全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
南 方 红 豆 杉（Taxus chinensis var. mairei Cheng
et L.K）为红豆杉属（Taxus Linn）植物，主要分布
于长江流域、南岭山脉山区及河南、陕西（秦岭）、
甘肃等省。自红豆杉中发现具有独特抗癌机制的紫
收稿日期 ：2012-06-28
基金项目 ：广州市科技计划项目（2009J1-C191）
作者简介 ：张庆波，男，博士研究生，研究方向 ：微生物资源及其应用 ；Email: gudaobo@163.com
通讯作者 ：章卫民，男，研究员，研究方向 ：微生物资源及其活性物质 ；E-mail: wmzhang58@yahoo.com.cn
杉醇后，人们开始大量从红豆杉树皮中提取紫杉
醇，致使红豆杉资源遭到严重破坏。为解决紫杉醇
的新来源，人们采用了各种不同的方法，并取得了
一定的成果。1991 年，Christen 等通过太平洋红豆
南方红豆杉内生真菌的分离鉴定及其细胞毒活性研究
张庆波1，2  陈玉婵1  李浩华1  潘清灵1  王磊1   
李冬利1  陶美华1  章卫民1
（1. 广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室 广东省华南应用微生物重点实验室 - 省
部共建国家重点实验室培育基地，广州 510070 ；2. 中国科学院南海海洋研究所，广州 510301）
摘 要 ： 采用平板培养法对采自广东省的南方红豆杉进行内生真菌的分离，并通过形态学和分子生物学方法进行分类鉴
定 ；共分离鉴定内生真菌 22 株，主要为刺盘孢属（Colletotrichum）、球座菌属（Guignardia）、座腔菌属（Botryosphaeria）、节菱
孢属（Arthrinium）、炭角菌属（Xylaria）、毛壳菌属（Chaetomium）、交链孢属（Alternaria）、拟茎点霉属（Phomopsis）、长蠕孢属
（Helminthosporium）等属。还采用 MTT 法测定了这些内生真菌发酵粗提物的细胞毒活性，活性研究发现有 6 个菌株的粗提物在作
用浓度为 100 μg/mL 时，对至少 1 种受试肿瘤细胞株的抑制率在 50% 以上，其中菌株 A223 和 A240 对人乳腺癌细胞 MCF-7 的抑制
率在 90％以上。表明南方红豆杉内生真菌多样性丰富，有些菌株具有良好的细胞毒活性，值得进一步深入研究。
关键词 ： 南方红豆杉 内生真菌 分离鉴定 细胞毒活性
Isolation，Identification and Cytotoxic Activities of Endophytic Fungi
from Taxus chinensis var. mairei
Zhang Qingbo1，2 Chen Yuchan1 Li Haohua1 Pan Qingling1 Wang Lei1
Li Dongli1 Tao Meihua1 Zhang Weimin1
（1. Guangdong Provincial Open Laboratory of Applied Microbiology，Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and
Application，State Key Laboratory of Applied Microbiology（Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base），South China，Guangdong
Institute of Microbiology，Guangzhou 510070 ； 2. South China Sea Institute of Ocenology，
Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301）
Abstract:  Plate method was used to investigate the diversity of endophytic fungi associated with Taxus chinensis var. mairei Cheng et
L.K in Guangdong province，and morphological and molecular methods were combined to identify the endophytic fungal strains. A total of 22
isolated strains of endophytic fungi were identified and most of them belonged to the genera of Colletotrichum，Guignardia，Botryosphaeria，
Arthrinium，Xylaria，Chaetomium，Alternaria，Phomopsis，Helminthosporium. MTT method was used to evaluate their cytotoxic activities，
which showed the extracts of 6 strains had inhibition rates over 50% against at least one tumor cell line at 100 μg/mL，among which the extracts
of strains A233 and A240 displayed inhibition rates over 90% against the MCF-7 cell line. Therefore，the endophytic fungi from Taxus chinensis
var. mairei were rich in species diversity. Some strains exhibiting good cytotoxic activities deserve further research on their bioactive metabolites.
