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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
生 殖 干 细 胞（germline stem cells，GSC） 是 精
巢和卵巢中配子发生的中枢，GSC 的自我更新与分
收稿日期 ：2012-10-26
基金项目 ：河北省自然科学基金项目（C2012201049），教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目（20101301120006）
作者简介 ：刘静，女，硕士研究生，研究方向 ：昆虫分子进化 ；E-mail ：liujing_1987@yeah.net
通讯作者 ：周志军，男，博士，讲师，研究方向 ：直翅目昆虫分子进化与分子系统发生学 ；E-mail ：zhijunzhou@163.com
优雅蝈螽卵巢 Piwi 蛋白亚家族成员 Giwi cDNA 序列
全长的克隆与生物信息学分析
刘静  周志军  常岩林
（河北大学生命科学学院，保定 071002）
摘 要 ： 旨在进一步研究 piwi 基因在半变态昆虫干细胞自我更新和生殖系细胞发育中的作用。首先对实验室前期测定的优
雅蝈螽（Gampsocleis gratiosa）转录组数据进行搜索，成功挑选出 piwi 基因的同源体，命名为 giwi。通过设计特异性引物，采用巢
式 RT-PCR 和 RACE 末端扩增技术克隆获得该基因 cDNA 序列。序列分析表明，优雅蝈螽 giwi 基因 cDNA 序列全长为 3 462 bp，包
含 1 个完整的开放阅读框 2 742 bp，编码 913 个氨基酸，以及一个长度为 111 bp 的 5 端非编码区和 609 bp 的 3 端非编码区。预
测的理论蛋白分子量为 102.7 kD，等电点为 9.55。Giwi 蛋白具备 Piwi 蛋白亚家族全部特征，C 端的保守 PIWI 结构域，中部的保守
PAZ 结构域和 N 端可变结构域。同源比对分析得到 PIWI 结构域具有类似 RNA 酶 H 活性中心的 DDH 三联催化模体，暗示该蛋白
具有切割活性。系统发育分析指出昆虫的 Piwi 和 Aubergine 可能源于远古基因的重复事件。通过二代测序技术获得的转录组数据
可以很好地服务于未来的功能基因研究。
关键词 ： 优雅蝈螽 生殖干细胞 Piwi 转录组 cDNA 3D 结构
Full-long cDNA Sequence Cloning and Bioinformatic Analysis of Piwi
Subfamily Member Giwi in the Gampsocleis gratiosa Gonads
Liu Jing Zhou Zhijun Chang Yanlin
（College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002）
Abstract:  In order to further research the role of piwi in the stem cell self-renewal and germline development of hemimetabolous insect.
To obtain the full-length of piwi homolog giwi, we first picked out piwi homolog fragments in the Gampsocleis gratiosa transcriptome sequences,
which had been sequenced by our laboratory and not release to the public database, and then designed specific primers for nested RT-PCR
partial amplification and rapid amplification of cDNA ends（RACE）complete 5 and 3sequence. Sequences analysis showed that the full-long
of giwi gene cDNA is 3 462 bp, which consisted of a 2 742 bp open reading frame（ORF）encoding 913 amino acids, a 111 bp 5-untranslated
region（5UTR）and a 609 bp 3-untranslated region（3UTR）. The molecular weight of Giwi has been predicated to be about 102.7 kD and pI
9.55 in theory. Giwi contains the signature motifs of the piwi protein subfamily, including a C-terminal PIWI domain, a centrally located PAZ
domain, and an N-terminal variable domain. The homology blast analysis showed that there is a catalytic triad “Asp-Asp-His” motif in the PIWI
domain which is similar to the RNase H active center, implying possessing slicer activity of this protein. Phylogenetic analysis showed that
appearance of either Piwi or Aubergine in insect might due to an ancient gene duplication event. Transcriptome resources generated based on
next-generation sequencing can greatly benefit future gene cloning.
