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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
收稿日期 ：2012-08-08
基金项目 ：中央级公益性科研院所基本科研业务专项（ITBB110303）, 现代农业产业技术体系建设专项资金（nycytx-24）
作者简介 ：王洪星，男，助理工程师，硕士，研究方向 ：分子植物病理学 ; E-mail ：hxingw@163.com
通讯作者 ：刘志昕，博士生导师，研究方向 ：植物分子病毒学 ; E-mail: itbblzx@yahoo.com.cn
甘蔗是最重要的糖料作物和最具潜力的能源作
物，甘蔗栽培中大多以种茎作为繁殖材料和种质交
流材料［1］，因此容易造成病毒病的逐代积累和远
距离传播。世界上报道的甘蔗病毒病害有 13 种之
多［2-4］，在甘蔗病毒病中流行范围最广，且对产量
和品质影响最大的是甘蔗花叶病［5，6］。甘蔗花叶病
高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清制备
王洪星  龚殿  孙玉娟  张雨良  王健华  刘志昕
（中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口 571101）
摘 要 ： 高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）是世界上分布最广的侵染甘蔗的病毒之一，引起甘蔗花叶病，对甘
蔗产业危害很大。根据 SrMV 外壳蛋白（coat protein，CP）基因序列合成一对引物，以海南（SrMV-HN）染病植株总 RNA 为材料，
采用 RT-PCR 方法克隆了长约 987 bp 的目的片段。将 CP 基因与质粒 pET32a（+）连接，构建了含 SrMV CP 基因的融合蛋白原核
表达载体 pET32a-SrMVCP。然后用正确的重组质粒转化大肠杆菌 Rosetta（DE3），经 IPTG 诱导后，SDS-PAGE 检测出一条约 36
kD 的特异融合蛋白表达谱带。融合蛋白主要以可溶性蛋白形式稳定表达。通过优化诱导条件，确立了 CP 基因表达的最佳条件 ：
IPTG 终浓度为 0.1 mmol/L，诱导时间为 4 h，诱导温度为 30℃。用 Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白，免疫家兔制备出抗血
清。通过酶联法（ID-ELISA）测定本试验制备的 SrMV CP 抗血清工作浓度为 1∶1 000，Western blotting 检测结果表明，抗血清与
SrMV-HN 诱导表达的 CP 蛋白发生特异性反应。对田间 25 个甘蔗样品进行检测，结果表明该抗血清的效价高、灵敏度高、特异性强，
可以应用于田间样品的检测。
关键词 ： 高粱花叶病毒 外壳蛋白 原核表达 抗血清
Prokaryotic Expression of CP Gene of Sorghum mosaic virus and
Preparation of Polyclonal Antibody
Wang Hongxing Gong Dian Sun Yujuan Zhang Yuliang Wang Jianhua Liu Zhixin
（Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，P.R. China，Institute of Tropical Bioscience and
Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Haikou 571101）
Abstract:  Sugarcane mosaic disease caused by Sorghum mosaic virus（SrMV）is now recognized as one of the most widely distributed
viral diseases of Saccharum. It is an important limiting factor for sugarcane production. According to the sequence of coat protein（CP）gene of
SrMV, two primers were designed, and a DNA fragment about 987 bp was amplified by RT-PCR. The PCR product, after digested with restriction
enzymes, was inserted into prokaryotic expression vector pET32a and the recombinant plasmid pET32a-SrMVCP was transferred into E.coli
Rosetta（DE3）. Induction with IPTG, recombinant protein was got and SDS-PAGE analysis and western blot showed that CP was expressed
steadily in soluble proteins. With addition of IPTG up to 0.1 mmol/L and culturing for 4 h more in 37℃ is thought to be the best inducing
conditions to express CP. The fusion protein was then purified with Ni2+-NTA agarose affinity chromatography, and used to immune rabbits for
antiserum preparation. The optimal titer of the antiserum was determined to be 1∶1 000 tested by indirect enzyme-linked immunosorbent assay
（ID-ELISA）. Western blotting confirmed that the antiserum reacted strongly and specifically to the CP of SrMV-HN field sugarcane samples
were detected using the antiserum by a methed of ID-ELISA.