Key words:  Taxus chinensis var. mairei Endophytic fungi Isolation and identification Cytotoxic activity
2013年第1期 173张庆波等 ：南方红豆杉内生真菌的分离鉴定及其细胞毒活性研究
杉（Taxus brevifolia）的组织培养获得了紫杉醇［1］；
1994 年，Nicolaou 等［2］ 完 成 了 紫 杉 醇 的 全 合 成。
1993 年，Stierle 等［3］从太平洋红豆杉树皮内生真菌
Taxomyces andreanae 的发酵液中分离得到了紫杉醇，
这一发现使红豆杉属植物中内生真菌及其次生代谢
产物的研究成为热点，并发现许多内生真菌都能够
产生紫杉醇或具有紫杉醇类似结构的代谢产物［4 7］。
本研究对产自广东的南方红豆杉进行内生真菌的分
离和鉴定，探讨南方红豆杉内生真菌的多样性，并
对分离到的内生真菌的发酵粗提物进行体外细胞毒
活性研究，旨在筛选出具有良好抗肿瘤活性的菌株，
为进一步研究其活性次生代谢产物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
南方红豆杉样品，包括叶、枝条、果实及树皮，
2008 年 10 月采自广东省大东山自然保护区。
Taq 酶及其他 PCR 相关试剂购于大连宝生物工
程有限公司，其他分析纯化学试剂均为市售。
人神经胶质瘤细胞 SF-268、人肺癌细胞 NCI-
H460、人乳腺癌细胞 MCF-7，均保存于广东省微生
物研究所。
DMI 3000 B 倒置显微镜（Leica）；S-3000 N 扫
描电镜（日立）；EPS 3501 电泳仪（Amersham Phar-
macia Biotech）； ImageQuant 350 凝胶成像仪 ；LAM-
BDA-E 酶标仪（Biotech）；2123-2 二氧化碳培养箱
（Shellab）；Mastercycler gradient 5331 PCR 仪（Eppen-
dof）；RE-2000 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；
LRH-250 生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；
THZ-C-1 摇床（广州市正一科技有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 内生真菌的分离 将采集的新鲜样品用流水
冲洗，然后用无菌水漂洗 2 次，放入 75% 的乙醇
中浸泡 7 min，取出后用无菌水漂洗 3 次，再放入
0.1% 的升汞溶液中浸泡 5-7 min，取出后用无菌水
漂洗 4 次。叶片用无菌剪刀剪去边缘后剪成约 0.5
cm×0.5 cm 的方块 ；枝条用无菌手术刀削去四周，
取中间部位剪成 1 cm 长的小段 ；树皮用手术刀去
掉外皮层后，剪成 0.5 cm×0.5 cm 小块 ；果实剥去
外皮，取中间部位，剪成小块。用最后一次漂洗用
的无菌水涂板作为阴性对照。处理好的样品放入事
先准备好的 PDA 平板（含 20 μg/mL 卡那霉素和 20
μg/mL 氨苄青霉素）培养基中，26℃恒温培养，待
长出菌丝后，挑取平板中单一菌落进一步纯化，纯
化后的菌株转接到装有 PDA 培养基的斜面上，4℃
冰箱保存。
1.2.2 内生真菌的鉴定
1.2.2.1 形态学鉴定 肉眼观察分离菌株在 PDA 平
板上的培养特征 ；用光学显微镜观察菌丝、孢子、
产孢结构等形态特征 ；用扫描电镜观察部分菌株的
孢子、产孢结构等特征 ；参考《真菌鉴定手册》［8］，
对分离菌株进行初步鉴定。
扫 描 电 镜 样 品 制 备 和 观 察 ：将 PDA 平 板 培
养基上培养 7-10 d 的培养物连同培养基一起切成
0.5 cm× 0.5 cm 的小块，经 3％戊二醛固定 5 h，PBS
缓冲盐洗涤 ；1% 锇酸固定 2 h，PBS 缓冲盐洗涤 ；乙
醇、丙酮脱水后，用乙酸异戊酯置换其中的溶剂（2
次）。完全脱水后的样品临界点干燥 3 h，喷金，扫
描电镜观察。
1.2.2.2 分子鉴定 总 DNA 的制备参考王磊等［9］的
方 法。PCR 扩 增 采 用 真 菌 rDNA 内 转 录 间 隔 区
（rDNA ITS）通用引物 ITS1（5-TCCGTAGGTGAAC-
CTGCGG-3，正向）和 ITS4（5-TCCTCCGCTTATT-
GATATGC-3，反向）［10］扩增分离菌株的 rDNA ITS
区。PCR 采用 20 μL 反应体系，通过 Ex Taq（TaKa-
