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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):147-152
收稿日期 ：2014-12-08
基金项目 ：转基因生物新品种培育科技重大专项（2014ZX0800913B-002），国家基础科学人才培养基金资助项目（J1210069），国家高技术
研究发展计划课题（2011AA10A203），国家自然科学基金项目（31401812），黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12521021）
作者简介 ：张圆，女，硕士，研究方向 ：生物防治微生物功能基因的发掘、研究和利用，E-mail ：13009835138@126.com ；周国旺为并列第
一作者
通讯作者 ：高继国，男，博士生导师，研究方向 ：生物大分子的分离纯化，苏云金芽胞杆菌抗性机理、生物安全性 ；
E-mail ：gaojiguo1961@hotmail.com
在自然界中，除纤维素外，几丁质是存在最广
泛的有机化合物。几丁质是由 N-乙酰 -D-氨基葡萄
糖（GlcNAc）以 β-1，4 糖苷键连接而成的高分子聚
合物［1］，它可以与蛋白质结合形成多种组织结构，
如许多无脊椎动物的外骨骼、大多数真菌和藻类的
细胞壁［2］。此外，几丁质蛋白复合物是围食膜的重
要组成部分，围食膜是昆虫防止病原侵入的一道天
然屏障［3］。近期研究发现由于几丁质及其衍生物具
有无毒的生物降解性和生物相容性，因此被广泛应
用于食品、制药和生物技术等行业［4］。
几丁质酶是细菌、真菌、昆虫、植物和动物体
内普遍合成的一种具有生物催化活性的水解酶类［5］，
苏云金芽胞杆菌 chiA73 基因的克隆、表达和
酶活性分析
张圆  周国旺  李海涛  刘荣梅  赵一夔  高继国
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）
摘 要 ： 旨在对苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因进行分子鉴定和酶活测定，从产几丁质酶活力高的 Bt DLD171 菌株中提取基
因组 DNA，通过 PCR 法克隆得到几丁质酶 chiA73 基因（GenBank 登录号为 KJ508093）。结果显示，对 chiA73 基因进行表达，获
得大小约 74 kD 的表达产物。用荧光底物对表达产物进行酶活测定，发现表达产物只能水解荧光底物 4-甲基伞形酮几丁三糖［4-
MU-（GlcNAc）3］，而不能水解 4-甲基伞形酮几丁单糖（4-MU-GlcNAc）。结果表明，ChiA73 为一种内切几丁质酶，在 pH 值为 8、
温度为 40℃时酶活性最高。
关键词 ： 苏云金芽胞杆菌 ；几丁质酶 ；chiA73 ；荧光底物 ；酶活性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.021
Cloning，Expression and Enzymatic Activities of chiA73 Gene from
Bacillus thuringiensis
Zhang Yuan Zhou Guowang Li Haitao Liu Rongmei Zhao Yikui Gao Jiguo
（College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）
Abstract ： In order to identify and detect chitinase activities from Bacillus thuringiensis strains, chitinase gene chiA73（GenBank
accession number ：KJ508093）from genomic DNA of Bt DLD171 producing high-yield chitinase was cloned by PCR. Gene of chitinase chiA73
was expressed and the weight of expression product was approximate 74 kD. The results measured by fluorogenic substrates showed that the
expression product of chiA73 hydrolyzed 4-MU-（GlcNAc）3 only, but not 4-MU-GlcNAc. In conclusion, the work indicated that ChiA73 was
one of endochitinase, and had the highest activity at pH8 and 40℃.