Key words:  Sorghum mosaic virus Coat protein Prokaryotic expression Antiserum
2013年第1期 167王洪星等 ：高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清制备
毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）是引起甘蔗花叶
病的一种重要病原，自然界中可由多种蚜虫以非持
久方式传播，易机械接种，自然寄主仅限于禾本科
植物，在自然条件下只危害高粱和甘蔗［7，8］。SrMV
是 马 铃 薯 Y 病 毒 属（Potyvirus） 的 成 员［9］， 编 码
346-350 kD 蛋白质的单个开放阅读框，产物为一聚
合蛋白，自身编码的蛋白酶将多聚蛋白加工成 10 个
成熟蛋白［10］。目前还未见 SrMV CP 基因的原核表达、
抗血清制备的相关报道。本研究以 SrMV-HN 分离
物染病植株总 RNA 为材料，采用 RT-PCR 方法克隆
CP 基因编码区，插入到 pET32a 原核表达载体，转
化大肠杆菌表达宿主菌 Rosetta（DE3），拟实现 CP
基因的原核表达，并制备高效特异性抗血清，旨在
为建立 SrMV 检测体系进行田间样品检测打下了良
好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
甘蔗花叶病病样及原核表达载体 pET-32a 由
本实验室保存。限制性内切酶、DNA 分子量标记
（DL2000）、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、PCR
回收试剂盒等均购自大连宝生物工程公司。E.coli
DH5α、Rosetta（DE3）菌株由本实验室保存。透析
袋购自 Sigma 公司。IPTG 购自 Promega 公司。低分
子 量 蛋 白 Marker 购 自 Promega 公 司 ；BCIP/NBT 底
物显色试剂盒、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰
胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）均购自 Solarbio 公司；
十二烷基磺酸钠（SDS）、甘氨酸、考马斯亮蓝 R-250
均购自 Amresco 公司 ；其他化学试剂均为国产分析
纯。His-Tag 单 克 隆 抗 体 购 自 Novagen 公 司 ；Goat
Anti-Mouse IgG（H&L）-AP 购自北京康为世纪生物
科技有限公司 ；其他生化试剂及普通化学试剂均为
进口或国产生化级或分析级试剂。
1.2 方法
1.2.1 重组原核表达载体 pET32a-SrMV CP 的构建
根据 SrMV 相关基因序列（GenBank 登录号 ：AJ310-
197.1），基因位置 ：8424-9389。综合考虑酶切位点
引物设计的各项原则，设计引物。SrMV-CP 引物对
所选取的酶切位点为 EcoR Ⅰ和 Hind III ；所需寡核
苷酸引物由上海生物工程公司合成。SrMV-CP 引物
序列［13］：
SrMV-CP-F：5- GAAGAATTCGCAGGGGGCGGT-
ACGGT-3，其中下划线部分为 EcoR I 酶切位点，
SrMV-CP-R ：5- GCCAAGCTTTCAGTGGTGCTG-
TTGC-3，其中下划线部分为 Hind III 酶切位点。方
框部分表示与模板相同或互补配对的序列。
以甘蔗花叶病病样的总 cDNA 为模板，SrMV-
CP-F 和 SrMV- CP-R 为引物，进行 PCR 反应 ：94℃
预变性 3 min ；94℃变性 30 s，55℃ 退火 30 s ，72℃
延伸 1 min，35 个循环 ；72℃终止补偿延伸 10 min。
取适量 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的
回收并纯化。PCR 产物纯化采用 TIANGEN 琼脂糖
