全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
创伤弧菌（Vibrio vulnificus）为革兰氏阴性嗜盐
弧菌，普遍存在于江河口和沿海水域环境，鱼类、
虾类，以及贝母类等为主要易感水生动物［1］。该菌
是人兽共患病的重要病原，人通常因生食受污染的
海产品，或皮肤伤口接触受污染的海水或海洋动物
收稿日期 ：2013-10-23
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA020101，2012AA092001），宁波大学学科项目（xk11341）
作者简介 ：王耀焕，男，研究方向 ：生物技术 ；E-mail ：wangyaohuan5949@163.com
通讯作者 ：周前进，男，博士，讲师，研究方向 ：动物疫病诊断技术 ；E-mail ：mumu2325@163.com
环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测创伤弧菌
检测方法的建立
王耀焕  王瑞娜  周前进  陈炯
（宁波大学生物化学与分子生物学实验室，宁波 315211）
摘 要 ： 环介导等温扩增技术（LAMP）与横向流动试纸条（LFD）检测联合应用，建立了一种新的快速、便捷的创伤弧菌
检测方法。针对创伤弧菌的外膜蛋白 TolC 基因设计 6 条特异性引物和 1 条异硫氰酸荧光素（FITC）标记的探针。生物素标记的
LAMP 扩增产物能够特异性地与 FITC 标记的探针杂交，杂交产物经 LFD 检测。优化后的扩增温度和时间为 63℃反应 35 min，加
上细菌基因组 DNA 提取步骤，完成检测仅需要 80 min。LAMP-LFD 方法可特异性地检出创伤弧菌，对哈维氏弧菌等 9 种水产品常
见病原菌的检测均呈阴性 ；对纯细菌培养物的检测灵敏度为 3.7×102 CFU/mL 或 7.4 CFU/ 反应，是利用外引物建立的常规 PCR 检
测的 100 倍。结果表明，该方法能够准确、快速、灵敏地检出创伤弧菌，可应用于创伤弧菌污染的水产品的检测。
关键词 ： 创伤弧菌 外膜蛋白 TolC 基因 环介导等温扩增技术 横向流动试纸条检测
Rapid Detection of Vibrio vulnificus by Loop-mediated Isothermal
Amplification Combined with Lateral Flow Dipstick Assay
Wang Yaohuan Wang Ruina Zhou Qianjin Chen Jiong
（Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology，Ningbo University，Ningbo 315211）
Abstract:  A novel and rapid loop-mediated isothermal amplification（LAMP）combined with chromatographic lateral flow dipstick（LFD）
assay was developed to detect Vibrio vulnificus. A set of six primers and a fluorescein isothiocyanate（FITC）-labeled probe that recognized V.
vulnificus outer membrane protein TolC gene were designed. Biotinylated LAMP amplicons were hybridized exclusively with the FITC-labeled
probe and detected by LFD assay. The assay was optimized and could detect V. vulnificus by incubation at 63℃ for only 35 min, and the whole
detection procedure from extraction of bacterial genomic DNA to the visualization of the amplicons by LFD last 80 min. V. vulnificus could be
accurately detected by LAMP-LFD, and no amplification could be observed when another 9 bacterial genomic DNA were used. The sensitivity for
V. vulnificus detection in pure culture was 3.7×102 CFU/mL or equivalent to 7.4 CFU per reaction, which is 100 times higher than that of PCR
assay. The results indicate that LAMP-LFD is an accurate, rapid and sensitive tool for V. vulnificus detection and can be used for detection of V.
vulnificus in contaminated aquatic foods.
