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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
双向电泳技术由 O’Farrell［1］于 1975 年首次建
立，并成功分离约 1 000 个 E. coli 蛋白质。双向电
泳是通过两个方向相互垂直的电泳，将样品中的蛋
收稿日期 : 2012-07-06
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30972352）
作者简介 : 张胜 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 苗木快繁技术及植物不定根形成过程中的差异蛋白组学研究 ; E-mail: zhangsheng8630@sina.com
通讯作者 : 赵忠 , 男 , 教授 , 研究方向 : 森林培育理论与技术 ; E-mail: zhaozh@nwsuaf.edu.cn
四倍体刺槐枝条韧皮部总蛋白质双向电泳
体系建立及应用
张胜1 赵忠1，2 刘昭军1 张博勇1，2 宗建伟1 张玲玲 1
（1. 西北农林科技大学林学院，杨陵 712100 ；2. 西北农林科技大学 西部环境与生态教育部重点实验室，杨凌 712100）
摘 要： 采用 TCA/ 丙酮法对四倍体刺槐枝段韧皮部全蛋白质进行提取，通过对 IPG 胶条 pH 梯度、分离胶浓度的选择，上样量、
等电聚焦条件的优化，建立起四倍体刺槐枝段韧皮部蛋白质双向电泳体系。研究结果表明 ：采用 TCA/ 丙酮法提取四倍体刺槐枝段
韧皮部全蛋白质，选用 pH4-7 的 17 cm IPG 胶条，考马斯亮蓝染色上样量 550 μg，等电聚焦 IEF 聚焦总伏小时数从 60 000 Vh 提高
到 80 000 Vh，并采用 12% 的分离胶对四倍体刺槐枝段韧皮部全蛋白进行双向电泳，能得到背景清晰、蛋白质点数相对较多，分离
度高且重复性好的电泳图谱。利用建立的体系进行双向电泳分离蛋白质，能直接挖点送质谱分析。采用该体系分析四倍体刺槐硬
枝扦插生根愈伤组织阶段蛋白质表达差异，共筛选出 83 个差异蛋白质点，其中上调蛋白 15 个，新产生蛋白 22 个，下调蛋白 22 个，
缺失表达 24 个。
关键词 ： 四倍体刺槐 韧皮部 双向电泳 优化方法 差异蛋白质分析
Establishment and Application of Two-dimensional Gel Electrophoresis
for Proteome from the Phloem of Tetraploid Robinia pseudoacacia
Zhang Sheng1 Zhao Zhong1，2 Liu Zhaojun1 Zhang Boyong1，2 Zong Jianwei1 Zhang Lingling1
（1. College of Forestry，Northwest A & F University，Yangling 712100 ； 2. Ministry of Education Key Laboratory of Environment and Ecology
in Western China，Northwest A & F University，Yangling 712100）
Abstract: This paper used the method of TCA/acetone to extract all proteins of phloem in tetraploid Robinia pseudoacacia. A two-
dimensional electrophoresis system for proteomic analysis of tetraploid Robinia pseudoacacia was established by optimizing the parameters
including the pH gradient of IPG strip, the gel concentration, the loading quantity of sample and isoelectric focusing conditions. The results
showed that ：Use the TCA/acetone method to extract all phloem protein of tetraploid Robinia pseudoacacia, choose 17 cm IPG strip with
pH4-7, load protein samples of 550 μg, followed staining with colloidal Coomassie Brilliant Blue and use 12% SDS-PAGE for tetraploid Robinia
pseudoacacia phloem total proteins in two-dimensional electrophoresis while isoelectric focusing IEF hours increased from 60 000 Vh to 80 000
Vh can get a clear background with more protein points, high resolution and good repeatability. Using the established system of two-dimensional
electrophoresis can dug protein points from the gel directly and send them to mass spectrometry. Use this system to analysis differences of
hardwood cuttings rooting callus phase protein expression in tetraploid Robinia pseudoacacia. Filter out 83 differential protein spots, among
which, 15 were higher, 22 were novel, 22 were lower and 24 were lack of expression.
