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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):75-80
肿瘤坏死因子（TNF-α）是由单核巨噬细胞激
活后分泌的一种细胞因子，能够与特异受体结合后
发挥多种生物学效应，包括免疫激活、炎症反应。
类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种
收稿日期 ：2015-03-29
基金项目 ：广东省引进创新科研团队计划（201101Y0104990178）
作者简介 ：杨辉，男，硕士，研究方向 ：生物技术药物 ；E-mail ：highman52@163.com ；杨彬同为本文第一作者
通讯作者 ：孙文正，男，博士，研究方向 ：生物技术药物 ；E-mail ：sunwenzheng@hecpharm.com
两步串联层析法纯化抗 TNF-α 单克隆抗体
杨辉  杨彬 马旭通  孙文正  林小鹊  谭世杰
（广东东阳光药业有限公司，东莞 523000）
摘 要 ： 旨在建立从重组 CHO 细胞发酵培养液中纯化抗 TNF-α单克隆抗体的两步串联层析法。将含有抗 TNF-α单克隆抗体
的料液经两次离心、一步过滤的预处理后，用 protein A 填料捕获，阳离子填料 Sourec30 精细纯化。精细纯化过程中利用 DoE 的方法，
采用 CCF（Central composite face）设计，探讨了洗脱 pH 值及盐浓度对纯化的影响。纯化后的抗 TNF-α单克隆抗体经 HPLC 以及毛
细管电泳，检测其浓度、纯度以及多聚体含量。结果显示，亲和层析的最佳洗脱条件为 pH4.0。通过 DOE 优化，为达到质量目标
（回收率 90% 以上，纯度 97% 以上，多聚体 0.3%），筛选出最佳洗脱范围为 0.05-0.13 mol/L NaCl 以及 pH5.7-6.0，选定 pH6.0 与 0.10
mol/L NaCl 作为 Source 洗脱条件，此时回收率 94.3%，纯度 97.3%，多聚体 0.3%，其质量与参比制剂接近。
关键词 ： 两步抗体纯化平台 ；抗 TNF-α单克隆抗体 ；亲和层析 ；阳离子交换层析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.011
A Two-step Series Chromatography for the Purification of Anti-TNF-α
Monoclonal Antibody
Yang Hui Yang Bin Ma Xutong Sun Wenzheng Lin Xiaoque Tan Shijie
（Sunshine Lake Pharma Co.，Ltd，Dongguan 523000）
Abstract: The objective of this work is to establish a two-step series chromatography method for purification of anti-TNF-α monoclonal
antibodies（mAbs）from recombinant CHO cell culture medium. Anti-TNF-α mAbs from harvested cell culture fluid（HCCF）after 2 times
centrifugation and 1 filtration were captured using filler of protein A, from which the eluant was then further finely purified using the positive
ion filler Source30 resin. During fine purification, the effects of pH and salt concentration of the Source30 on the purification was investigated
using the DoE method and CCF（Central Composite Face）to achieve the optimal mAbs recovery and purity as well as the lowest aggregate
content. The concentration and aggregation ratio of the purified mAbs were determined by HPLC and the purity by CE-SDS. Results were as the
followings. The optimal elution pH for protein A affinity chromatography was 4.0. After DoE optimization, in order to reach the quality target（>
90% recovery, > 97% purity, and < 0.3% aggregate）, the optimal elution range was 0.05-0.13 mol/L NaCl at pH 5.7-6.0. The elution buffer
containing 0.10 mol/L NaCl at pH 6.0 was chosen as the optimal condition of Source elution with 94.3% product recovery, 97.3% purity, and
0.3% aggregate, i. e. , very close to those in the reference standard. In conclusion, we have successfully developed and optimized a two-step
series chromatography method at the laboratory scale for the purification of anti-TNF-α mAbs with high recovery, high purity, and low aggregate
content.