Key words:  Gampsocleis gratiosa Germline stem cell Piwi Transcriptome cDNA 3D structure
化在动物体内保持平衡，从而使 GSC 和成熟配子的
数量保持稳定［1］。关于 GSC 的研究在模式生物果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期112
蝇中最为深入。Piwi 基因广泛存在于各种多细胞生
物类群的干细胞之中。迄今为止，尚没有关于其在
半变态昆虫中研究的报道。Lin 和 Spradling［2］首先
在果蝇卵巢中发现 piwi 基因对 GSC 的分裂有调控作
用。随后，Cox 等［3，4］证明 piwi 基因在果蝇雌性和
雄性 GSC 中以自主方式表达并促进 GSC 分裂。Piwi
蛋白通过与 piRNA（Piwi-interacting RNA）结合形成
Piwi-piRNA 复合物引起基因沉默，进而对生殖细胞
进行调控［5-7］。目前在多种生物（如人、小鼠、斑
马鱼、线虫）中都有果蝇 piwi 基因的同源基因发现，
piwi 基因的突变可导致生殖细胞发育缺陷［4，8-12］。
虽然近年来已对多种昆虫的 piwi 同源基因进
行了研究［13，14］，但昆虫种类繁多，生殖方式多样，
生殖生理差异较大。已研究的果蝇、蜜蜂、家蚕均
为完全变态类昆虫，其卵巢管为滋养式（meroistic
type），piwi 基 因 在 生 殖 干 细 胞 龛（stem cell niche）
的端丝和冠细胞中均有表达［4］，piwi 基因突变导致
GSCs 过早丢失［15］。直翅目为不完全变态类昆虫，
其卵巢管是无滋式（panoistic type），卵子发生过程
中没有滋养细胞提供营养和信号［16］。无滋式的直
翅目昆虫卵巢是否存在调控 GSC 发育的因子，是否
存在 Piwi 蛋白同源物，GSC 发育的调控模式等尚无
报道。
优雅蝈螽（Gampsocleis gratiosa）隶属于昆虫纲
（Insecta）直翅目（Orthopter）螽斯总科（Tettigonoidea），
是直翅目重要的模式昆虫。本研究利用 piwi 基因主
要表达于生殖细胞的特点，通过转录组测序（RNA-
Seq）、RACE-PCR 及 相 关 生 物 信 息 学 技 术， 对 优
雅蝈螽雌性成虫卵巢中 piwi 同源基因及预测的蛋
白序列进行分析，为厘清无滋式卵巢管的原卵区
（germarium）内部细胞的组成及 GSC 龛模式在不完
全变态昆虫是否适用等问题提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试用的优雅蝈螽采自河北省顺平县（38 83 N，
115 13 E），将捕获的末龄若虫带回实验室内饲养至
成虫。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取 选取发育良好的优雅蝈螽雌
性成体，快速解剖取出卵巢置于含有 RNAiso Plus
（TaKaRa）的匀浆器中，充分研磨，进行总 RNA 提
取。具体操作依照 RNAiso Plus 试剂盒说明书进行，
提取获得的总 RNA 溶解于 RNase-free（TIANGEN）
无菌水中。
1.2.2 引物设计 通过对本实验室前期测得的优雅
蝈螽转录组数据进行搜索，筛选出与昆虫 piwi 基
因同源的序列片段。由于 piwi 基因序列全长接近 3
kb，因此将中间段序列分为 A、B、C 3 个互相重叠
的片段进行引物设计。利用 Primer Premier 5.0［17］软
件，共设计了 3 对中间段序列扩增引物（GAF/GAR，
GBF/GBR，GCF/GCR）和 4 条基因两端 RACE 引物
（G3F1，G3F2，G5F1，G5F2）（表 1），并交由上海
铂尚生物技术有限公司合成。
1.2.3 cDNA 第一条链合成 用 Oligo dT 引物对总
RNA（约 1 μg）进行反转录，具体操作依照 Prime-
Script® RT-PCR Kit（TaKaRa）试剂盒说明书进行。
1.2.4 piwi 基因中间段序列 RT-PCR 以反转录得
到的 cDNA 为模板，分别用 GAF/GAR，GBF/GBR，
GCF/GCR 引物对进行扩增。扩增程序 ：94℃预变
性 3 min ；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸
90 s，30 个循环 ；72℃延伸 10 min。
表 1 RACE-PCR 引物
引物名称 引物序列（5-3） 引物扩增区域
GAF GTGGCCGTCGACAGCTTAATT 中间段 A
GAR CCGACAGAGCTCTGGAACAAG
GBF GACCAGCCATTGCTACTTTCACG 中间段 B
GBR CCAAATTCTTCGCAAGGATCACT
GCF CTCCATCAAGAAGAAATGTTGTGTG 中间段 C
GCR ATCAAACCATCTCTCGTTACTCCTG
G3F1 ACAGTGCGTGTTCCAGCTCCT 3 端 RACE
G3F2 CCAGCTCCTTGTCAGTATGCC
G5R1 CACCAATCCGTATGAGTCTCCAATCT 5 端 RACE
G5R2 GGTCGTGTCCTAACTACCTCCAAAT
1.2.5 piwi 基 因 3/5 端 RACE-PCR 反 应 3RACE
依照 3-Full RACE Core Set Ver.2.0 试剂盒说明书对
总 RNA（约 1 μg）进行反转录。反应程序 ：42℃ 60
min，70℃ 15 min。以反转录得到的 cDNA 为模板，
用 G3F1 和 3 Outer Primer 及 G3F2 和 3 Inner Primer
分别进行 Outer PCR 扩增和 Inner PCR 扩增。反应
2013年第2期 113刘静等 ：优雅蝈螽卵巢 Piwi 蛋白亚家族成员 Giwi cDNA 序列全长的克隆与生物信息学分析
程序 ：94℃预变性 3 min ；94℃变性 30 s，55℃退火
30 s，72 ℃ 延 伸 1 min（Outer PCR 20 个 循 环 /Inner
PCR 30 个循环）；72℃延伸 10 min。5 RACE 依照
5-Full RACE Kit 试剂盒说明对总 RNA（约 2 μg）进
行去磷酸化、去帽子、5 RACE Adaptor 连接及反转
录反应。反应程序 ：30℃ 10 min，42℃ 1 h，70℃
15 min。以反转录得到的 cDNA 为模板，用 5 Outer
Primer 和 G5R1 及 5 Inner Primer 和 G5R2 分别进行
Outer PCR 和 Inner PCR 扩 增（ 以 上 Outer Primer 和
Inner Primer 均由 TaKaRa 公司试剂盒提供）。反应程
序同 3 RACE。
1.2.6 克隆及测序 RT-PCR 和 3/5 端 RACE-PCR
产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带经
DNA 片段凝胶回收试剂盒（北京三博远志）纯化、
回收后，连接到 pMD19-T 载体（TaKaRa）上，并转
化到大肠杆菌 DH5α 中。转化后生成的菌落，通过
蓝白斑筛选，随机选取 3 个阳性单克隆，交由上海
铂尚生物技术有限公司进行双向测序。
1.2.7 生物信息学及系统进化分析 测序结果经
Lasergene［18］ 软 件 校 对、 拼 接 获 得 cDNA 序 列 全
长。使用 NCBI 中的 ORFfinder 程序进行开放阅读框
（ORF）及基因两端非编码区预测并推导出相应的氨
基酸序列。运用 BioEdit［19］进行多重序列比对，寻
找 PIWI 结构域活性催化模体。蛋白质的理论分子量、
等电点及其它基本性质的分析采用 Prot Param［20］
进 行， 二、 三 级 结 构 分 别 通 过 PROSITE［21］ 和
Phyre2［22］ 软件进行预测。采用 MEGA5［23］软件基
于邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进化树。
2 结果
2.1 cDNA全长序列分析
将 测 序 所 得 序 列 片 段 进 行 剪 接， 得 到 全 长
3 462 bp 的 cDNA 序 列，GenBank 序 列 登 录 号 为
JX998175。该序列包含 2 742 bp 的开放阅读框，共
编码 913 个氨基酸残基，5 非编码区（5 UTR）111
bp 和 3 非编码区（3 UTR）609 bp。预测的理论蛋
白分子量为 102.7 kD，等电点为 9.55。Giwi 蛋白具
备 Piwi 蛋白亚家族全部特征，C 端的保守 PIWI 结
构域，中部的保守 PAZ 结构域和 N 端可变结构域
（图 1）。
2.2 序列比对及系统进化分析