Key words: Tetraploid Robinia pseudoacacia Phloem Two-dimensional electrophoresis Optimization method Differential
expression analysis
白质按照等电点和分子质量的不同而呈点状分离［2］。
双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一［3］，
对双向电泳技术的研究与探索是后续蛋白质组学研
2013年第1期 117张胜等 ：四倍体刺槐枝条韧皮部总蛋白质双向电泳体系建立及应用
究的基础。双向电泳技术流程包括组织蛋白质的提
取、第一向等电聚焦（IEF）、第二向聚丙烯酰胺凝
胶电泳（SDS-PAGE）分离、凝胶染色、凝胶图像扫
描及分析等基本步骤。对于双向凝胶电泳分析来说
样品的制备，胶条、分离胶浓度选择，上样量控制，
等电聚焦条件设置等都影响试验结果。因此，为了
获得最佳的电泳分离效果需要建立一套稳定、高效
的电泳条件组合。
组织蛋白质的提取是双向电泳技术研究的基础。
蛋白质提取的好坏将直接影响 2-D 凝胶图谱质量。
通常影响双向电泳结果的最主要的原因是样品的制
备［4］。植物组织中含较多的非蛋白成分，如多糖、
酚类、色素、脂类、单宁及其它次级代谢物，这些
物质会对双向电泳图谱中蛋白质的分离产生一定的
影响［5］。选择合适的蛋白质提取方式能够有效的去
除杂质、纯化蛋白。TCA/ 丙酮法是一种提取植物总
蛋白质的有效方法［6］，该方法已在小麦花药、叶片
和籽粒［7，8］，番茄叶片［9，10］，大豆叶片［11］、种子［12］，
甘蓝型油菜［13］等众多植物中取得了良好的效果。
由于四倍体刺槐的优良性状［14］，近年来对它的
研究也陆续展开。四倍体刺槐从蛋白组学方面的研
究虽然有过报道但从 2D 图谱上看蛋白质分离效果
并不理想，图谱中有明显的横纵条纹，且背景不清楚、
聚焦不完全。本研究从分离胶浓度、IPG 胶条选择
到上样量、等电聚焦参数等条件进行优化，旨在得
到更为理想的、更便于分析的凝胶图谱。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验样品 供试材料为 3 年生四倍体刺槐根
繁苗萌条，采自西北农林科技大学林学院苗圃。剪
取四倍体刺槐生长健壮的枝段，用蒸馏水清洗后，
刮取韧皮部并用锡箔纸包好放液氮内速冻，-80℃保
存备用。
1.1.2 仪 器 和 试 剂 17 cm IPG 干 胶 条（pH3-10、
pH4-7、 pH5-8）（Bio-Rad），PROTEAN IEF Cell（Bio-
Rad），PROTAIN IEF Cell 型电泳系统（Bio-Rad），Po-
werLook2100XL 扫 描 仪，PDQuest 2DE7.4 分 析 软 件
（Bio-Rad）。药品均为分析纯，药品溶液均使用超纯
水配置。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质的提取与定量
1.2.1.1 蛋白质的提取 四倍体刺槐全蛋白质的提
取方法为三氯乙酸 / 丙酮沉淀法［15］，并加以改进 ：
液氮预冷研钵，取 2 g 四倍体刺槐韧皮部样品，加
入 10% PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）和少量石英砂，
充分研磨。加入 5 倍体积 -20℃预冷的 10% 三氯乙
酸 / 丙酮溶液（含有 0.07 % 的 β-巯基乙醇），涡旋
震荡后 -20℃静置 2 h 以上。4℃，1 100 r/min 离心
30 min，弃上清，沉淀复溶于冷丙酮（含 0.07% 的
β-巯基乙醇），-20℃放置 1 h。4℃，11 000 r/min 离
心 30 min，弃上清，冷丙酮冲洗沉淀，重复 2-3 次；
弃上清后放入通风厨自然挥发丙酮。将制成的干粉
每克加入 2 mL 裂解液［7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，
