的培养皿中，继续
培养，经多次分离纯化直至获得纯菌株后，转接至
斜面培养 3-5 d 后保存于 4℃冰箱。
1.2.2 菌株的鉴定
1.2.2.1 形态特征 将菌株 FS86 接种于 PDA 培养
基平板上，28℃下培养 7 d，肉眼观察菌株的培养特
征 ；利用光学显微镜和电子显微镜观察其菌丝、分
生孢子梗、分生孢子等形态特征。
1.2.2.2 ITS 序 列 测 定 和 系 统 发 育 分 析 采 用 真
菌 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 提 取 菌 株 的 基 因 组
DNA，作为 PCR 扩增的模板。PCR 扩增采用真菌
rDNA 内 转 录 间 隔 区（rDNA ITS） 通 用 引 物 ITS1
（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3， 正 向 ） 和 ITS4
（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3， 反 向 ） 扩 增 分
离菌株的 rDNA ITS 区。PCR 采用 20 μL 反应体系，
通过 Ex Taq（TaKaRa）进行。反应条件 ：93℃预变
性 3 min ；93℃变性 45 s，55℃复性 45 s，72℃延伸
1.5 min，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。PCR
产物由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。
获得的序列通过 BLAST 程序在 GenBank 上进行相似
性序列检索，下载相关序列，以 Cercospora beticola
CBS 124.31（KF251298） 为 外 类 群， 运 用 MEGA 5
软件通过邻接法（Neighbor-Joining），构建系统发育
树，Bootstrap 设置为 1 000 次重复。
1.2.3 菌株的发酵与提取物的制备 将菌株 FS86 接
种到液体发酵培养基中，28℃，120 r/min 培养 7 d
后将发酵产物用乙酸乙酯冷浸提取多次至提取液基
本无色，合并提取液，经 55℃下减压浓缩至干，得
发酵提取物。将提取物浸膏用二甲基亚砜（DMSO）
溶解，配制成 50 mg/mL 浓度，备用。
1.2.4 抗菌活性测定 取对数生长期的白色念珠菌
用生理盐水稀释至浓度为 106 CFU/mL 的菌液 ；其它
真菌调整至孢子数为 106 个 /mL 的孢子悬液，吸取
制备好的菌液或孢子悬浮液 1 mL 于培养皿中，倒入
已冷却至合适温度的 PDA 培养基，混合均匀，用无
菌镊子夹取厚度为 1.5 mm、直径为 6 mm 的滤纸片
置于含菌平板上，在滤纸片上分别滴加提取液 5 μL
作为样品组，以 DMSO代替发酵提取液作为空白对
照组，以制霉菌素作为阳性对照，将平板置于 28℃
恒温箱培养 72 h，用十字测量法测量抑菌圈直径的
大小。
1.2.5 最 低 抑 菌 浓 度 的 测 定 将 提 取 物 溶 液 用
DMSO 分别稀释至浓度为 4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05
mg/mL。按 1.2.4 方法测定，观察滤纸片周围的抑菌圈，
以周围有抑菌圈的滤纸片所含样品的最低溶液浓度
为最低抑菌浓度（MIC 值）。
1.2.6 细胞毒活性测定 采用 SRB 法［5］测定提取
2016,32(1) 197吴后吕等：一株深海真菌 FS86 的分离鉴定及其生物活性研究
物对肿瘤细胞毒活性 ：取对数生长期的 NCI-H460、
SF-268、MCF-7、HepG-2 细 胞， 用 胰 酶 消 化， 台
盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大
于 95% 后，用新鲜培养基调整细胞浓度为 3 × 104
个 /mL，细胞接种于 96 孔板，每孔加入 180 μL 的细
胞悬液，并设空白孔调零，于 37℃、5% CO2 培养
箱培养 24 h。待细胞贴壁后，每孔加入 20 μL 待测
样品，阴性对照加 20 μL 培养基，以顺铂作阳性对
照。置 CO2 培养箱中培养 72 h 后，加入 50 μL 50%
冷三氯醋酸固定细胞，4℃放置 1 h 后用蒸馏水洗涤
5 次，空气中自然干燥。然后每孔加入由 1% 冰醋酸
配制的浓度为 4 mg/mL 的 SRB 溶液 100 μL，室温中
染色 30 min，去上清，用 1% 冰醋酸洗涤 5 次，空气
干燥。最后每孔加入浓度为 10 mmol/mL 的 Tris 溶液
200 μL，用酶标仪测定 570 nm 处的吸光度（A）值，
按以下公式计算提取物对细胞生长的抑制率，采用
SigmaPlot 10.0 软件计算 IC50 值。
细胞生长抑制率（％）=（1-A 样品组 / 药物组 /
A 阴性组）×100％。
2 结果
2.1 菌株FS86的鉴定
2.1.1 菌株培养特征与形态特征 菌株 FS86 在 PDA
培养基上 28℃培养 7 d，直径达 35 mm，菌落正面
橄榄褐色，有辐射状沟纹，中央稍隆起，边缘白色，
绒毛状 ；菌落背面灰黑色。菌丝有隔，粗 3-5 μm，
分生孢子梗直立或稍弯曲，分枝或不分枝，圆柱形，
（60-165）μm×（3-5）μm， 具 分 隔 ；枝 孢 圆 柱 形
或纺锤形，（7-21）μm×（3-3.5）μm，具 1-4 个分
隔 ；分生孢子黄褐色至橄榄褐色，球形、近球形或
卵圆形，（3.5-6.3）μm×（3.1-4.2）μm，单孢，表
面具疣突，孢脐明显（图 1）。参照 Bensch 等［6］的
分类系统，菌株 FS86 鉴定为球孢枝孢（Cladosporium
sphaerospermum）。
2.1.2 ITS 序列测定和系统发育分析 将测序获得的
序列信息提交至 GenBank，登录号为 KF294264。BL-
AST 结果显示，菌株 FS86 与 C. sphaerospermum AT-
CC MYA-4645（HQ263345）的相似度为 99.4％。从
构建的系统发育树（图 2）看，菌株 FS86 与 4 条 C.