Key words:  Vibrio vulnificus Outer membrane protein TolC gene Loop-mediated isothermal amplification Lateral flow dipstick
assay detection
而感染。感染该菌可导致患者出现原发性败血症、
创伤感染、急性胃肠炎和蜂窝织炎等临床症状［2，3］。
每年美国与海产品相关的死亡事件中 95% 是由于感
染了创伤弧菌［4，5］，众多水产品中，牡蛎是创伤弧
菌最重要的传染源，为防治该病，加利福尼亚州特
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期82
地于 2003 年颁布法令禁止生牡蛎销售，取得明显防
治效果［6］。在我国，创伤弧菌感染多发生于沿海地区，
被列为食品污染源八大高危微生物之一［7-9］。因此，
建立一种快速、准确而又适用于临床的检测方法对
于有效诊断创伤弧菌感染，监测水产品污染具有重
要的实际应用价值。
传统的创伤弧菌诊断主要通过病原分离与生化
鉴定完成，但其存在细菌培养繁琐，检测周期长，
不易鉴别相近物种或亚型等缺点［10］。随着分子生物
学检测技术的发展，以溶血素基因（Hemolysin）［11］、
DNA 回 旋 酶 B 亚 基（gyrB）［12，13］、toxR 基 因［14］、
RNA 聚合酶 σ 亚基因子 S（rpoS）［15］等为靶标建立
的常规 PCR 或实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）技术
已成功应用于创伤弧菌的实验室诊断，具有灵敏度
高，检测时间短等优点，但该方法必须配备昂贵的
仪器设备，需专门的操作人员。
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal
amplification，LAMP）是由日本学者 Notomi 发明的
一种新式恒温核酸扩增技术［16］，相对于 PCR 相关
检测技术，具有检测时间更短，仪器依赖性小等优
点，具有应用于现场疫源地检测的巨大潜力。LAMP
反应产物可通过琼脂糖凝胶的方法进行判定，但该
方法存在操作过程易污染，易出现假阳性的缺点。
LAMP 与横向流试纸（Lateral flow dipstick，LFD）技
术联用（LAMP-LFD），使 FITC 标记的探针与生物
素标记的 LAMP 扩增产物进行特异性杂交，不仅可
避免非特异性扩增引起的假阳性，大幅提高检测灵
敏度，还能避免因琼脂糖凝胶电泳等检测手段引起
的体系污染问题［17，18］。该方法亦无需特殊设备，不
需与 EB 等有毒试剂接触，操作更加便捷和安全。
本研究根据创伤弧菌外膜蛋白 TolC 基因的保守
性区域设计特异性引物和探针，优化反应条件，建
立 LAMP-LFD 技术，旨在将该方法应用于水产品中
创伤弧菌的检测。
1 材料与方法
1.1 材料
创 伤 弧 菌（Vibrio vulnificus ATCC 27562）、 哈
维 氏 弧 菌（Vibrio harveyi ATCC 33866）、 河 流 弧 菌
（Vibrio fluvialis ATCC 33809）购自中科院水生生物
研究所 ；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus ATCC
33847）由浙江省疾控中心惠赠 ；轮虫弧菌（Vibrio
rotiferianus DSM 17186T）由宁波大学海洋学院张德
民 教 授 惠 赠 ；溶 藻 弧 菌（Vibrio alginolyticus ATCC
17749）、 鳗 弧 菌 香 鱼 分 离 株（Vibrio anguillarum
ayu-H080701）［19］、 嗜 水 气 单 胞 菌（Aeromonas
hydrophila Ah0201）由本实验室保存 ；金黄色葡萄球
菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）、单增李斯特
菌（Listeria monocytogenes ATCC 19115）购自广东省
微生物菌种保藏中心。
1.2 方法
1.2.1 细菌培养和基因组 DNA 提取 试验中使用的
弧菌划线接种于 TCBS 固体培养基上，28℃过夜培
养后，挑取单菌落于碱性蛋白胨水中震荡培养至所
需浓度 ；嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌，以及单
增李斯特菌划线接种于 BHI 固体培养基上，37℃过
夜培养后，挑取单菌落于 LB 或 BHI 培养基中震荡