Key words: two-step chromatography antibody purification platform ；anti-TNF-α monoclonal antibody ；affinity chromatography ；
cation exchange chromatography
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1276
以慢性侵蚀性关节炎为特征的自身免疫炎性疾病，
致残率较高。在 RA 患者的关节的滑膜液中 TNF-α
呈高表达，它会引起病理性炎症，并且破坏关节，
因此 TNF-α 抑制剂可以用于治疗 RA，因此能中和
TNF-α 的抗 TNF-α 单克隆抗体成为研究的热点。
现在工业领域单克隆抗体纯化的方法主要包括
离心、过滤以及柱层析等方法，其中柱层析的方法
又包括亲和层析、离子层析、疏水层析和复合层析
等［2-6］。工业上纯化单克隆抗体通常采用三步纯化
法［7］，即通过三步串联的层析来获得达到质量标准
的原料药。而两步串联层析工艺比较少见，因为两
步串联层析工艺往往很难达到原料药的质量要求。
本研究通过亲和层析与阳离子层析串联的两步串联
层析，对 CHO 细胞表达的人源化抗 TNF-α 单克隆抗
体进行纯化，旨在提高回收率和纯度，为进一步的
工艺放大提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
参 比 制 剂（ 全 人 源 抗 TNF-α 抗 体， 原 研 美
国 Abbvie）；抗 TNF-α 单克隆抗体由本实验室制备
（CHO 细胞系由本实验构建表达），通过两次离心
后过 0.2 μm 滤膜获得 ；GE avant 25 中低压层析仪
（检测波长为 280 nm）、PALL 层析柱 2 根（1. 0 cm
×20 cm， 内 填 装 GE MabSelect SuRe 填 料 以 及 GE
Source30 阳 离 子 填 料 ）、Agilent1260 HPLC（ 安 捷
伦 公 司 ）、BECKMAN PA800 Plus 毛 细 管 电 泳 系 统
（BECKMAN 公司），其他试剂均为分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 亲和层析柱纯化 将装填好的 protein A 层析
柱连接到层析系统上，用 3 倍柱体积上样缓冲液（25
mmol/L PBS pH7.0）平衡柱子，然后样品进行直接上
样（原样品经过 3 000×g 两次离心过 0.2 μm 滤膜），
用 2 倍柱体积平衡缓冲液冲洗柱子（基线平稳），然
后用不同 pH 值（3.4、3.6、3.8、4.0 和 4.2）的洗脱
缓冲液（50 mmol/L 柠檬酸缓冲液）进行洗脱，收集
洗脱组分，检测。
1.2.2 阳 离 子 层 析 柱 纯 化 将 装 填 好 的 阳 离 子
Source30 层析柱连接到层析系统上，用 3 倍柱体
积上样缓冲液（50 mmol/L PBS pH6.0）平衡柱子，
然 后 进 行 上 样（ 上 样 量 30 mg/mL， 样 品 被 调 节
pH6.0），用 3 倍柱体积平衡缓冲液冲洗柱子（基线
平稳），然后用不同 pH 值及不同盐浓度的洗脱缓冲
液进行洗脱，收集洗脱组分，检测。洗脱步聚为 ：
先用 pH 为 6.5、6.0、5.5 的 50 mmol/L PBS 条件进行
洗脱，选出最佳 pH 值，然后在此 pH 上加入不同浓
度盐进行洗脱优化。
1.2.3 HPLC 测定抗 TNF-α 单克隆抗体浓度 用 0.1
mol/L 磷酸缓冲液以 2 mL/min 流速平衡 HPLC 系统
15 min 至基线平稳，于系统程序中设置标准曲线法
程 序。 进 样 25 μL 于 进 样 器， 以 2 mL/min 流 速 洗
脱，记录所检测的标准品对应浓度的峰面积和样品
峰面积，计算样品浓度。计算公式 ：Ci=Ai/As*Cs，
Ci ：测定样品浓度（ mg/mL）；Cs ：标准品浓度（
mg/mL）；Ai ：供试品峰面积 ；As ：标准品峰面积。
溶液抗体含量公式 ：M=Ci*V，M 为溶液抗体含量