Ra）进行，反应条件为 93℃预变性 3 min ；93℃变
性 45 s，55℃复性 45 s，72℃延伸 1.5 min，共 30 个
循环 ；最后 72℃延伸 10 min。反应产物利用 PCR 产
物纯化试剂盒（QIAGEN）纯化，纯化后的样品由广
州景瑞生物科技有限公司进行测序。测序获得的序
列通过 BLAST 程序在 GenBank 上进行相似性序列检
索分析。
1.2.3 细胞毒活性研究
1.2.3.1 发酵液提取物的制备 从斜面挑取少许菌
丝接种到 PDA 平板上活化 3 d，挑取活化后的菌丝
（连同培养基）转接到装有 500 mL PD 培养基的 1 L
的三角瓶中，26℃，120 r/min 的条件下摇床培养 7 d。
培养物抽滤后，收集滤液，滤液用乙酸乙酯萃取 3 次，
萃取液于 40℃下减压浓缩至干，得到发酵液粗提物
备用。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期174
1.2.3.2 发酵粗提物的细胞毒活性测定 采用 MTT
法［11］ 测 定 发 酵 粗 提 物 对 肿 瘤 细 胞 SF-268、NCI-
H460 和 MCF-7 的生长抑制率，各粗提物的作用浓
度为 100 μg/mL，以顺铂作为阳性对照，作用浓度为
20 μg/mL，每处理重复 3 次。
2 结果
2.1 内生真菌的分离及鉴定
从南方红豆杉的叶、枝条、树皮及果实中共分
离到内生真菌 55 株，根据培养特征将这些菌株分成
32 类，测序后获得 22 条不同的序列，将这些序列
通过 BLAST 程序在 GenBank 上进行序列相似性检索
分析，结果见表 1。
从表 1 可以看出，分离菌株中能确定种的有胶
孢刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果球座
菌（Guignardia mangiferae）、葡萄座腔菌（Botryosp-
haeria dothidea）、暗色节菱孢（Arthrinium phaeosper-
mum）和细交链孢菌（Alternaria alternata）；确定到
属的有炭角菌属（Xylaria）、毛壳菌属（Chaetomium）、
拟茎点霉属（Phomopsis）和长蠕孢属（Helminthospo-
rium）；只能确定为植物内生真菌而未能确定其种属
的 有 4 株 ；而 菌 株 A213、A220、A239 和 A241 与
最相似物种的相似率低，分别为 92.1％、94.9％、
93.1％和 92.3％，有待作进一步鉴定。A213、A220、
A239、A241 的形态特征见图 1 及表 2。
分离菌株 最相似物种
菌株 分离部位 ITS 序列的长度（bp） GenBank 登录号 种名 / 菌株 Gen Bank 登录号 相似度（%）
A210 茎 610 HM222945 Guignardia mangiferae isolate xhy-02 EU677809.1 99.5
A211 茎 535 HM222946 Botryosphaeria dothidea isolate NW235 EU520234.1 99.4
A212 茎 553 HM222947 Colletotrichum gloeosporioides isolate T119 FJ459928.1 99.8
A213 茎 542 HM222948 Xylaria sp. YS-13 GQ414524.1 92.1
A216 茎 571 HM222949 Fungal endophyte sp. AiL8 EU054412.1 99.6
A218 茎 572 HM222950 Arthrinium phaeospermum strain MUCL 8362 AB220283.1 99.2
A219 茎 571 HM222951 Chaetomium sp. Aurim1182 DQ093660.1 99.6
A220 茎 560 HM222952 Fungal endophyte isolate 1503 EU686886.1 94.9
A221 茎 541 HM222953 Botryosphaeria dothidea BOTDOT1/4_15030- 2 AB369469.1 99.1
A223 茎 518 HM222954 Fungal endophyte isolate 459 EU687122.1 99.8
A224 茎 548 HM222955 Fungal endophyte Tm4-6 AY433808.1 99.1
A229 叶 574 HM222956 Arthrinium phaeospermum isolate XSD-132 EU326200.1 99.8