Key words ： Bacillus thuringiensis ；chitinase ；chiA73 ；fluorogenic substrates ；enzymatic activity
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8148
它能特异地催化水解几丁质的 β-1，4-糖苷键生成 N-
乙酰 -D-氨基葡萄糖。几丁质酶的作用十分广泛，不
仅用于甲壳素衍生物的生产，而且用于控制植物病
原真菌的代谢，以及增强苏云金芽胞杆菌的杀虫活
性［6，7］。由细菌产生的几丁质酶主要分为两大类 ：
一类为内切几丁质酶（endochitinase，EC3.2.1.14），
此类酶可随意裂解几丁质和几丁质寡聚物并释放出
可溶性低分子量混合物 ；另一类为外切几丁质酶
（exochitinase），分为两个亚类 ：一类为几丁二糖酶
（chitobiosidase，EC3.2.1.29），可从非还原端裂解几
丁质和几丁质寡聚物，释放的最终产物主要是二乙
酰几丁二糖［（GlcNAc）2］；另一类为 N-乙酰氨基
葡萄糖苷酶（N-acetylglucosaminidases，EC3.2.1.30），
同几丁二糖酶一样可从非还原端裂解几丁质和几丁
质寡聚物，释放 N-乙酰葡糖胺单体（GlcNAc），它
也是唯一可以水解（GlcNAc）2 的酶
［8-10］。
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）因
为对多种害虫具有毒杀作用而一直为人们所关注，
目前已有十多个亚种的苏云金芽胞杆菌被证明能产
生几丁质酶。目前，对 Bt 几丁质酶的研究已经从
最初的酶的分离纯化发展到几丁质酶基因的克隆表
达，从对产几丁质酶菌株的筛选发展到几丁质酶的
定向改造，但这些过程均与酶活性的检测紧密相连。
目前，大多数报道采用 DNS 方法测定几丁质酶活
性［11，12］，本研究在完成对苏云金芽胞杆菌 DLD171
菌株中几丁质酶 chiA73 基因克隆表达的基础上，采
用荧光底物对表达产物进行酶活测定［19］，旨在为几
丁质酶的后期开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 Bt DLD171 菌株由本实验室自
己分离得到，表达菌株 E. coli Rosetta（DE3）与载
体 pEB 由本实验室自己保存。
1.1.2 培养基 液体 LB 培养基 ：胰蛋白胨 10 g、
酵 母 提 取 物 5 g、 氯 化 钠 10 g、 蒸 馏 水 1 000 mL，
pH7.0。 固 体 LB 培 养 基 ：在 液 体 LB 培 养 基 中 加
13 g/L 的琼脂。固体 1/2LB 培养基 ：胰蛋白胨 5 g、
酵母提取物 2.5 g、氯化钠 5 g、琼脂 13 g、蒸馏水
1 000 mL，pH7.0。
几丁质酶诱导固体培养基［13］：（NH4）2SO4 3 g、
K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、
FeSO4·H2O 0.5 g、胶体几丁质 3 g、酵母粉 3 g、琼
脂 13 g、蒸馏水 1 000 mL，pH7.2。
几丁质酶发酵培养基［8］：蛋白胨 2 g、酵母提取
物 2 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O
0.5 g、FeSO4·H2O 0.5 g、细粉几丁质 12 g、蒸馏水
1 000 mL，pH6.8。
1.2 方法
1.2.1 几丁质酶产酶菌的筛选 几丁质酶的筛选通
过水解圈法进行，将 Bt 菌株直接接种在几丁质诱导
固体培养基上，观察其生长情况和水解圈的有无［14］。
1.2.2 晶体形态观察 将 Bt 菌株 DLD171 在 1/2LB
培养基上培养 48 h 后，将胞晶混合液滴于载玻片上，
涂抹均匀，烘干固定，石炭酸复红染液染色 3 min，
清水冲洗，100× 油镜进行镜检［15］。
1.2.3 几丁质酶基因的克隆和测序 Bt DLD171 菌株
在 LB 培养基中培养，提取基因组 DNA。使用引物
上 游 序 列（5-ATGGCTATGAGGTCTCAAAAATT-3）
和 下 游 序 列（5-CTAGTTTTCGCTAATGACGGC-3）
扩增几丁质酶基因［16］，引物设计基于 chiA HD-73
的全长序列［19］。PCR 扩增时使用 KOD 高保真酶，
PCR 反应程序 ：94℃ 2 min ；98℃ 10 s，52℃ 30 s，
68℃ 2 min，30 个循环 ；最后 68℃延伸 10 min。将
扩增产物进行纯化并与 pEB 载体连接，转化到 E.