凝胶 DNA 回收试剂盒（天根生物技术有限公司），
具体操作过程参照试剂说明书进行。回收 PCR 产物
用 T-A 克隆方法克隆到质粒 pMD 19-T simple vector
（TaKaRa 公司）中，转化到大肠杆菌 DH5α。经菌液
PCR 和质粒双酶切（EcoR I/Hind III）鉴定后，阳性
克隆送上海英俊生物技术有限公司测序，获得目的
基因重组克隆质粒 pMD 19T-SrMVCP。
分 别 用 EcoR I/Hind III 在 37℃ 水 浴 中 过 夜 双
酶 切 重 组 克 隆 质 粒 pMD 19T-SrMVCP 和 表 达 载
体 pET32a（+）， 回 收 具 有 黏 性 末 端 的 CP 片 段 和
pET32a（+），16℃水浴连接过夜，将回收的目的基
因 CP 片段连接到 pET32a（+）上，构建重组表达质
粒。连接产物转化到大肠菌 Rosetta（DE3）感受态
细胞，经菌液 PCR 鉴定和 EcoR I/Hind III 质粒双酶
切鉴定后，选择阳性单克隆测序，获得重组表达质
粒 pET32a-SrMVCP。
1.2.2 融 合 蛋 白 的 诱 导 表 达 和 可 溶 性 分 析 以
1∶100 的接种量，将转化进重组子 pET32a-SrMVCP
的大肠杆菌 Rosetta（DE3），接种于 50 mL LB 液体
培养基（含氨苄青霉素 100 μg/mL）中，37℃摇床振
荡培养。OD600 值达到 0.5-0.6 时，加入终浓度为 0.1
mmol/L 的 IPTG，转到 30℃继续培养 3-6 h。
取 1 mL 诱导表达的菌液加入 2 mL 离心管中，
12 000 r/min 离心 1 min，弃上清，沉淀用 50 μL 双蒸
水悬浮，再加入 50 μL 的 2×SDS-PAGE 上样缓冲液
混匀，沸水浴煮 5 min 后放置在冰上 2 min。在 4℃
条件下，12 000 r/min 离心 1 min，取上清 10 μL 上样，
进行 SDS-PAGE 电泳。电泳结束后，凝胶经考马斯
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期168
亮蓝 R-250 染色，分析融合蛋白的表达情况。收集
经诱导培养 4 h 的菌液样品，采用超声波破碎菌体
细胞，离心后分别取 1 mL 上清液和沉淀按上述方法
进行 SDS-PAGE 电泳，对融合蛋白进行可溶性分析。
1.2.3 融合蛋白的纯化 扩大培养重组表达菌 1 L，
按上述条件诱导表达 4 h。于 4℃ 6 000 r/min 离心 30
min，菌体沉淀溶于 50 mL Binding buffer 中，冰浴
放置 30 min。经超声波破碎仪破碎细胞，冰浴放置
30 min，4℃ 12 000×g 离心 30 min，上清过 0.45 μm
滤膜并通过 Ni2+-NTA 亲和层析柱进行纯化 ：用 6
mL 灭菌水洗涤琼脂糖树脂 2 次后，以 6 mL Binding
Buffer 平衡亲和柱。上柱后用 6 mL Washing Buffer（500
mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-
HCl，pH 8.0）洗脱杂蛋白，再以 6 mL Elution Buffer（500
mmol/L NaCl，0.5 mol/L imidazole，20 mmol/L Tris-
HCl，pH8.0）洗脱融合蛋白。纯化后蛋白用透析袋
经 100 mL 1×PBS 透析 3 次即为纯化蛋白。
1.2.4 抗血清制备及血清学检测 纯化的融合蛋白
溶液经过透析袋透析获得溶于 1×PBS 的蛋白溶液。
BCA 法测定其浓度，与佐剂（1∶1）混匀，采用皮
下多点注射抗原的方法免疫 2 只大白兔［10］，每只
总注射量为 2.0 mg，分 3 次免疫，每次间隔 7-10 d，
第 3 次免疫 10 d 后，每只白兔耳缘静脉取血 0.5-
1.0 mL，分离抗血清。以 1×PBS 的蛋白溶液作抗
原，ID-ELISA 检测抗血清效价，血清效价未符合
要求则继续免疫。血清效价符合要求后，心脏采