A230 叶 441 HM222957 Fungal endophyte isolate 1602 EU686911.1 98.8
A232 叶 605 HM222958 Guignardia mangiferae strain ：IFO 33125 AB041239.1 98.8
A233 果实 607 HM222959 Guignardia mangiferae isolate ymy-02 EU677817.1 99.7
A234 果实 530 HM222960 Colletotrichum gloeosporioides isolate A12 EU781669.1 99.4
A235 果实 528 HM222961 Alternaria alternata FN179367.1 99.8
A237 果实 553 HM222962 Colletotrichum gloeosporioides BLN03 AB470844.1 99.6
A238 果实 534 HM222963 Colletotrichum gloeosporioides isolate 13MA/L GQ407097.1 99.8
A239 果实 605 HM222964 Guignardia ardisiae AB454283.1 93.1
A240 树皮 534 HM222965 Phomopsis sp. XZ-26 DQ272500.1 99.0
A241 树皮 523 HM222966 Helminthosporium asterinum ATCC 22380 AF073917.1 92.3
2.2 内生真菌的抗肿瘤活性
除了菌株 A229 和 A232 外，对其余 20 个菌株
的发酵粗提物进行了体外细胞毒活性测试，结果见
表 3。从表 3 中可以看出，有 4 株内生真菌对神经
胶质瘤细胞 SF-268 的抑制率在 50％以上，有 2 株对
肺癌细胞 NCI-H460 的抑制率在 50％以上，有 6 株
对乳腺癌细胞 MCF-7 的抑制率在 50％以上，其中菌
株 A223 和 A240 对 MCF-7 的抑制率均在 90％以上。
表 1 分离及测序结果
2013年第1期 175张庆波等 ：南方红豆杉内生真菌的分离鉴定及其细胞毒活性研究
3 讨论
内生真菌在植物体内广泛分布，这种分布既有
一定的宿主或组织专一性，又受宿主生长环境的影
响，具有丰富的多样性。同一植物在不同的地理区
域具有不同的内生真菌类群分布［12］。红豆杉的内生
真菌多样性丰富，到目前为止已从红豆杉属植物中
分离到不少不同种属的内生真菌（表 4）。与已报道
的南方红豆杉内生真菌比较，本研究首次从生长于
广东地区的南方红豆杉中分离获得了以往未见报道
的内生真菌，且菌株 A213、A220、A239、A241 与
GenBank 中最相似物种的相似率低，是否为新的种
属有待进一步研究。可见，从不同地理区域的南方
红豆杉中可以获得不同类群的内生真菌资源。
红豆杉内生真菌活性次级代谢产物的研究逐
渐被人们所重视，已成为研究抗肿瘤药物和其他药
物的重要资源。如从太平洋红豆杉植物内生真菌
Taxomyces andreanae 中分离得到的紫杉醇是一种活
性很好的抗微管蛋白聚合的药物，已经被开发成为
a、b、c、d ：菌株 A213、A220、A239、A241 在 PDA 平板上的培养特征 ；e、f ：菌株 A213 和 A241 的分生孢子
梗及分生孢子扫描电镜照片（bar=1 μm）；g、h ：菌株 A241 菌丝上的瘤状突起扫描电镜照片（bar=1 μm）
图 1 菌株形态特征
菌株 形态特征
A213 菌丝白色 絮状 稀疏 ；生长快 培养 3 d 后菌落直径为 6 cm ；生长后期菌落中央变成黄褐色 培养基中分泌有黄色色素 ；分生孢子梗
多级分枝 分生孢子着生于分生孢子梗的顶端 椭圆形 大小为（2.2 -3.2）μm ×（1.5 -1.8）μm （图 1-a、e）
A220 菌丝白色 致密 贴近培养基生长 ；生长慢 培养 7 d 后菌落直径为 1.5 cm ；生长后期 菌落表面有绿色的斑块 ；未观察到孢子 （图 1-b）
A239 菌丝薄 褐色 絮状 ；生长慢 培养 7 d 后菌落直径为 3 cm ；未观察到孢子 （图 1- c）
A241 菌丝厚而致密 墨绿色 ；生长非常缓慢 培养 7 d 后菌落只在接种点周围有少量生长 ；菌丝上有球形的瘤状突起 ；分生孢子长椭圆
形 光滑 着生于分生孢子梗顶端 单生 （图 1- d、f、g、h）
菌株编号
肿瘤细胞抑制率（％）
SF-268 NCI-H460 MCF-7