coli Rosetta（DE3）中［17］。提取质粒，送至北京金
维智公司进行测序。
1.2.4 基因诱导表达及 SDS-PAGE 分析 将重组的
大肠杆菌菌株进行诱导表达，诱导条件为 ：IPTG 1
mg/mL，30℃，150 r/min，震荡培养 6 h。将诱导的
培养液在 4 000 r/min 的条件下离心 5 min 并收集菌
体，用预冷的 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）悬浮菌体
两次。最后用 2 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）悬
浮菌体，并在冰水混合物中超声波破碎菌体，超声
时工作 3 s，间歇 3 s，将破碎完全的菌液离心取上
清备用［18］。
1.2.5 几丁质酶活性测定 挑取 Bt 单菌落于 5 mL
LB 试管中，30℃、220 r/min 振荡培养 12 h 后，按 1%
的接种量接种在几丁质酶发酵培养基中，30℃、220
2015,31(8) 149张圆等：苏云金芽胞杆菌 chiA73基因的克隆、表达和酶活性分析
r/min 振荡培养 5 d。将培养物在 4℃、12 000 r/min
条件下离心 20 min 取上清备用。使用荧光几丁质
低聚糖进行几丁质酶活性测定，4-甲基伞形酮几丁
三糖［4-MU-（GlcNAc）3］和 4-甲基伞形酮几丁单
糖（4-MU-GlcNAc）作为反应底物。使用的酶液为
上述表达的几丁质酶和 Bt 直接发酵的酶，测定体系
为 ：荧光底物 10 μL，几丁质酶 10 μL，磷酸缓冲液
（pH7）580 μL，37℃反应 1 h 后加入 600 μL Na2CO3
终止反应［20］。使用荧光分光光度计（LS45）对反应
产物进行荧光测定，测定时仪器的参数设为激发光
340 nm 和发射光 415 nm，用于测量 4-甲基伞型酮
（4-methylumbelliferone）发出的荧光。为了量化这
种酶，一个酶活力单位定义为在 1 h 释放 1 μmol 的
4-methylumbelliferone 所需的酶量［19］。每个实验一次
平行 3 次，整个实验重复 3 次。
1.2.6 pH 值 和 温 度 对 几 丁 质 酶 活 力 的 影 响 用
4-MU-（GlcNAc）3 作为底物，测定表达的几丁质
酶 ChiA73 的最适 pH，缓冲溶液为 pH 4-10 的柠檬
酸 - 磷酸氢二钠缓冲溶液。在最适 pH 时，使用 4-
MU-（GlcNAc）3 作为底物测定 ChiA73 在温度为 20-
80℃时酶活性的大小。每个实验一次平行 3 次，整
个实验重复 3 次。
2 结果
2.1 晶体形态观察
BtDLD171 菌株产生的晶体形态，光学显微镜
（图 1）下箭头所示，从左到右依次为菌体、芽胞和
晶体。
交 到 GenBank， 获 得 登 录 号 为 KJ508093。 并 将 其
命名为 chiA73，几丁质酶 chiA73 序列全长为 2 031
bp，编码 676 个氨基酸残基。chiA73 与其他来源于
GenBank 报道的 Bt 几丁质酶基因有 94%-99% 的相
似度。
图 1 Bt DLD171 的光学显微镜图片
2.2 几丁质酶基因chiA73的克隆和序列分析
PCR 扩 增 结 果（ 图 2） 所 示， 将 测 序 结 果 提
5000
3000
20002031
bp
M
bp
1000
750
500
250
100
图 2 chiA73 基因扩增结果
2.3 几丁质酶ChiA73蛋白结构分析
使用 SignalP（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/Sig
nalP/）分析结果（图 3）表明，几丁质酶 ChiA73 的
切割位点在 Ala-34 和 Asp-35 之间，催化区域由 Gly-
147 到 Ser-222 共 76 个氨基酸组成，粘蛋白 III 型同
源区（FN3）由 Ile-479 到 Thr-574 共 96 个氨基酸组
成，几丁质结合域（CBD）由 Val-587 到 Lys-629 共
43 个氨基酸组。
2.4 chiA73在大肠杆菌中的表达
对 chiA73 基因进行诱导表达，提取蛋白并进行
SDS-PAGE 电泳检测。结果（图 4）显示，表达产物
的大小约 74 kD。以空质粒 pEB 转入 Rosetta（DE3）
菌株作为阴性对照，未发现 74 kD 的蛋白，说明在
大肠杆菌中成功表达了几丁质酶 ChiA73。
2.5 原菌发酵液与表达蛋白ChiA73的活性检测
用两种荧光几丁质低聚糖作为底物对几丁质酶
酶活进行测定，结果（表 1）显示，在 pH 值为 7 时，
原菌发酵液对 4-MU-（GlcNAc）3 具有较高的水解活
性，同时对 4-MU-GlcNAc 具有一定的水解活性。表
达的几丁质酶 ChiA73 只对 4-MU-（GlcNAc）3 具有
高的水解活性，对 4-MU-GlcNAc 没有水解活性。E.