从 NCBI 数据库中选取具有代表性的脊椎动物
和截止 2012 年 10 月 10 日登录的全部昆虫 Piwi 蛋白
亚家族序列，包括 ：斑马鱼 Danio rerio（NP_89918-
1.1、ABM46842.2）、 人 Homo sapiens（AAC97371.2、
AAK92281.1、BAC81341.1、BAC81343.1、BAC813-
42.1）、 小 鼠 Mus musculus（BAA93706.1、ABM691-
81.1、AAN75583.1）、大鼠 Rattus norvegicus（NP_00-
1102323.1）、 埃 及 伊 蚊 Aedes aegypti（XP_0016576-
26.1、XP_001652831.1、XP_001652945.1、XP_0016-
53082.1、XP_001663408.1、XP_001663409.1、XP_-
001663870.1）、切叶蚁 Acromyrmex echinatior（EGI6-
4222.1）、 意 大 利 蜜 蜂 Apis mellifera（ACV84372.1、
NP_001159378.1）、家蚕 Bombyx mori（NP_0010980-
67.2、NP_001098066.2、BAF73718.2）、弓背蚁 Cam-
ponotus floridanus（EFN67778.1）、致倦库蚊 Culex qu-
inquefasciatus（XP_001867947.1、XP_001844024.1、
XP_001844067.1、XP_001844068.1、XP_0018470-
30.1、XP_001860347.1、XP_001862491.1、XP_001-
867946.1）、黑腹果蝇 Drosophila melanogaster（ABO-
26294.1、ABO27430.1、AAD38655.1、AAD08705.1、
NP_476875.1）、大红斑蝶 Danaus plexippus（EHJ69-
790.1、EHJ75824.1）、印度跳蚁 Harpegnathos saltator
（EFN77932.1、EFN83189.1）、褐飞虱 Nilaparvata lu-
gens（AEI25513.1）、 人 虱 Pediculus humanus corporis
（XP_002431988.1）、 赤 拟 谷 盗 Tribolium castaneum
（EFA-02921.1、EFA07425.1）和优雅蝈螽 Gampsocl-
eis gratiosa 共 47 条。运用 BioEdit 进行多重序列比对
分析，得出 PIWI 结构域亦具有类似 RNA 酶 H 活性
中心的 DDH（Asp/Asp/His）三联催化模体（图 1），
3D 模型中可见 PAZ 结构域围成的袋状结构，DDH
催化位点深埋袋中（图 2）。
用黑腹果蝇 Drosophila melanogaster Ago1（NP_
725341.1）蛋白序列作为外群，采用 NJ 法构建分
子进化树。结果（图 3）显示，Piwi 蛋白亚家族聚
类形成两个大的分枝 A 和 B。分枝 A，由 28 条昆
虫 Piwi 和 Aubergine 蛋白组成，虽然又可进一步划
分为两个较小的分枝 I 和Ⅱ，但是这两个分枝与
Piwi 和 Aubergine 蛋白并不对应。例如 ：果蝇的 Piwi
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期114
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2452
2542
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2722
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3155
3274
3393
序列中部的浅灰色框标记片段为 PAZ 结构域，近 C 端的浅灰色框标记片段为 PIWI 结构域 ；PIWI 结构域中深
灰色标记的氨基酸残基为 PIWI 结构域的活性中心催化位点
图 1 优雅蝈螽 giwi 基因 cDNA 核苷酸序列和氨基酸序列
2013年第2期 115刘静等 ：优雅蝈螽卵巢 Piwi 蛋白亚家族成员 Giwi cDNA 序列全长的克隆与生物信息学分析
和 Aubergine 蛋白都位于分枝 I，而家蚕的 Piwi 和