（mg）；V 为溶液体积（mL）。
1.2.4 毛细管电泳系统测定抗 TNF-α 单克隆抗体纯
度 毛细管电泳系统分别用 1 mol/L NaOH 洗 5 min、
水洗 5 min 及分离缓冲液洗 10 min 。每次进样前，
分别用 0.1 mol/L NaOH 及分离缓冲液洗 1 min 后即
可进样。
1.2.5 HPLC 测定多聚体含量 取 25 μL 样品加缓冲
液 1 mL 稀释，上样 10 μL，流速 0.5 mL/min ；检测
波长为 280 nm。
2 结果
2.1 亲和层析优化及鉴定
在前期预实验中，保留时间、电导及缓冲液对
纯化效果的影响不大，不是关键参数。只有 pH 的影
响较大，是关键性参数，所以在实验中针对 pH 进
行一定的优化。表 1 中，此亲和填料的上样载量为
20 mg/mL，样品经离心过滤处理后无需调节直接上
样，实验了不同的洗脱 pH 值 3.4、3.6、3.8、4.0 及
4.2，结果表明，除 pH4.2，回收率无显著差别，而
pH4.0 时纯度与多聚体最佳，达到了 95.3% 及 2.0%。
选取 pH4.0 作为亲和层析的洗脱条件（图 1-3）。
2.2 阳离子层析优化及鉴定
对阳离子 Source 30 的两个洗脱参数（洗脱 pH、
洗脱盐浓度）进行 DoE 设计优化，两个参数设计区
2015,31(12) 77杨辉等：两步串联层析法纯化抗 TNF-α单克隆抗体
间分别洗脱 pH（5.5-6.5）以及洗脱盐浓度（0.05-
0.15 mol/L NaCl），利用 GE avant 25 自带的 DoE 程序
进行实验设计，采用的中心复合表面设计（Central
Composite Face，CCF），共 11 个实验（包含 3 个中
心点），并对结果进行 DoE 分析。对回收率、纯度
及多聚体来说，模型拟合参数 R2 分别为 0.930、0.931
以及 0.954，表明数据与拟合模型的拟合度很高。图
4 表示二因素影响关于回收率、纯度、多聚体的等
高线图。最佳的条件是需要满足纯度高、多聚体含
量低，而且回收率尽量高。DoE 的优势之一在于 ：
通过拟合模型以及制定的因变量范围，预测自变量
取值区间。为达到参比制剂质量水平（纯度 97% 以上，
回收率 90% 以上，多聚体 0.3 以下），合适的条件
范围为 0.05-0.13 mol/L NaCl 以及 pH5.7-6.0。 可以
选定 pH6.0 与 0.10 mol/L NaCl 作为 Source 30 的洗脱
条件（表 2），图 6 与图 7 是实验 10 的结果，实验
10 的质量与参比制剂基本一致，且回收率有 94.3%，
回收率相对较高（图 5）。
3 讨论
随着多种“重磅炸弹”治疗性单抗专利到期，
越来越多的生物药公司加入到单克隆抗体药物的仿
制大军之中。目前，约 70%-80% 的抗体纯化使用
了 protein A、protein G 亲和层析，因为该法可一步
从细胞培养上清液中几乎完全纯化抗体，绝大多数
的药厂都采用亲和层析作为捕获层析，有研究表明
protein A 一步亲和层析纯度能达 90%-95%［8-17］。实
验中对 protein A 填料的不同洗脱 pH 值进行了优化，
得到 pH4.0 时为最佳。此时回收率为 98.5%，非还
原纯度为 95.3%，多聚体含量为 2.0%。
由于上游发酵工艺的控制，电荷异质性已达
到参比制剂的水平，所以无需进一步在下游纯化
工艺上进一步优化。而宿主蛋白（Host cell protein，
HCP）、DNA 经过两步层析已达到参比制剂的水平（数
据末在文中列出）。另外，在亲和层析后有一步病毒
灭活以及在阳离子之后有一步病毒的过滤（未在文
中表述），经过这些措施后病毒去除已达法规要求。
阳离子层析是纯化过程中常用的一种层析技术，它
的原理主要是抗体与杂质基于不同带电性质与带电
量差异进行分离，与配基所带电荷相反的物质被结
表 1 亲和层析纯化数据表
上样量（mg/mL） 洗脱 pH 回收率 /% 纯度 /% 多聚体 /%
20 3.4 99.8 85.9 7.3
20 3.6 99.3 90.3 6.3
20 3.8 99.1 92.4 3.1
20 4.0 98.5 95.3 2.0