sphaerospermum 序列聚为高度自展支持的一支，彼此
间遗传距离极小。因此，通过分子系统学分析确定
菌株 FS86 为球孢枝孢。
2.2 抗菌活性
从表 1 和图 3 可以看出，菌株 FS86 的发酵提取
物对 8 种病原真菌都具有明显的抑制作用，抑菌圈
直径均达 30 mm 以上 ；其中对白色念珠菌的抑制作
用最为显著，抑菌圈直径达 45.2 mm，对黑曲霉和
黄曲霉的抑菌圈直径为 40 mm 左右，对其他病原真
菌的抑菌圈直径为 30-37 mm。
2.3 最低抑制浓度
通过菌株 FS86 的发酵提取物对 8 种供试真菌最
低抑制浓度的测试，结果（表 2）显示该提取物对
白色念珠菌和新月弯孢霉的最低抑制浓度（MIC 值）
仅为 0.1 和 0.25 mg/mL，对其他真菌的最低抑制浓
度为 1-4 mg/mL。
2.4 细胞毒活性
菌株 FS86 发酵提取物的细胞毒活性测试结果
（表 3）显示，该提取物对 4 种肿瘤细胞株 SF-268、
MCF-7、NCI-H460、HepG-2 均表现出很强的细胞毒
活性，其中对 MCF-7 的抑制效果优于阳性对照药物
顺铂，IC50 值仅为 0.86 μg/mL，对其它细胞株的 IC50
值均接近阳性对照药物，IC50 值为 1.42-2.13 μg/mL。
15 μm
A B
C D
5 μm
A 和 B ：分别为菌株 FS86 在 PDA 培养基上正、背面的培养特征 ；C 和 D ：
扫描电镜下菌株 FS86 的微观特征
图 1 菌株 FS86 的培养特征及扫描电镜下的形态特征
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1198
3 讨论
枝孢属（Cladosporium）真菌种类繁多，分布
广泛［4］。研究表明，枝孢属真菌的代谢产物具有
多种生物活性，是寻找活性物质的重要资源。如
分 离 自 芽 枝 状 枝 孢（C. cladosporioides） 的 枝 孢 菌
素（Cladosporin）对红蜘蛛、蚜虫和纷壳虫等害虫
有较强的毒杀作用［7，8］；来源于植物的芽枝状枝孢
还能产生石杉碱甲、紫杉醇等活性物质［9，10］；分
离自栓皮栎的枝孢菌（C. sp. I（R）9-2）能产生抗
真菌活性的布雷菲尔德菌素（Brefeldin A）［11］，该
细胞毒素还具有抗肿瘤、抗病毒、抗有丝分裂等
Cladosporium arthropodii JN906979
Cladosporium ramotenellum CBS 121628 EF679384
Cladosporium spinulosum CBS 119907 EF679388
Cladosporium herbaroides CBS 121626 EF679357
Cladosporium variabile CBS 121635 EF679402
Cladosp orium chalastosporoides CBS 125985 HM148001
Cladosporium lycoperdinum CBS 574.78C HM148115
Cladosporium velox CBS 119417 DQ780361
FS86 KF294264
Cladosporium sphaerospermum ATCC MYA-4645 HQ263345
Cladosporium sphaerospermum PCT.30 HQ248189
Cladosporium sphaerospermum UM 245 JX966579
Cladosporium sphaerospermum UM 843 JX966576
Cladosporium salinae EXF-335 DQ780374
Cercospora beticola CBS 124.31 KF251298 9977995789978893 96
0.02
图 2 菌株 FS86 与相关菌株的系统发育树
表 1 菌株 FS86 发酵提取物对病原真菌的抑制作用（x- ±s，
n=3）
供试菌
抑菌圈直径 /mm
FS86 提取物 阳性对照
白色念珠菌 45.2±0.20 25.5±0.63
黑曲霉 41.0±0.72 30.2±0.55
黄曲霉 40.2±0.63 15.5±0.11
绿色木霉 30.8±1.21 21.9±0.31