Aubergine 蛋白，及本研究所获得 Giwi 蛋白均位于
分枝Ⅱ。分枝 B，由 7 条昆虫的 Ago3、2 条昆虫的
Piwi 蛋白及 11 条脊椎动物的 Piwi 蛋白组成，可进
一步划分为 3 个较小的分枝 III、IV 和 V。分枝 III
和 IV 分别由 8 条和 3 条脊椎动物的 Piwi 蛋白构成 ；
分枝 V 则由昆虫的 Ago3 和 2 条昆虫 Piwi 蛋白构成，
且与分枝 IV 形成姊妹群。
3 讨论
本研究预测所得 Giwi 蛋白为 Piwi 蛋白亚家族成
员。该家族蛋白进化保守，均含有 C 端的 PIWI 结
构域，中部的 PAZ 结构域和 N 端的可变结构域 ［24］。
PAZ 结构域是小 RNA 结合区域，PIWI 结构域具有
类似 RNA 酶 H 的 DDH 三联催化模体，是行使切割
功能的活性中心，与 piRNAs 的生成有密切关系［24， 25］。
通常认为含有活性 DDH 三联催化模体的 Piwi 蛋白
具有剪切活性或类剪切活性［24］。Giwi 蛋白亦含有
DDH 三联结构，暗示该蛋白具有切割活性。
Piwi 蛋白亚家族偏好表达于生殖系细胞，对生
殖干细胞的自我更新和生殖系发育起着重要的调控
作用［2，26］。该亚家族根据果蝇 Piwi 蛋白成员被分
为 三 类 ：Piwi、Aubergine 和 Ago3［27］。 然 而， 本 研
究系统发育分析发现，昆虫的 Piwi 和 Aubergine 在
进化树上位于相同的枝上，果蝇和家蚕的 Piwi 和
Aubergine 蛋白都没有按照物种差异区分开来。有报
道推测 piwi 和 aubergine 基因可能来源于远古基因的
重复事件［24］。脊椎动物的 Piwi 蛋白和昆虫的 Ago3
蛋白在进化树上亦没有明显的分开，Ⅴ号进化枝上
的 2 个昆虫 Piwi 蛋白指出该蛋白亚家族在命名过程
中可能存在问题，以上问题有待进一步的研究来加
以阐明。
随着分子生物学技术的发展，关于未知新基因
的 cDNA 全长的获得方法日新月异，包括基于构建
cDNA 文库法、基于通用简并引物的 RT-PCR 法和计
算机基因克隆法，又称硅片克隆、电子克隆［28］。构
建 cDNA 文库工作量较大，获得的序列片段长度有
限，且文库覆盖范围有限［29］。通用简并引物 PCR
法是根据数据库中已有物种序列设计简并引物进行
扩增，方便简单，但是由于个体内通常存在同一基
因家族的多个成员，而这些简并引物在基因上的位
置又经常位于该基因家族的结构域，因此，所获得
的测序结果往往是该基因家族的其他成员［30］。电子
克隆依靠电脑和网络资源，速度快、成本低是其最
大的优点，但电子克隆可依赖的 EST 序列有限，而
且这些序列由于测序丰度的限制，有些序列甚至仅
仅是单次测序结果，其精确性有待验证［31］。本研究
则在基于 454 高通量测序获得的转录组序列的基础
上，筛选感兴趣的目的功能基因，通过 RT-PCR 和
RACE 末端扩增技术克隆获得该基因的 cDNA 序列
全长。随着高通量测序平台的市场化，转录组测序
成本的进一步降低，转录组测序的研究方法在分子
生物学相关研究领域的应用会更加广泛。
4 结论
本研究以半变态昆虫优雅蝈螽为材料，通过对
二代测序获得的转录组数据进行搜索，成功挑选出
piwi 基因的同源体并对其进行研究，得到 giwi cDNA
序列全长。序列分析预测所得 Giwi 蛋白具备 Piwi 蛋
白亚家族全部特征。同源比对分析得到 PIWI 结构域
具有类似 RNA 酶 H 活性中心的 DDH 三联催化模体。
系统发育分析指出昆虫的 Piwi 和 Aubergine 可能源
于远古基因的重复事件，Piwi 蛋白亚家族在命名过
程中可能存在问题，以上问题有待进一步研究。
LEU611.CA
HIS888.CEI
GLY440.CA
ASP328.CA
ASP687.OD2
ASP758.CG
HIS899.CA
图 2 优雅蝈螽 Giwi 预测蛋白的 3D 结构
文字标示位点 ASP328、GLY440 和 LEU611、HIS899 分别代表 PAZ 和 PIWI
结构域的起始和终止位点。中部的 ASP687、ASP758 和 HIS888 为 PIWI 结
构域的三联催化模体
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期116
参 考 文 献
［1］ 冯振月 , 潘敏慧 , 鲁成 . 果蝇生殖腺干细胞和它们的微环境［J］.