4% 3-（3-胆胺丙基）］涡旋混匀，置于 30℃水浴 1
h，不时震荡，充分溶解蛋白。常温 11 000 r/min 离
心 30 min，取上清液，定量，-80℃分装保存备用。
1.2.1.2 蛋 白 质 的 定 量 蛋 白 质 定 量 使 用 天 艮
Bradford 蛋白质定量试剂盒，得到标准曲线，利用
标准曲线算出蛋白质大致浓度。
1.2.2 双向电泳分析（2-DE）
1.2.2.1 第一向固相 pH 梯度等电聚焦（IEF）将蛋
白质样品与水化上样缓冲液（含 8 mol/L 尿素，2%
CHAPS，0.001% 溴酚蓝，45 mmol/L DTT，0.2% Bio-
lyte pH3-10）充分混匀。取混合溶液 350 μL，加入
聚焦槽。将 IPG 胶条室温下放置 10 min，胶面朝下，
按正负极放入聚焦槽内，确保无气泡。在胶条上覆
盖一层矿物油（2-3 mL）盖上聚焦槽盖，将聚焦槽
放入 Bio-Rad 等电聚焦仪（PROTEAN IEF Cell，Bio-
Rad Hercules，CA，USA）上。操作方法按照 Bio-Rad
聚焦程序操作手册《2-D Electrophoresis principle and
methods》设定，在第一向程序设定上略作修改（表
1）。在 20℃条件下主动水化 14 h，使胶条充分吸收
蛋白质样品后按程序进行第一向等电聚焦电泳。
1.2.2.2 第二向垂直板电泳（SDS-PAGE） 第一向
等电聚焦结束后，取出含蛋白样品的 IPG 胶条，放
于水化盘中平衡，依次加入 5 mL/gel 平衡液 A［平
衡缓冲母液（6.0 mol/L 尿素，2% SDS，0.375 mol/L
Tris-HCl（pH8.8），20% 甘 油 ）+ 2% DTT（ 现 加 ）］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期118
和 5 mL/gel 平衡液 B［平衡缓冲母液 +2.5% 碘乙酰
胺（现加）］，各平衡 15 min。用 1× 电泳缓冲液稍
冲洗 IPG 胶条后迅速转移至分离胶上端，挤压上端
胶条，排净气泡，使 IPG 胶条与分离胶紧密接触。
用 1% 低熔点琼脂糖凝胶封胶。将 SDS-PAGE 胶架
放入 PROTAIN IEF Cell 型电泳系统（Bio-Rad）中。
加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用低电流（5
ma/gel/17 cm）， 待 样 品 完 全 走 出 IPG 胶 条， 浓 缩
成一条线后，加大电流（20-30 ma/gel/17 cm），待
溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。卸下玻
璃板，取出凝胶，超纯水冲洗 2-3 次后开始凝胶
染色。
1.2.2.3 凝胶染色 本研究采用了两种染色方法对
四倍体刺槐枝段韧皮部全蛋白进行染色。分别用与
质谱兼容的考马斯亮蓝染色和灵敏度高的硝酸银
染色。
硝酸银染色［16］第一步超纯水冲洗凝胶 3 次，
固 定 1 h， 固 定 液（40% 无 水 乙 醇 +10% 冰 乙 酸 +
50% 超纯水）。第二步敏化 30 min，敏化液（17 g 乙
酸钠 +0.5 g 硫代硫酸钠 +75 mL 无水乙醇 + 超纯水至
250 mL）。第三步水洗 3 次 ×10 min。第四步染色，
染色液［0.625 g 碳酸钠 + 超纯水至 250 mL（用时现
加 100 μL 甲醛）］。第五步水洗 2 次 ×1 min。第六
步显色（视凝胶显现效果定）显色液［6.25 g 碳酸
钠 + 超纯水至 250 mL（临用前加入 50 μL 甲醛）］。
第七步终止 10 min，终止液（3.65 g Na2EDTA+ 超纯
水至 250 mL）。第八步水洗 3 次，每次 5 min。
考马斯亮蓝染色参照参考文献［17］稍作改动。