血，分离抗血清，抗血清效价和工作浓度分别以提
纯的 CP 蛋白和感病的甘蔗叶片汁液为抗原进行 ID-
ELISA 测定。
1.2.5 抗血清特异性鉴定 诱导表达后的菌体，进
行 SDS-PAGE 凝胶电泳。用蒸馏水漂洗电泳后的凝
胶，转入电转液中平衡 10 min。利用电转膜方法，
以 100 V，60 mA 转 移 1 h 后， 取 出 NC 膜 在 蒸 馏
水中漂洗。将 NC 膜置于 TBST 缓冲液［20 mmol/L
Tris-HCl（pH7.5），150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-
20］配制的 5% 脱脂牛奶封闭液中 4℃封闭过夜。封
闭完成后，用 TBST 缓冲液漂洗 NC 膜后，将其转入
按 1∶1 000 稀释的一抗 TBST 溶液，在 37℃下，孵
育 40 min。取出 NC 膜，用 TBST 漂洗后，转入按
1∶30 000 稀释的碱性磷酸标记的山羊抗兔（IgG）
TBST 溶 液 中，37 ℃ 孵 育 40 min。 取 出 NC 膜， 经
TBST 漂洗后，在 NC 膜蛋白面滴加含有 330 μg/mL
NBT（0.5 g NBT 溶于 10 mL 70% 的二甲基甲酰胺中）
和 165 μg/mL BCIP（0.5 g BCIP 溶于 10 mL 100% 的
二甲基甲酰胺中）的显色液，直到条带清晰后，用
蒸馏水漂洗两次，终止显色反应。取出 NC 膜晾干
后进行扫描分析
1.2.6 田间样品检测 从海南各市县采集到 25 株疑
似甘蔗花叶病样品进行 ID-ELISA 检测，健康组培苗
作阴性对照，抗血清的工作浓度为 1∶1 000 ；同时
通过 RT-PCR 方法进行验证。
2 结果
2.1 CP基因克隆和表达质粒的构建
用 PCR 方法从病样总 cDNA 中扩增获得的 CP
基因片段，经 1% 琼脂糖凝胶电泳后，扩增片段大
小约为 987 bp（图 1）。表达重组质粒 pET32a-CP 经
EcoR I/Hind III 双酶切验证，出现特异性 DNA 条带，
其大小约为 987 bp（图 2），从而进一步证明已成功
构建了重组表达质粒 pET32a-CP。
M: DL 2000; 1: CP 基因 PCR 扩增产物
图 1 PCR 扩增产物
M ：DL 2000 ；1 ：pET32a 空质粒 ; 2 ：重组质粒 pET32a-CP; 3 ：EcoR I/Hind
Ⅲ双酶切 ；4 ：EcoR I 单酶切 ；5 ：Hind Ⅲ单酶切
图 2 重组质粒 pET32a-CP 酶切鉴定
2000
bp
M 1
1000
750
250
500
100
2000
bp
M 1 2 3 4 5 M
1000
750
2013年第1期 169王洪星等 ：高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清制备
2.2 CP基因的诱导表达及可溶性分析
分别在 37℃、25℃和 IPTG 终浓度 0.1 mmol/mL
条 件 下， 诱 导 表 达 pET32a-CP 重 组 表 达 菌 Rosetta
（DE3）。取 1 mL 菌液样品进行 SDS-PAGE 电泳分析，
重组质粒表达量在 Rosetta（DE3）菌（图 3-A）中
远高于 BL21（DE3）（图 3-B），因此采用在 Rosetta
（DE3）菌中表达。在 Rosetta（DE3）菌中约 53 kD
处有一明显区别的条带，其大小与预估的融合蛋白
大小符合。剩余菌液经细胞破碎仪破碎细胞后，分
别取上清与沉淀进行 SDS-PAGE 电泳分析（图 4）融
合蛋白的表达产物主要以可溶性的形式存在。同时
对诱导条件的优化发现，IPTG 终浓度 0.1-1 mmol/L、
诱导温度 25-37℃、诱导时间 1-6 h 范围内，均可稳
定表达 ；IPTG 终浓度、诱导温度、诱导时间、不是
其表达的决定因素。根据优化条件确立了 CP 基因
2.4 抗血清的制备和效价测定
在注射抗原蛋白到白兔前，用 ID-ELISA 对白兔
进行免疫前血清本底水平检测，结果显示，试验所
选用的家兔血清本底比较低，符合试验要求。将纯