20 4.2 85.9 95.9 1.9
4000
3500
3000
2500
2000
1500੨᭦٬mAU
1000
500
0
0 20 40 60 80փ〟/mLI
II
III
100 120 140 160 180
Ⅰ ：Breakthrough peak ；Ⅱ ：Objective peak ；Ⅲ ：Regeneration peak
图 1 protein A 在洗脱 pH4.0 纯化色谱图
੨᭦٬mAU 200150
I
I
III
II
100
50
0
0 5 1510 20 25ᰦ䰤/min
Ⅰ ：Aggregation peak ；Ⅱ ：Monomer peak ；Ⅲ ：Solvent peak
图 2 protein A 在洗脱 pH4.0 纯化样品多聚体检测图੨᭦٬AU
0.005
0.015
0.025
0.035
0.040
0.030
0.020
0.010
0.000
10 11 12 1314 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
I
IIIII
27 28 29 30 31ᰦ䰤/min
Ⅰ ：Glycosylated antibody ；Ⅱ ：Two heavy chain and one light chain ；Ⅲ ：light
chain
图 3 亲和层析在洗脱 pH4.0 纯化样品非还原纯度图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1278
合，相同的电荷不结合。而盐与抗体则是竞争性的
结合配基，盐浓度越大，结合力越大，意味着抗体
越容易被洗脱［18-20］。决定离子层析的纯化效果的一
个很重要的因素就是分辨率，而分辨率受多种因素
的影响，包括填料粒径、配基、孔径和缓冲液环境
等，其中粒径对分辨率的影响很显著，粒径越小，
表 2 阳离子 Source DoE CCF 实验设计参数与结果
实验 上样量 /（mg·mL-1） 洗脱 pH 洗脱盐浓度 回收率 /% 纯度 /% 多聚体 /%
1 30 5.5 50 mmol/L PBS+0.05 mol/L NaCl 70.0 95.9 0.7
2 30 5.5 50 mmol/L PBS+0.15 mol/L NaCl 92.1 96.1 1.0
3 30 6.5 50 mmol/L PBS+0.05 mol/L NaCl 96.1 95.9 1.1
4 30 6.5 50 mmol/L PBS+0.15 mol/L NaCl 96.3 95.3 1.3
5 30 6 50 mmol/L PBS+0.05 mol/L NaCl 94.6 97.1 0.5
6 30 6 50 mmol/L PBS+0.15 mol/L NaCl 95.8 96.3 0.3
7 30 5.5 50 mmol/L PBS+0.10 mol/L NaCl 85.3 96.7 0.8
8 30 6.5 50 mmol/L PBS+0.10 mol/L NaCl 96.4 95.6 1.2
9 30 6.0 50 mmol/L PBS+0.10 mol/L NaCl 94.8 97.5 0.3
10 30 6.0 50 mmol/L PBS+0.10 mol/L NaCl 94.3 97.3 0.3
11 30 6.0 50 mmol/L PBS+0.10 mol/L NaCl 94.5 97.7 0.3
5.5
0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
5.6
5.7
5.8
5.9
Eu
rli
on
p
H
6.0
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
എ᭦⦷/recovery
Eution Nacl
A 㓟ᓖ/purity
Eution Nacl
5.5
0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
5.6
5.7
5.8
5.9
Eu
rli
on
p
H
6.0
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5B