其基本过程为 ：固定（40% 乙醇 +10% 冰乙酸 +50%
纯水）30 min，洗涤 3 次，每次置于摇床上轻摇 10
min，染色盘中加入考马斯亮蓝 G-250 染色液（1.2 g/L
考马斯亮蓝 G-250、100 g/L 硫酸铵、100 g/L 磷酸、
20% 乙醇）摇床摇动过夜。纯水重复脱色直至背景
清楚。
1.2.2.4 凝胶图像分析 用 PowerLook2100XL 扫描
仪扫描凝胶图像，扫描结果直接导入计算机（32 位，
400 dpi 分辨率，全彩）。并用 PDQuest 2DE7.4 分析
软件（美国 Bio-Rad 公司）分析（图像剪切、斑点
检测等）。
2 结果
2.1 不同分离胶浓度的选择
采用 10%、12% 和 15% 的分离胶探讨了对四倍
体刺槐韧皮部蛋白质的分离效果的影响。结果（图
1）表明，分子量 20 kD 以下的蛋白质在 10% 的分
离胶中（图 1-A）未能得到分离，虽然分离度较大
但条带不够清晰，av 蛋白质没能完全的展现在凝胶
上。蛋白点在 12% 的分离胶中（图 1-B）能充分分
开，且条带清晰蛋白质分布较均匀。用 15% 的分离
胶（图 1-C）可以看出蛋白质在整个凝胶板上是分
布不均匀的 ；由于胶浓度太大，大分子蛋白质大量
重叠，条带不够清晰。由以上结果可知，四倍体刺
槐蛋白质的分离胶相对适宜浓度为 12%，在后续试
验中采用 12% 的分离胶。
2.2 不同IPG胶条pH梯度的选择
采用 pH3-10、pH4-7、pH5-8 的 IPG 胶条对四
倍体刺槐枝段韧皮部全蛋白进行双向电泳，根据凝
胶蛋白质点的分布结果选择最适合的 pH 梯度。为
表 1 等电聚焦程序设定
程序 电压（V） 速度 时间（h） 功能
Step 1 250 线性 0.5 除盐
Step 2 1000 快速 1 除盐
Step 3 10000 线性 5 升压
Step 4 10000 快速 80000 Vh* 聚焦
Step 5 500 快速 任意 保持
* 标注为修改项
kD
25
35
45
66.2
116
A
kD
66.2
45
35
25
18.4
14.4
B
kD
116
45
35
25
18.4
14.4
C
66.2116
A ：10% ；B ：12% ；C ：15%
图 1 不同浓度 SDS-PAGE 的蛋白质分离效果
2013年第1期 119张胜等 ：四倍体刺槐枝条韧皮部总蛋白质双向电泳体系建立及应用
了尽可能多的，全面的显现四倍体刺槐枝段韧皮部
蛋白质，在 IPG 胶条选择试验中采用灵敏度高的硝
酸银染色法染色，上样量 180 μg。通过 pH3-10 胶
条（图 2-A）发现，四倍体刺槐韧皮部蛋白质点主
要分布在偏酸性和中性的区域，碱性区域蛋白质点
相对较少。采取窄 pH 范围（pH4-7 和 pH5-8）的
IPG 胶条（图 2-B 和图 2-C）进行双向电泳试验，两
种胶条都能得到较好的凝胶图谱，且相比 pH5-8 的
IPG 胶条，使用 pH4-7 的 IPG 胶条能得到更多的蛋
白质点，且蛋白点在凝胶图谱中分布均匀，斑点检
测结果见表 2。
表 2 两种 pH 梯度下的蛋白质点数对比
pH 梯度 硝酸银染色上样量（μg） 蛋白质点数
4-7 180 843±35
5-8 180 699±33
A ：pH3-10 硝酸银染色结果 ；B ：pH4-7 硝酸银染色结果 ；C ：pH5-8 硝酸银染色结果
图 2 不同线性 IPG 胶条对双向电泳图谱的影响
12
%
S
D
S-
PA
G
E
pH3 IPG17cm pH10
A
12
%
S
D
S-
PA
G
E
pH4 IPG17cm pH7
B
pH5 IPG17cm pH8
12
%
S
D
S-
PA
G
E
C
2.3 考马斯亮蓝染色上样量的优化
图 3 中 A-D 四 块 胶 分 别 表 示 上 样 量 为 400、
450、550和650 μg 经考马斯亮蓝 G-250染色后的 2-DE
图谱。四块凝胶中 A、B 的背景较 C、D 更清晰，且
横纵条纹相对较少，但是 A、B 两块凝胶上样量少，