化获得的融合蛋白作为免疫原，第一次与完全佐剂
等比例混匀，第 2、3 次与不完全佐剂等比例混匀，
采用肌肉与皮下注射相结合免疫家兔。3 次注射后
采集血清，以融合蛋白溶液和感病的甘蔗叶片汁液
图 3 pET32a-CP 在不同宿主菌中表达产物的
SDS-PAGE 分析
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：Rosetta（DE3 pET-32a）于 30℃诱导 4 h ；2 ：
Rosetta（DE3 pET-32a-CP）未诱导 ；3 ：Rosetta（DE3 pET-32a-CP）于 30℃
诱导 4 h ；4 ：BL21（DE3 pET32a-CP）于 30℃诱导 4 h 沉淀 ；5 ：Rosetta（DE3
pET-32a-CP）于 30℃诱导 4 h 上清 ；6 ：纯化融合蛋白
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：空载体 ；2 ：未诱导 ；3 ：37℃诱导 ；4 ：25℃诱
导 ；5 ：未诱导 ；6 ：37℃诱导 ；7 ：25℃诱导
图 4 pET32a-CP 重组菌表达产物的可溶性分析
表达的最佳条件 ：IPTG 终浓度为 0.1 mmol/L，诱导
时间为 4 h，诱导温度为 30℃。
2.3 融合蛋白的纯化
在 30℃，IPTG 终浓度 0.1 mmol/mL 条件下，对
重组表达菌进行诱导培养 4 h。获得的融合蛋白含有
相对较多的可溶性蛋白，但同时也有一部分是包涵
体蛋白。为了尽量保证融合蛋白 CP 的生物活性和
简便操作过程，选择了上清进行可溶性蛋白纯化。
Ni2+-NTA 亲 和 层 析 纯 化 中， 杂 蛋 白 经 100 mmol/L
咪唑浓度的 washing buffer 洗脱后，与亲和层析柱
Ni2+ 螯合的目的蛋白纯度已达要求。最终，用 500
mmol/L 咪唑浓度的 washing buffer 将融合蛋白溶于其
中（图 5）。
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：重悬液 ；2 ：穿透液 ；3 ：平衡液 ；4-9 ：洗
脱液咪唑浓度依次为 20、50、100、150、200 及 500 mmol/L
图 5 pET32a-CP 重组菌表达产物 SDS-PAGE
检测及目的蛋白纯化
图 6 pET32a-CP 重组菌表达产物的可溶性分析
94
62
40
kD
M 1 2 3 4 M 5 6 7
A B
62
kD
M 1 2 3 4 5 6
94
kD
M
62
40
6 7 8 954321
Infected leaf
Health leaf
Blank
2
5
1
5
0
1/10 1/100 1/1000 1/10000 1/100000 1/1000000
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40
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期170
3 讨论
制备高质量的抗血清对抗原的质量要求非常高，
提取甘蔗中的 SrMV 病毒存在一定的困难。甘蔗体
内含有较多的多糖和酚类物质，会影响病毒提纯的
样品
稀释浓度
1∶10 1∶100 1∶1000 1∶10 000 1∶100 000 1∶1 000 000
染病叶片 1.793 1.15 0.46 0.166 0.094 0.08
健康叶片 0.433 0.185 0.125 0.08 0.069 0.075
Blank 0.04 0.038 0.045 0.043 0.038 0.038
OD 阳 /OD 阴 4.1 6.2 3.6 2.07 1.3 1
M: 蛋白质分子量标准；1：pET32a-CP/Rosetta（DE3）经 IPTG 诱导 3 h;
2 ：未经诱导 pET32a/Rosetta（DE3）
图 6 表达产物 CP 蛋白 Western Blot 检测
染病叶片作为阳性对照 ；健康叶片 1 ：100 倍稀释作为阴性对照 ；Blank 为包被液，作为空白对照 ；检测结果标准 ：OD 阳 /OD 阴＞ 2.1，且 OD 值＞ 0.1