培养至所需浓度。
细菌基因组 DNA 的提取采用水煮法完成，主
要步骤为 ：取 1 mL 细菌的液体培养悬液于 1.5 mL
离心管中，12 000 r/min 离心 2 min，弃上清 ；使用
100 μL 细菌裂解液（Tris-HCl 0.1 mol/L，蛋白酶 K
0.2 μg/μL，Triton X-100 2.0%）充分悬浮细菌，沸水
浴 10 min，立即冰浴 7 min ；重复上一步操作 1 次 ；
12 000 r/min 离心 2 min，取上清用作 LAMP 和 PCR
扩增的模板，-30℃贮存备用。
1.2.2 引物设计 根据 NCBI 上公布的创伤弧菌外
膜 蛋 白 TolC 基 因（ 登 录 号 ：DQ296643）， 设 计 用
于 LAMP 扩增的外引物 TolC-F3、TolC-B3，内引物
TolC-FIP、TolC-BIP， 以 及 环 引 物 TolC-LF、TolC-
LB 等 6 条 特 异 性 引 物， 同 时 合 成 TolC-HP 探 针 1
条，用于 LFD 的杂交试验（表 1，图 1）。在内引物
TolC-FIP 的 5 端 标 记 生 物 素， 在 TolC-HP 的 5 端
标记异硫氰酸荧光素。以上引物和探针由英潍捷基
（上海）贸易有限公司合成。其中，外引物 TolC-F3、
TolC-B3 同时用作 PCR 扩增的特异性引物，扩增的
预期片段大小约为 308 bp。
1.2.3 LAMP 扩增条件的确立 选用创伤弧菌基因
组 DNA 的 2 个浓度（经平板计数法测定，较高模板
2014年第6期 83王耀焕等 ：环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测创伤弧菌检测方法的建立
浓度相当于 3.7×107 CFU/mL，较低模板浓度相当于
3.7×104 CFU/mL）作为模板优化扩增条件。LAMP
反应体系为 25 μL，包括 Tris-HCl 20 mmol/L（pH 8.8），
MgSO4 6.5 mmol/L，KCl 10 mmol/L，（NH4）2SO4
10 mmol/L，Triton X-100 0.1%， 甜 菜 碱 1.6 mol/L，
dNTPs 1.4 mmol/L，外引物 TolC-F3 和 TolC-B3 各 0.2
μmol/L，内引物 TolC-FIP 和 TolC-BIP 各 1.6 μmol/L，
环 引 物 TolC-LF 和 TolC-LB 各 0.4 μmol/L，Bst DNA
聚合酶（New England BioLabs，美国）8 U，创伤弧
菌基因组 DNA 模板 2 μL。阴性对照不加任何模板
DNA。反应混合物在一定温度下温育后，经 80℃热
激 5 min 终止反应，利用 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳
检测产物。分别以上述较高浓度和较低浓度的基因
组 DNA 为模板，选择 10、20、35、50 和 65 min 作
为扩增反应时间 65℃恒温下进行扩增，根据扩增效
果确定最佳反应时间 ；分别在 61、62、63、64 和
65℃下进行温育至筛选的最佳反应时间，根据扩增
效果确定适宜的反应温度。
1.2.4 利用横向流动试纸条（LFD）检测 检测所用
试纸条购自 Milennia Biotec GmbH（Milenia GenLine
HybriDetect by Milenia Biotec GmbH，Germany，
http ：//www.milenia-biotec.de/），可通过其检测线上
标记的生物素抗体与生物素标记的 LAMP 扩增产物
特异性结合完成检测。利用优化后的 LAMP 反应体
系，使用经生物素标记的内引物 TolC-FIP-biotin 进
行 LAMP 扩增反应 ；反应结束时不经过终止反应，
而将 20 pmol 的 FITC 标记的 DNA 探针 TolC-HP 加入
到反应液中，63℃杂交 5 min ；取 5 μL 杂交液加入
到 100 μL buffer 中混匀 ；将 LFD 试纸条浸入 buffer
溶液中 3-5 min，肉眼判断结果。
1.2.5 LAMP-LFD 的特异性试验 选择水产品中的
常见病原菌用于 LAMP-LFD 的特异性试验，除创伤
弧菌外，还包括哈维氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、
轮虫弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、金
黄色葡萄球菌及单增李斯特菌等 9 种。分别利用 1.5%