coli DE3 自身的蛋白未检测到水解活性。结果表明
原菌发酵液不仅具有内切几丁质酶活性，还具有 N-
乙酰氨基葡萄糖酶活性。而表达的几丁质酶 ChiA73
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8150
只具有内切几丁质酶活性，说明几丁质酶 ChiA73 是
一种内切几丁质酶。
表 1 不同底物下几丁质酶的活性分析 /（U·mL-1）
菌株
4-MU-GlcNAc 4-MU-（GlcNAc）3
N- 乙酰氨基葡萄糖酶 内切几丁质酶
原菌株 19 83
表达菌株 0 132
大肠杆菌 DE3 0 0
2.6 pH值和温度对几丁质酶ChiA73活性的影响
在 37℃下，改变酶活测定体系的 pH 值，结果（图
5-A）显示，在 pH 4-10 范围内，几丁质酶均具有一
定活性，pH 为 8 时酶活性最高。在 pH 为 8 时，改
变测活体系的反应温度，结果（图 5-B）显示，在
温度 20-80℃范围内几丁质酶均有活性，在 40℃时
几丁质酶酶活性最高。
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VADIDASKLTHLNYAFADICWNGKHGNPSTHPDNPNKQTWNCKESGVPLQNKEVPN
GTLVLGEPWADVTKSYPGSGTTWEDCDKYARCGNFGELKRLKAKYPHLKTTISVGG
WTWSNRFSDMAADEKTRKVFAESTVAFLRAYGFDGVDLDWEYPGVETIPGGSYRPE
DKQNFTLLLQDVRNALNKAGAEDGKQCLLTIASGASQRYADHTELKKISQILDWINI
MTYDFHGGWEATSNHNAALYKDPNDPAANTNFYVDGAINVYTNEGVPVDKLVLGV
PFYGRGWKSCGKENNGQYQPCKPGSDGKLASKGTWDDYSTGDTGVYDYGDLAAN
YVNKNGFVRYWNDTAKVPYLYNATTGTFISYDDNESMKYKTDYIKTKGLSGAMFW
ELSGDCRTSPKYSCSGPKLLDTLVKELLGGPINQKDTEPPTNVKNIVVTNKNSNSVQLN
WTASTDNVGVTEYEITAGEEKWSTTTNSITIKNLKPNTEYKFSIIAKDAAGNKSQPTA
LTVKTDEANTTPPDGNGTATFSVTSNWGSGYNFSIIIKNNGTNPIKNWKLEFDYSGNL
TQVWDSKISSKTNNHYVITNAGWNGEIPPGGSITIGGAGTGNPAELLNAVISEN*
下划线部分表示信号肽，阴影部分表示保守催化域，既有阴影又有下划线区域表示粘
蛋白 III 型同源区（FN3），方框表示几丁质结合区（CBD）
图 3 ChiA73 的氨基酸序列
200
kD
M 1 2
116
90
66
74
kD
M ：高分子量 Marker ：1 ：pEB 空载体组分 ；2 ：表达蛋白 ChiA73
图 4 ChiA73 表达蛋白 SDS-PAGE 电泳
4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
120
140
160
pH
20 30 40 50 60 70 80
0
20
40
60
80
100