为抗原进行 ID-ELISA 测定抗血清效价和工作浓度。
结果（表 1）表明，当以提纯的 CP 蛋白作抗原时，
抗血清稀释 104 倍仍明显呈阳性反应 ；当以发病甘
蔗叶片汁液为抗原时，抗血清在稀释 103 倍仍呈阳
性反应，抗血清的工作浓度为 1∶1 000。
2.5 抗血清特异性鉴定
经 Western blotting 分 析， 结 果（ 图 6） 显 示，
兔抗 CP 抗血清仅与诱导表达菌 SDS-PAGE 凝胶 53
kD 条带处有反应，与其他条带均无反应。从而证明，
抗血清能与纯化后融合蛋白起特异性反应。
2.6 田间样品检测
用所制备的抗血清进行了甘蔗花叶病样品检
测，结果（表 2）显示，该抗血清测得结果基本与
PCR 检测结果相符合，说明该抗血清较好的用于甘
蔗组培苗的检测。
编号
OD405 读数 阳性（＋）、
阴性（－）
PCR 结果 编号
OD405 读数 阳性（＋）、
阴性（－）
PCR 结果
读数 I 读数 II 读数 I 读数 II
blank 0.101 0.149 - —— 12 1.494 1.731 + +
CK- 0.307 0.337 - - 13 0.218 0.293 - -
CK+ 2.974 2.811 + + 14 0.458 0.505 - -
1 0.223 0.228 - - 15 0.305 0.391 - -
2 0.222 0.301 - - 16 0.349 0.408 - -
3 0.377 0.492 - - 17 1.845 2.061 + +
4 0.214 0.293 - - 18 0.851 0.878 + +
5 0.277 0.341 - - 19 0.309 0.380 - -
6 0.446 0.483 - - 20 0.684 0.749 + +
7 0.372 0.461 - - 21 0.346 0.437 - -
8 0.257 0.364 - - 22 2.816 2.943 + +
9 1.037 1.193 + + 23 1.382 1.521 + +
10 0.286 0.339 - - 24 1.816 2.012 + +
11 0.608 0.638 + + 25 0.285 0.367 - -
表 1 不同稀释度的抗血清与病样的 ELISA 结果的 OD 值
表 2 甘蔗疑似样品 ID-ELISA 检测结果
效率 ；病毒粒子提纯过程复杂繁琐，需要专门的大
型仪器设备（如超、高速离心机，透射电镜），费时、
费资、费力。这些大大限制了这类病毒的抗血清的
制备。利用提纯的病毒制备的抗血清，由于提纯条
94
kD
62
40
1 2 M
2013年第1期 171王洪星等 ：高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清制备
件和纯化技术的客观限制，其中难免会含有某些寄
主蛋白抗体，这很容易在后续的血清学反应中造成
假阳性反应。而用改造好的工程菌来表达病毒的目
的蛋白，得到的抗原量不但较多，而且其中不含寄
主植物蛋白的成分，由此制备的抗血清会有较好的
专化性，不容易出现假阳性。余乃通等［14，15］用香
蕉束顶病毒海口分离物核穿梭蛋白（NSP）、CP 制得
香蕉束顶病毒抗血清 ；李向东等［16］将 SCMV-CP 基
因克隆到表达载体 pET22b（+），Adv Virus Res，制
备了专化性强、效价高的抗血清。
4 结论
本研究获得了高粱花叶病毒膜蛋白基因序列，
用原核表达载体表达 CP 基因的全长蛋白，从而用
pET32a（+）原核表达载体成功构建了 CP 基因表达
质粒。在诱导表达中，表达量很高，且主要以可溶性
蛋白存在。同时优化反应条件发现，IPTG 终浓度、
诱导温度、诱导时间，不是其表达的决定因素。本
试验在低温条件下诱导表达，将获得的可溶性融合
蛋白进行纯化，获得大量可溶性蛋白，制备了专化
性很强的抗血清。
参考文献
［1］ 周国辉 , 许东林 , 蔡艳清 , 等 . 我国南方甘蔗病毒种类初步鉴
定［J］. 广西农业生物科学 , 2006, 25（3）：226-228.