蛋白质点数也较 C、D 凝胶少，丢失许多低丰度蛋
白质。D 凝胶，上样量较大，高峰度的蛋白质点将
其周边蛋白质点覆盖，影响图像效果，C 凝胶较 D
凝胶分辨率高且蛋白点更圆，见图 3-C Ⅰ和图 3-D Ⅲ
区、3-C Ⅱ和图 3-D Ⅳ区放大图。C 凝胶虽然背景
没有 A、B 清晰但蛋白质点数最多，而且蛋白质点
形状更圆。4 种不同上样量蛋白质点检测结果如表
表 3 考马斯亮蓝染色不同上样量蛋白质点数对比
考马斯亮蓝上样量（μg） 蛋白质点数
400 608±23
450 664±35
550 897±37
650 769±40
3 所示。可见，采用考马斯亮蓝染色时 550 μg 的上
样量对于四倍体刺槐韧皮部总蛋白 2-DE 分析是最
佳的。
2.4 第一向等电聚焦时间的优化
等电点聚焦是影响双向电泳凝胶图像好坏的重
要因素。聚焦时间同胶条 pH 梯度、长度、蛋白质
上样量的大小有关。若聚焦不充分，会在凝胶图上
呈现蛋白质点的横向条纹、蛋白质点不够圆等问题，
最终影响分析结果。但聚焦时间过长也并不能改变
分辨效果。Bio-Rad 实验操作手册中将 17 cm IPG 胶
条的总聚焦功率设为 60 000 Vh，但 60 000 Vh 的总
聚焦功率并不能将四倍体刺槐韧皮部蛋白充分聚焦，
蛋白质凝胶图上横条纹较多（图 4-A），且当上样量
较大时不能充分聚焦的现象尤为明显。实际操作中
将总聚焦功率设为 80 000 Vh（表 1），加大功率后凝
胶图上基本消除了横条纹，且蛋白质点形状比较圆，
如图 4-B 所示。
2.5 四倍体刺槐扦插愈伤组织阶段蛋白质组份分析
采用优化的体系分析四倍体刺槐扦插愈伤组织
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期120
A B
C
Ċ
ĉ
D
Č
ċ
pH4 IPG17 cm pH7
pH4 IPG17 cm pH7
pH4 IPG17 cm pH7
pH4 IPG17 cm pH7
A ：400 μg ；B ：450 μg ；C ：550 μg ；D ：650 μg
图 3 不同上样量的蛋白质 2-D 图谱
pH4 IPG17cm pH7
12
%
S
D
S-
PA
G
E
12
%
S
D
S-
PA
G
E
pH4 IPG17cm pH7
A B
A ：等电聚焦时间 60 000 Vh ；B ：等电聚焦时间 80 000 Vh
图 4 考马斯亮蓝染色条件下不同等电聚焦时间
对双向电泳凝胶图谱的影响
B
A
A ：对照（0 d）；B ：愈伤组织形成期（10 d）
图 5 四倍体刺槐扦插愈伤组织形成阶段蛋白质差异点图谱
形成阶段蛋白质变化情况，经 PowerLook2100XL 扫
描仪扫描凝胶图像，PDQuest7.4 软件进行自动匹配
结合肉眼观察及人工匹配，保留对照（0 d）370 个，
愈伤组织形成期（10 d）368 个肉眼可见且点形较圆
的斑点作为最后分析。结果（图 5）显示，与对照（图
5-A）相比在扦插 10 d 愈伤组织形成期（图 5-B）共
有 83 个差异蛋白质，其中上调蛋白质 15 个，新产
生蛋白质 22 个，下调蛋白质 22 个，缺失表达 24 个。
图 6 为个别差异蛋白质点的放大图，其中图 6-A 表
示对照（0 d），图 6-B 为愈伤组织形成期。
3 讨论
对于蛋白质组学研究来说，高质量的双向电泳
图谱是后续分析的基础，对研究材料进行双向电泳
条件的优化是非常重要和必要的。合适的蛋白质提
取方法能消除植物次生代谢物质的干扰，改善图谱
2013年第1期 121张胜等 ：四倍体刺槐枝条韧皮部总蛋白质双向电泳体系建立及应用
质量。本研究以 TCA/ 丙酮法提取全蛋白质，经双向
电泳，得到的 2-DE 凝胶图谱背景清晰，蛋白质点
较多。表明 TCA/ 丙酮法适合四倍体刺槐枝段韧皮部
全蛋白质的提取。不同的分离胶浓度会影响蛋白质
分离的效果，丁承强等［18］在研究水稻根段组织双
向电泳图谱中指出与 12% 的分离胶相比 10% 的分