的琼脂糖凝胶电泳和 LFD 检测扩增结果。
1.2.6 LAMP-LFD 的灵敏度测定 将创伤弧菌的原
始菌液（相当于 3.7×109 CFU/mL）进行连续 10 倍
浓度梯度稀释，按水煮法提取基因组 DNA，并以此
为模板，利用优化的 LAMP 反应体系进行扩增。分
表 1 根据创伤弧菌外膜蛋白 TolC 基因序列设计的 LAMP-LFD 扩增引物序列和探针
引物 类型 长度 序列（5-3）
TolC-F3 上游外引物 19-mer TCTTGAAGCCACTTATCGC
TolC-B3 下游外引物 20-mer CAGCATCAACATCCAGTACA
TolC-FIP-biotin （F1c+TTTT+F2）上游内引物 43-mer（F1c ：21-mer，F2 ：18-mer） TACCAACATCAAAGCCCGCTTttttCGTGCGTATGAGCAATCT
TolC-BIP （B1c+TTTT+B2）下游内引物 44-mer（B1c ：18-mer，B2 ：22-mer） GATGCCACTCGTCGCCTTttttGCAGTACACTCAAGATGTAGTT
TolC-LF 上游环引物 21-mer GGTTGCTTCTAATGCTGAACG
TolC-LB 下游环引物 19-mer AACCTATCGAATGCACGCT
TolC-HP-FITC 杂交探针 21-mer GGTACTCGTACTATTGTGGAT
993
1045
1097
1149
1201
1253
1305
下划线 ：LAMP-LFD 试验的引物 ；方框 ：杂交探针 ；TolC-B1c、TolC-B2c、TolC-B3c 是下游引物 TolC-B1、TolC-B2、TolC-B3 的互补序列
图 1 创伤弧菌外膜蛋白 TolC 基因的 LAMP-LFD 引物序列和探针设计示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期84
别 利 用 1.5% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 LFD 检 测 扩 增 结
果。同时，在相同模板浓度下，以外引物 TolC-F3
和 TolC-B3 为特异性引物，进行 PCR 扩增。PCR 反
应体系为 25 μL，包括 ：10×PCR buffer 2.5 μL，Taq
DNA 聚 合 酶（5 U/μL）（TaKaRa， 日 本 ）0.15 μL，
dNTPs（2.5 mmol/μL）2 μL，TolC-F3（10 pmol/μL）
1 μL，TolC-B3（10 pmol/μL）1 μL，基因组 DNA 模
板 2 μL。PCR 反 应 程 序 ：94℃ 3 min ；94℃ 30 s，
54℃ 30 s，72℃ 30 s，30 个循环 ；72℃ 10 min。扩
增产物利用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.7 LAMP-LFD 的重复性试验 重新挑取创伤弧
菌的单菌落，培养后获取新鲜创伤弧菌原始菌液，
经平板计数后，连续 10 倍浓度梯度稀释至 LAMP-
LFD 检测的最低浓度，平行制备 3 个样品，按水煮
法提取基因组 DNA，并以此为模板，利用优化的
LAMP 反应体系进行扩增，验证该方法的可重复性。
2 结果
2.1 LAMP扩增条件的确立
以较高浓度基因组 DNA（3.7×107 CFU/mL）为
模板 65℃恒温扩增时，反应 10 min 即可检测到明显
扩增 ；反应 20 min，扩增产物浓度几乎达到最高值，
延长反应时间，扩增产物浓度不再出现明显提高（图
2-A）。以较低浓度基因组 DNA（3.7×104 CFU/mL）
为模板 65℃恒温扩增时，反应 10 min 未能检测到明
显扩增 ；反应 20 min，可检测到明显扩增 ；反应 35
min，扩增产物浓度几乎达到最高值，延长反应时间，
扩增产物浓度不再出现明显提高（图 2-B）。为保证
样品检测时，在较低模板浓度下仍尽可能地检出病
原，选择 LAMP 扩增的最佳反应时间为 35 min。
为确定最适反应温度，以较低浓度基因组 DNA
（3.7×104 CFU/mL）为模板，分别使用 61、62、63、
64 和 65℃ 5 个不同温度进行恒温扩增 35 min。5 个
反应温度下均检测到明显的特异性扩增，而不添加
任何 DNA 模板的反应管中未检测到扩增，反应温度
为 63℃时，特异性扩增中出现的梯形条带最为清晰
（图 3），因此选定 63℃为最适反应温度。最终确定
63℃反应 35 min 为最适反应条件。