ཊ㚊փ/aggregate
Eution Nacl
5.5
0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
5.6
5.7
5.8
5.9
Eu
rli
on
p
H
6.0
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
C
A ：Recovery contour map ；B ：Purity contour map ；C ：the aggregate contour map，红色表示高值，蓝色表示低值，红色向蓝色变化表示值越来越小
图 4 DoE CCF 设计等高线图
2400
2100
1800
1500
1200੨᭦٬/mAU 900
600
300
0
0 20 40 60 80փ〟/mL II III
I
100 120 140 160 180
Ⅰ ：Objective peak ；Ⅱ ：Impurity peak ；Ⅲ ：Regeneration peak
图 5 实验 10 纯化色谱图
੨᭦٬/mAU
0
50
100
150
200
10 20 251550 ᰦ䰤/min
ṧ૱৲∄ࡦࡲ
图 6 实验 10 洗脱样品多聚体图
分辨率越高，选取 GE 制备性填料中粒径最小的阳
离 子 填 料 Source30， 接 在 亲 和 填 料 protein A 之 后
进一步优化，它的粒径为 30 μm，且其基质为复合
物聚苯乙烯 / 二乙烯苯，可以耐受很高压力，适合
工业放大。多聚体的形成机理复杂且种类较多，根
据不同的分类方式有可逆的多聚体及不可逆的多聚
2015,31(12) 79杨辉等：两步串联层析法纯化抗 TNF-α单克隆抗体
体 ；也可以分为二聚体、三聚体及多聚体等等 ；多
聚体是由单体聚合产生，它的形成相对于单体而言
在电荷及分子大小上发生了改变，本研究选用的阳
离子 Source30 基于抗体电荷差异来分离单体与多聚
体 ；同时由于 Source30 粒径越小，填料的分子筛效
应越明显，通过分子量差异分离的效果也就更明显。
DoE 分为很多类型，有全因子设计、中心复合序贯
设计（CCC）、中心复合设计（CCI）、中心复合表
面设计（Central composite face，CCF），Box-behnken
设计等等，本实验采用的是 CCF 设计，探讨了洗脱
pH 值及盐浓度对纯化的影响，通过阳离子 Source
DoE 优化，为达到参比制剂质量水平（纯度 97% 以
上，回收率 90% 以上，多聚体 0.3 以下），筛选出最
佳条件范围为 0.05-0.13 mol/L NaCl 以及 pH5.7-6.0，
选定 pH6.0 与 0.10 mol/L NaCl 作为 Source 洗脱条件。
此时回收率 94.3%，纯度 97.3%，多聚体 0.3%，其
质量与参比制剂接近。本研究中建立的采用 protein
A 串联阳离子 Source30 两步层析法纯化抗 TNF-α 单
克隆抗体，有回收率高、纯度高的特点，为其进一
步的工业放大提供了实验依据。
4 结论
通过优化，亲和层析的最佳洗脱条件为 pH4.0。
第二步的阳离子填料 Source30 的筛选出最佳洗脱范
围为 0.05-0.13 mol/L NaCl 及 pH5.7-6.0，选定 pH6.0
与 0.10 mol/L NaCl 作为 Source 洗脱条件，此时回收
率 94.3%，纯度 97.3%，多聚体 0.3%。
参 考 文 献
［1］Tsuji S, Higashiyama M, Inaoka M, et al. Effects of adalimumab
੨᭦٬/AU
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
ṧ૱৲∄ࡦࡲ
0.030
0.040
0.035
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31ᰦ䰤/min
图 7 实验 10 洗脱样品非还原纯度图
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（责任编辑 马鑫）