胶孢炭疽菌 36.8±1.64 N
柱枝双孢霉 35.2±0.68 N
新月弯孢霉 30.5±0.22 N
链格孢 30.1±0.76 N
注 ：样品组每片滤纸含提取物 250 μg，阳性对照每片滤纸含制霉菌素 10
μg ；“N”表示未设阳性对照
A B C D
E F G H
A ：白色念珠菌 ；B ：黑曲霉 ；C ：黄曲霉 ；D ：绿色木霉 ；E ：柱枝双胞霉 ；F ：胶孢炭疽菌 ；G ：新月弯孢霉 ；H ：链格孢
图 3 菌株 FS86 对病原真菌的抑制效果
2016,32(1) 199吴后吕等：一株深海真菌 FS86 的分离鉴定及其生物活性研究
活性［12］；从银杏中分离的尖孢枝孢（C. oxysporum
R2）其发酵粗提物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆
菌（Bacillus subtilis）具有明显的抑制作用［13］。目
前，关于海洋来源的枝孢属真菌活性代谢产物的报
道还不多，Shigemori 等［14］从分离自海藻的枝孢菌
（C. sp. L037）中分离得到 12 元大环内酯 sporiolides
A， 它 对 新 型 隐 球 菌（Cryptococcus neoformans） 和
粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）具有抑菌活性 ；林
涛等［15］从分离自海口红树林泥土的球孢枝孢（C.
sphaerospermum PJX-41） 中 分 离 得 到 2 个 具 有 抗
肿瘤活性的喹唑啉酮生物碱类化合物 lapatin A 和
tryptoquivaline ；Wu 等［16］ 从 太 平 洋 深 海 来 源 的 球
孢 枝 孢（C. sphaerospermum 2005-01-E3） 中 发 现 化
合物 Cladosin C 对流感病毒 A H1N1 具有抑制活性。
本研究发现来源于南海深海沉积物的球孢枝孢（C.
sphaerospermum FS86）发酵提取物具有明显的抗真
菌和细胞毒活性，因此该菌株具有重要的研究价值，
其活性代谢产物有待进一步深入研究，以期开发出
新型的抗真菌和抗肿瘤活性物质。
4 结论
本研究通过形态学和 ITS 系统发育分析，将深
海真菌 FS86 鉴定为球孢枝孢（C. sphaerospermum）。
经抗菌活性测试发现，该菌株的发酵提取物对所有
的供试真菌均有明显的抑制作用，抑菌圈直径均达
30 mm 以上，其中对白色念珠菌的抑制活性尤其显
著，其最低抑制浓度（MIC 值）为 0.1 mg/mL ；经
细胞毒活性测试发现，该菌株的发酵提取物对供试
的 4 种肿瘤细胞有显著的抑制活性，其中对细胞株
MCF-7 的活性尤为显著，其 IC50 值为 0.86 μmol/L，
低于阳性对照药物顺铂。
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表 2 菌株 FS86 提取物对病原真菌的最低抑制浓度（MIC 值）（n=3）
供试菌
提取物浓度（mg·mL-1）
MIC 值 /（mg·mL-1）
4 2 1 0.5 0.25 0.1 0.05
白色念珠菌 + + + + + + - 0.1
黑曲霉 + + + - - - - 1
黄曲霉 + + - - - - - 2
绿色木霉 + + - - - - - 2
胶孢炭疽菌 + + + - - - 1
柱枝双孢霉 + + + - - - - 1
新月弯孢霉 + + + + + - - 0.25
链格孢 + - - - - - - 4
注 ：“+”表示有抑菌圈，“-”表示无抑菌圈
表 3 菌株 FS86 发酵提取物对肿瘤细胞株的 IC50 值（x
-
±s，
n=3）
样品
IC50 /（μmol·L
-1）
SF-268 MCF-7 NCI-H460 HePG-2
发酵提取物 2.13±0.31 0.86±0.12 1.95±0.00 1.42±0.34
顺铂 2.51±0.03 1.36±0.19 1.33±0.85 1.75±0.21
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1200
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（责任编辑 李楠）