2.2 LAMP-LFD检测与特异性试验结果
按优化的 LAMP 反应体系，换用生物素标记的
内引物 TolC-FIP-biotin 进行 LAMP 扩增反应。反应
产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测发现，以创伤弧菌
基因组 DNA 为模板的反应管可出现特征性的梯形条
带，其他 9 株病原菌的反应管中未见明显扩增（图
4-A）。反应产物经 LFD 检测发现，以创伤弧菌基因
组 DNA 为模板的反应产物可使试纸条的检测线位置
出现明显的阳性条带，其他 9 株病原菌的反应产物
在试纸条的检测线位置未出现条带（图 4-B）。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
B
A ：较高基因组 DNA 浓度（相当于 3.7×107 CFU/mL）；B ：较低基因组 DNA
浓度（相当于 3.7×104 CFU/mL）；M ：100 bp Plus DNA ladder ；1，2 ：反应
时间为 10 min ；3，4 ：反应时间为 20 min ；5，6 ：反应时间为 35 min ；7，8 ：
反应时间为 50 min ；9，10 ：反应时间为 65 min。其中，1，3，5，7，9 ：以
无菌去离子水作为模板 ；2，4，6，8，10 ：以不同浓度的创伤弧菌基因组
DNA 作为模板
图 2 LAMP 反应时间的确立
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
M ：100 bp Plus DNA ladder ；1，2 ：反应温度为 61℃ ；3，4 ：反应温度为
62℃ ；5，6 ：反应温度为 63℃ ；7，8 ：反应温度为 64℃ ；9，10 ：反应温度
为 65℃。其中，1，3，5，7，9 ：以无菌去离子水作为模板 ；2，4，6，8，
10 ：以创伤弧菌基因组 DNA（3.7×104 CFU/mL）作为模板
图 3 LAMP 反应温度的确立
2014年第6期 85王耀焕等 ：环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测创伤弧菌检测方法的建立
2.3 LAMP-LFD的灵敏度测定
创伤弧菌原始菌液（相当于 3.7×109 CFU/mL）
进行连续的 10 倍浓度梯度稀释后，分别采用水煮
方法提取其基因组 DNA。以不同浓度的基因组 DNA
为模板进行的 LAMP-LFD 结果显示，反应产物经 1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测的最低模板浓度为原始浓度的
10-7 倍， 即 3.7×102 CFU/mL 或 7.4 CFU/ 反 应（ 图
5-A）；反应产物经试纸条（LFD）检测的最低模板
浓度与电泳检测结果一致，即 3.7×102 CFU/mL 或 7.4
CFU/ 反应（图 5-B）。而以同批次的基因组 DNA 为
模板进行 PCR 扩增，可检测的最低模板浓度为原始
浓度的 10-5，即 3.7×104 CFU/mL 或 740 CFU/ 反应（图
5-C）。因此，LAMP-LFD 方法的灵敏度是利用外引
物 TolC-F3、TolC-B3 建立的常规 PCR 方法的 100 倍。
2.4 LAMP-LFD的重复性分析
获取 3 个新鲜的创伤弧菌原始菌液样品，经平
板计数后，连续的 10 倍梯度稀释至最低检测浓度
（约为 3.7×102 CFU/mL），利用水煮方法提取基因组
DNA，以此为模板进行 LAMP-LFD 扩增，反应产物
经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳和 LFD 检测均可获得明显
的阳性结果（图 6），说明该方法可重复，稳定性好。
3 讨论
创伤弧菌属于沿海海洋环境中的自然菌群之
一，海水、海洋沉积物和各种水产品中均可分离获
得，尤以牡蛎感染率最高，由于该病原可感染人，
导致患者出现严重的原发性败血症和坏死性创伤感
染，因此建立快速、准确的检测技术，有效检测海
产品中创伤弧菌的污染具有重要的公共卫生学意义。
本研究选择创伤弧菌外膜蛋白 TolC 基因作为检测靶
标，成功建立了 LAMP-LFD 技术。从提取细菌基因
组 DNA 到结果判读，整个检测过程仅需 80 min，包
括扩增反应 35 min，扩增产物 LFD 显色 10 min。
基于分子生物学的检测手段中，常规 PCR 技
MA
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
䍘᧗㓯
Ự⍻㓯