细胞生物学杂志 , 2006, 28 ：169-172.
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［J］. Development, 1997, 124（12）：2463-2476.
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AaPIWI XP 001657626.173
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CqPIWI XP 001867947.1
CqPIWI XP 001862491.1
CqPIWI XP 001867946.1
CqPIWI XP 001860347.1
CqPIWI XP 001844068.1
CqPIWI XP 001844024.1
DmPIWI AAD08705.1
DmPIWI NP 476875.1
DmAUB AAD38655.1
NIAUB AEI25513.1
PhcPIWI XP 002431988.1
BmAUB NP 001098066.2
SIWI BAF73718.2BmPIWI
DpAUB EHJ75824.1
TcPIWI EFA07425.1
GIWIGgPIWI*
AmAUB NP 001159378.1
HsPIWI EFN83189.1
HsPIWI EFN77932.1
AePIWI EGI64222.1
CfPIWI EFN67778.1
HIWI AAC97371.2
HIWI AAK92281.1
MIWI ABM69181.1
RIWI NP 001102323.1
ZIWI NP 899181.1
HIWIL3 BAC81343.1
HIWI2 BAC81341.1
Miwi2 AAN75583.1
HILI BAC81342.1
MILI BAA93706.1
ZILI ABM46842.2
AmAGO3 ACV84372.1
BmAGO3 NP 001098067.2
DpAGO3 EHJ69790.1
TcAGO3 EFA02921.1
AaPIWI XP 001652945.1
CqPIWI XP 001847030.1
DmAGO3 ABO26294.1
DmAGO3 ABO27430.1
▲DmAGO1 NP 725341.1
CqPIWI XP 001844067.1
AaPIWI XP 001663408.1
AaPIWI XP 001652831.1
AaPIWI XP 001653082.1
AaPIWI XP 001663870.1
AaPIWI XP 001663409.1
ĉ
Ċ
ċ
Č
č
B
A
Aa：埃及伊蚊（Aedes aegypti），Ae：切叶蚁（Acromyrmex echinatior），Am：意大利蜜蜂（Apis mellifera），Bm：家蚕（Bombyx mori），Cf：弓背蚁（Camponotus
floridanus），Cq ：致倦库蚊（Culex quinquefasciatus），Dm ：黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），Dp ：大红斑蝶（Danaus plexippus），Hs ：印度
跳蚁（Harpegnathos saltator），Nl ：褐飞虱（Nilaparvata lugens），Phc ：人虱（Pediculus humanus corporis），Tc ：赤拟谷盗（Tribolium castaneum），
GIWI ：优雅蝈螽（Gampsocleis gratiosa），HIWI/HILI ：人（Homo sapiens），MIWI/MILI ：小鼠（Mus musculus），RIWI ：大鼠（Rattus norvegicus），
SIWI ：家蚕（Bombyx mori），ZIWI/ZILI ：斑马鱼（Danio rerio）
图 3 优雅蝈螽及其他 Piwi 亚家族蛋白的系统发育树
2013年第2期 117刘静等 ：优雅蝈螽卵巢 Piwi 蛋白亚家族成员 Giwi cDNA 序列全长的克隆与生物信息学分析
［8］ Kuramochi-Miyagawa S, Kimura T, Yomogida K, et al. Two mouse
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（责任编辑 马鑫）