A210 19.0 12.5 25.2
A211 45.8 18.4 83.4
A212 25.2 15.8 24.2
A213 41.7 19.8 43.0
A216 30.1 10.9 16
A218 33.7 3.1 15.9
A219 7.8 24.3 18.6
A220 67.3 49.5 86.4
A221 28 8.2 56.1
A223 54.4 75.3 93.9
A224 33.9 9.5 22.9
A230 25.4 16.5 23.3
A233 13.5 8.8 31.2
A234 37.5 -1.5 41.8
A235 67.6 44.2 86.6
A237 22.9 -6.5 5.1
A238 40.4 0.1 8.8
A239 31.9 9.5 20.9
A240 63.6 68.5 97.7
A241 24.6 3.9 16.6
阳性对照 96.4 98.9 97.4
表 2 菌株 A213、A220、A239、A241 的形态特征
表 3 发酵粗提物细胞毒活性（作用浓度为 100 μg/mL）
顺铂作为阳性对照，作用浓度为 20 μg/mL
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期176
抗肿瘤药物应用于临床。此外，人们还从红豆杉属
植物中分离到能够产生抗肿瘤活性物质的其他真菌。
如王建锋［27］ 等从红豆杉皮层中分离到一株瘤座
孢（Tubercularia sp.），发现其发酵液提取物在体外
有较强的抗肿瘤活性 ；李桂玲［16］等从三尖杉、南
方红豆杉及香榧中分离到 172 株植物内生真菌，利
用 MTT 法对其进行活性检测表明，25 株内生真菌
对 KB 人口腔上皮癌或 HL-60 人白血病细胞具有显
著的抑制作用。本研究对 20 株内生真菌发酵粗提
物进行细胞毒活性研究，结果有 6 株对至少 1 种受
试肿瘤细胞株的抑制率在 50% 以上，占受试菌株总
数的 30%，其中菌株 A223 和 A240 对人乳腺癌细胞
MCF-7 的抑制率在 90％以上，值得对其活性次生代
谢产物进行深入研究。
4 结论
本研究首次从南方红豆杉中分离获得了球座菌
属、座腔菌属、炭角菌属、节菱孢属及长蠕孢属的
内生真菌，丰富了南方红豆杉内生真菌的种类和数
量 ；活性研究发现部分内生真菌的发酵粗提物具有
良好的细胞毒活性。
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（Cladosporium）、茎点霉属（Phoma）
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2001
拟青霉属、木霉属、被孢霉属、头珠霉属（Oedocephalum）、头孢霉属、腐霉属（Pythium）、枝孢霉属、明枝霉属
（Hyalodendron）、镰孢菌属（Fusarium）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）、阜孢霉属（Papularia）、丛梗孢属（Monilia）、
葡萄孢属（Botrytis）、拟小卵孢属（Ovulariopsis）、地霉属（Geotrichum）、毛霉属
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2002 腐殖霉属（Humicola）、无孢类群 ［18］
2006
青霉属（Penicillium）、拟青霉属、曲霉属（Aspergillus）、木霉属、小瘰座霉属（Strumella）、刺盘孢属（Colletotrichum）、
链格孢属（Alternaria）、无孢类群
［19］
2006 链格孢属 ［20］
2006 拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis） ［21］
2006 束丝菌属（Ozonium） ［22］
2007
无毛毛壳属（Achaetomium）、毛壳菌属（Chaetomium）、枝孢霉属、头孢霉属、青霉属、单端孢属（Trichothecium）、
曲霉属、镰孢菌属、单链孢属（Monocillium）、链格孢属、大茎点霉属（Macrophoma）、葡萄孢属、拟青霉属
［23］
2007 生赤壳属（Bionectria） ［24］
2007 镰孢菌属 ［25］
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表 4 部分南方红豆杉及其同属植物中的内生真菌
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（责任编辑 李楠）