M ：100 bp Plus DNA ladder ；1 ：以无菌去离子水作为模板 ；2 ：以创伤弧菌
基因组 DNA 为模板 ；3-11 ：分别以哈维氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、
轮虫弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌及单增李
斯特菌的基因组 DNA 为模板
图 4 LAMP（A）和 LAMP-LFD（B）特异性分析
MA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10B
䍘᧗㓯
Ự⍻㓯
M ：100 bp Plus DNA ladder ；1 ：以无菌去离子水作为模板 ；2-10 ：创伤弧
菌原始菌液（3.7×109 CFU/mL）的 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、
10-7 及 10-8 倍菌液提取的基因组 DNA 作为模板
图 5 LAMP（A）、LAMP-LFD（B）和 PCR（C）检测
的灵敏度比较
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期86
术最早应用于创伤弧菌检测［11］；依赖于 TaqMan 探
针的 RT-qPCR 技术亦应用于创伤弧菌的实验室诊
断［14， 15］。这些技术均需以较为昂贵的仪器设备为
依托，尤其 RT-qPCR 技术对仪器设备、试剂，甚
至操作环境要求较高，必须由专业人员操作，难以
在多数基层检测机构或现场疫源地推广。LAMP 检
测技术具有设备依赖性小、特异性和灵敏度高等
优点，已广泛应用于水产疾病检测［20-23］。在此基
础上发展起来的 LAMP-LFD 技术，可有效避免因
LAMP 非特异性扩增引起的假阳性问题，使得检测
结果更加准确可信，已得到越来越多科技工作者的
青睐［17， 18， 24， 25］。本研究建立的 LAMP-LFD 技术可
检出的创伤弧菌最低浓度为 3.7×102 CFU/mL，即
7.4 CFU/ 反应，检测灵敏度是利用外引物 TolC-F3、
TolC-B3 建立的常规 PCR 方法的 100 倍。Han 等［26］
以创伤弧菌的溶血素 vvhA 基因作为检测靶标，建立
了可特异性检测创伤弧菌的 LAMP 方法，灵敏度达
到了 20 CFU/mL ；Hossain 等［27］ 针对 groEL 基因建
立了可同时检测创伤弧菌和霍乱弧菌的双重 PCR 技
术，针对创伤弧菌的检测灵敏度达到了 50 CFU/ 反
应。本研究利用 LFD 法的检测灵敏度与琼脂糖凝胶
电泳分析的结果一致，但 LAMP-LFD 法可在扩增反
应结果后的 10 min 内完成结果判断，简化了检测流
程，而且能够避免因电泳检测引起的体系污染问题。
特异性试验表明，该方法能特异性地检测创伤弧菌，
而对哈维氏弧菌等其他常见水产病原菌的检测呈
阴性。
4 结论
以创伤弧菌外膜蛋白 TolC 基因为靶标建立的
LAMP-LFD 技术，能够快速、准确地检测创伤弧菌，
检测灵敏度达到 7.4 CFU/ 反应，仪器需求简单，可
满足基层检测机构和现场疫源地检测的需要。
参 考 文 献
［1］ Jones MK, Oliver JD. Vibrio vulnificus ：disease and pathogenesis
［J］. Infection and Immunity, 2009, 77 ：1723-1733.
［2］ Daniels NA. Vibrio vulnificus oysters ：pearls and perils［J］. Clin
Infect Dis, 2011, 52 ：788-792.
［3］ Dechet AM, Yu PA, Koram N, Painter J. Nonfoodborne Vibrio infec-
tions ：an important cause of morbidity and mortality in the United
States, 1997-2006［J］. Clin Infect Dis, 2008, 46 ：970-976.
［4］ CDC. Vibrio vulnificus. National center for emerging and zoonotic
infectious diseases, 2009.（Retrieved on 20 of May from http ：//
www.cdc.gov/nczved/ divisions/dfbmd/diseases/vibriov/）.