离胶使水稻根段组织蛋白质点分布更加均匀，在调
整好上样量后能够分离到更多的蛋白质点。对于不
同的植物需要选择合适浓度的分离胶来分离蛋白质，
庄维兵等［19］发现 10% 的分离胶比较适合梅花芽蛋
白质双向电泳，任丽萍等［20］用 15% 分离胶分离黄
瓜叶片蛋白质效果较好。另外，合适的分离胶浓度
有利于蛋白质分离，并且能在凝胶图谱上显现更多
的蛋白质点，对于多数植物组织来说 12% 的分离胶
浓度较适合蛋白质的分离［10，21-24］。对于四倍体刺槐
韧皮部全蛋白质来说其蛋白质的分子量主要集中在
20-120 kD 的范围内，所以采用 12% 的分离胶是合
适的。
适合的 pH 梯度能显著提高凝胶蛋白质点的分
辨率。对于四倍体刺槐韧皮部全蛋白使用 pH3-10
胶条分离效果不好，从蛋白质图谱上分析得出大部
分蛋白质大致集中在 pH 为 4-8 的范围内。采用窄
pH 梯度胶条后（pH4-7、pH5-8），凝胶背景、分
离效果、分辨率都得到显著的提高。但是目前没有
pH4-8 的 17 cm IPG 胶条，所以选择蛋白质点数相
对较多的 pH 范围胶条为分析所用。对于全面分析
蛋白质来说可以对不同的 pH 范围跑出的凝胶图谱
进行分别分析。
不同的染色方法所要求的上样量是不同的，17
cm 的 IPG 胶条银染上样量在 100-300 μg，考马斯
亮蓝染色上用量 1-3 mg。但是也因不同的样品而
有所不同。上样量的大小直接影响双向电泳的分辨
率［25］。双向电泳图谱的效果直接受蛋白质上样量的
影响，上样量关系到试验结果的可靠性。提高上样
量，有利于检测低丰度蛋白，但上样量过高时，会
产生横纵条纹，高丰度蛋白质的斑点会影响其他蛋
白质点的分离和分析［26］。上样量太小，低丰度蛋白
无法显示在凝胶上 ；上样量过大凝胶背景不清，凝
胶上出现大量的横条纹，高丰度蛋白形成遮盖效应
使蛋白点分离度降低。所以探索最佳的上样量对于
凝胶蛋白点分析很有意义，对于四倍体刺槐枝段韧
皮部蛋白质双向电泳考马斯亮蓝染色上样量从 400
μg 增加到 550 μg 时蛋白点数也是呈上升趋势，但再
增加 100 μg 时蛋白点数反而下降了，而且分辨率明
显下降，原因是上样量较大，形成较多的横线和拖尾，
影响蛋白点分析。
聚焦时间同胶条的长度、pH 梯度、载体两性电
解质以及蛋白质上样量有关［26］。Bio-Rad 试验操作
手册对等电聚焦做了参考的程序设置，但是在实际
试验操作中需要根据自己实际的样品做调整，既要
防止聚焦时间不够所造成图谱上大量横条纹、聚焦
不完全和蛋白质点不圆，又要防止过聚焦所造成的
横条纹和蛋白质因长时间聚焦所造成的损失。
采用优化的体系对四倍体刺槐扦插枝段韧皮部
进行双向电泳，分析差异表达蛋白质，希望从蛋白
质组学角度解释四倍体刺槐扦插生根机理。对于这
些差异表达的蛋白质的质谱鉴定、数据库检索及蛋
白质功能分析作者实验室正在进行中。
A
A
A
A
A
A
A
A B
B
B
B
B
B
B
B
图 6 图 5 中对照（0 d）（A）和愈伤组织形成阶段（10 d）（B）个别差异蛋白质点放大图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期122
4 结论
本研究以 TCA/ 丙酮法为蛋白质提取方法，采
用 pH4-7 的 17 cm IPG 胶 条，12% 的 分 离 胶 浓 度，
考马斯亮蓝染色上样量 550 μg，等电聚焦在 60 000
Vh 的基础上提高 20 000 Vh 能得到背景清晰、蛋白
质点数多、分离度高且重复性好的电泳凝胶图谱，
经过优化建立起了适合于四倍体刺槐枝段韧皮部双
向电泳体系。用优化的体系对四倍体刺槐扦插当天
（0 d）和愈伤组织形成阶段（10 d）采集的样品进行
蛋白质双向电泳分离，将得到凝胶图谱经软件检测
分析得到 83 个差异蛋白质点，其中上调蛋白 15 个，
新产生蛋白 22 个，下调蛋白 22 个，缺失表达 24 个。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）