［2］ Viswanathan R, Balamuralikrishnan M, Karuppaiah R. Characteriza-
tion and genetic diversity of sugarcane streak mosaic virus causing
mosaic in sugarcane［J］. Virus Genes, 2008（36）：553-564.
［3］ Viswanathan R, Balamuralikrishnan M, Karuppaiah R. Duplexreverse
transcription polymerase chain reaction（D-RT-PCR）-a technique
for the simultaneous detection of viruses causing sugarcane mosaic
［J］. Sugar Tech, 2008, 10（1）：81-86.
［4］ Grisham MP, Johnson RM, Zimba PV, et a1. Detecting Sugarcane
yellow leaf virus infection in asymptomatic leaves with hyperspectral
remote sensing and associated leaf pigment changes［J］. Virol
Methods, 2010, 167（2）：140-145.
［5］ 王建南 , 许莉萍 , 陈如凯 . 甘蔗褪绿线条病致病机理研究初
报［J］. 甘蔗 , 1995, 2（4）：10-13.
［6］ 王洪星 , 张雨良 , 刘志昕 , 等 . 应用多重 RT-PCR 检测甘蔗黄
叶病毒和高粱花叶病毒［J］, 广东农业科学 , 2011, 38（10）：
128-131.
［7］ Shukla DD, Frenkle MJ, Mckern NM. Present status of sugarcane
mosaic subgroup ofotyviruses［J］. Archive of Virology, 1992（l5）：
363-373.
［8］ Shukla DD, Ward CW. Structure of potyvirus coat proteins and its
application in the taxonomy of the potyvirus group［J］. Adv Virus
Res, 1989, 36 ：273-314.
［9］ Van Regenmorte MHV, Fauquet CM, Bishop DHL, et al. Virus Taxo-
nomy［M］. Seventh Report of the International Committee on Taxo-
nomy of Viruses. New York ：Academic Press, 2000 ：691-701.
［10］ Chen J, Chcn J, Adams MJ. Characterization of potyviruses from
sugarcane and maize in China［J］. Archives of Virology, 2002,
147（6）：1237-12.
［11］ Harlow E, LanD. Antibodies［M］.1st Edition. New York ：Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1998.
［12］ 张婷婷 , 叶波平 . 包涵体蛋白质的复性研究进展［J］. 药物生
物技术 , 2007, 144 ：306-309.
［13］ 王洪星 , 张雨良 , 刘志昕 , 等 . 以 ScYLV 和 SrMV 为材料进行
常见 PCR 引物优化设计［J］. 中国糖料 , 2012（1）：16-20.
［14］ 余乃通 , 冯团诚 , 刘志昕 , 等 . 香蕉束顶病毒海口分离物核穿
梭蛋白（NSP）的纯化及抗血清制备［J］. 基因组学与应用
生物学 , 2010, 29（2）：375-378.
［15］ 余乃通 , 冯团诚 , 刘志昕 , 等 . 香蕉束顶病毒海口分离物 CP
基因的原核表达、纯化及其抗血清制备［J］. 热带作物学报 ,
2010, 31（5）：767-771.
［16］ 李向东 , 范在丰 , 石鹏君 . 甘蔗花叶病毒 CP 基因的高效表达
和抗血清制备［J］. 生物技术通讯 , 2003, 14（4）：271-273.
（责任编辑 李楠）