120
䞦⍫U·mL-1 
䞦⍫U·mL-1  ⑙ᓖ/ć
A
B
图 5 pH（A）和温度（B）对内切几丁质酶活性的影响
2015,31(8) 151张圆等：苏云金芽胞杆菌 chiA73基因的克隆、表达和酶活性分析
3 讨论
几丁质酶酶活的检测方法有很多种，如 DNS 试
剂检测法，此方法可快速测定几丁质酶总酶活，但
无法测定单个几丁质酶的活性，更不能用于鉴定几
丁质酶的种类［12］。而使用荧光几丁质低聚糖对几
丁质酶酶活进行测定，可以弥补 DNS 试剂检测法的
不足。最为常用的荧光剂是 4-甲基伞形酮，此方法
区分 3 种几丁质酶的原理为 ：内切几丁质酶能水解
4-MU-（GlcNAc）3 但不能水解 4-MU-GlcNAc；只有 N-
乙酰氨基葡萄糖酶可以水解 4-MU-GlcNAc ；而几丁
二糖酶只能水解 4-MU-（GlcNAc）2 生成 4-甲基伞形
酮［21］。本研究从 Bt DLD171 菌株中克隆得到几丁质
酶基因 ChiA73，并证实 ChiA73 为一种内切几丁质
酶， 这 与 Barboza-Corona 等［19］ 对 ChiA-HD73 的 鉴
定结果一致。
几丁质酶 ChiA73 由信号肽、催化区、粘蛋白
III 型同源区和几丁质结合区 4 个结构域组成。蛋白
质前体的信号肽断裂位点在 Ala-34 和 Asp-35 之间，
符合革兰氏阳性细菌的断裂位点，革兰氏阴性菌的
断裂位点在 Leu-33 和 Ala-34 之间。 成熟的 ChiA73
蛋白质在 N 端存在一个催化区，与糖基水解酶 18
家族的催化区有较高的同源性，其中 Asp-207、Asp-
209 和 Glu-211 高度保守，与几丁质酶的活性相关。
催化区之后是粘蛋白 III 型同源区，该结构域对几丁
质酶与几丁质的结合作用无影响，却与胶状几丁质
降解程度有关。除几丁质酶外，纤维素酶、α-淀粉
酶、PHB 解聚酶等也存在粘蛋白 III 型同源区域［22］。
ChiA73 蛋白质 C 端几丁质结合区中的 Trp-591、Tyr-
595 和 Trp-626 也是高度保守的，该结构域能特异结
合不可溶几丁质（如胶状几丁质或再生几丁质）及
晶体几丁质。
大多数几丁质酶在偏酸的环境下酶活最高，而
对 ChiA73 理化性质研究表明其最适 pH 值为 8。研
究表明，Bt 几丁质酶可协同 Bt 产生的晶体蛋白进行
杀虫［23］，Bt 在害虫体内的作用位点是昆虫中肠，而
中肠液偏碱性，碱性条件下 ChiA73 具有较高的活性
为其杀虫增效作用提供了条件。此外，Bt 几丁质酶
还可以抑制真菌的生长，本研究为 Bt 几丁质酶在生
物防治及农业生产上的应用提供了参考。
4 结论
本研究从 Bt DLD171 菌株中克隆得到几丁质酶
chiA73 基因，基因序列全长为 2 031 bp，编码 676
个氨基酸残基，分子量约为 74 kD，GenBank 登录号
为 KJ508093。将该基因在大肠杆菌 Rosetta（DE3）
中表达，表达的 ChiA73 蛋白只具有内切几丁质酶活
性，且最适 pH 为 8、最适温度为 40℃。结果表明，
荧光剂 4-甲基伞形酮几丁质低聚糖法是一种行之有
效的几丁质酶酶活检测法，并且可以用于鉴定几丁
质酶的种类。
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（责任编辑 马鑫）