［5］ Mead PS, Slutsker L, Griffin PM, Tauxe RV. Food-related illness and
death in the united states reply to dr. hedberg［J］. Emerg Infect
Dis, 1999, 5 ：841-842.
［6］ Vugia DJ, Tabnak F, Newton AE, et al. Impact of 2003 state regula-
tion on raw oyster-associated Vibrio vulnificus illnesses and deaths,
California, USA［J］. Emerg Infect Dis, 2013, 19 ：1276-1280.
［7］ 马骢 , 郭建巍 , 郝秀红 , 等 . 中国海域分离的创伤弧菌的致病
性及其对抗生素的敏感性研究［J］. 第四军医大学学报 , 2009,
30（6）：493-496.
［8］ 孙智夫 , 翁永夫 , 耿晓冬 , 谢优凤 . 舟山市市售生食海产品中
创伤弧菌污染现状研究［J］. 中国预防医学杂志 , 2013, 14（3）：
179-182.
［9］ 朱海明 , 严纪文 , 宋曼丹 , 等 . 广东省部分海产品中创伤弧菌
的污染监测［J］. 华南预防医学 , 2011, 37（4）：78-80.
［10］ O’Hara CM, Sowers EG, Bopp CA, et al. Accuracy of six
MA 1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6B
䍘᧗㓯
Ự⍻㓯
M ：100 bp Plus DNA ladder ；1，3，5 ：以无菌去离子水作为模板 ；
2，4，6 ：最低检测浓度（3.7×102 CFU/mL）的创伤弧菌菌液提取
基因组 DNA 作为模板
图 6 LAMP（A）和 LAMP-LFD（B）的重复性试验
2014年第6期 87王耀焕等 ：环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测创伤弧菌检测方法的建立
commercially available systems for identification of members of the
family vibrionaceae［J］. J Clin Microbiol, 2003, 41 ：5654-5659.
［11］ Brauns LA, Hudson MC, Oliver JD. Use of the polymerase chain
reaction in detection of culturable and nonculturable Vibrio
vulnificus cells［J］. Appl Environ Microbiol, 1991, 57 ：2651-
2655.
［12］ Kumar HS, Parvathi A, Karunasagar I. A gyrB-based PCR for the
detection of Vibrio vulnificus and its application for direct detection
of this pathogen in oyster enrichment broths［J］. Int J Food
Microbiol, 2006, 111 ：216-220.
［13］ Parvathi A, Kumar HS, Karunasagar I. Study of the occurrence
of Vibrio vulnificus in oysters in India by polymerase chain
reaction（PCR）and heterogeneity among V. vulnificus by
randomly amplified polymorphic DNA PCR and gyrB sequence
analysis［J］. Environ Microbiol, 2005, 7 ：995-1002.
［14］ Takahashi H, Hara-Kudo Y, Miyasaka J, et al. Development of a
quantitative real-time polymerase chain reaction targeted to the
toxR for detection of Vibrio vulnificus［J］. J Microbiol Methods,
2005, 61 ：77-85.
［15］ Kim DG, Ahn SH, Kim LH, et al. Application of the rpoS gene
for species-specific detection of Vibrio vulnificus by real-time
PCR［J］. J Microbiol Biotechnol, 2008, 18 ：1841-1847.
［16］ Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated
isothermal amplification of DNA［J］. Nucleic Acids Res, 2000,
28 ：E63.
［17］ Ding WC, Chen J, Shi YH, et al. Rapid and sensitive detection
of infectious spleen and kidney necrosis virus by loop-mediated
isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick［J］.
Arch Virol, 2010, 155 ：385-389.
［18］ 董培培 , 李长红 , 丁文超 , 等 . 环介导等温扩增技术与横向流
动试纸条法快速检测鳗利斯顿氏菌的研究［J］. 水产科学 ,
2011, 30（2）：63-68.
［19］ 李长红 , 陈炯 , 史雨红 , 李明云 . 宁海地区香鱼弧菌病病原
菌鉴定［J］. 微生物学报 , 2009, 49（7）：931-937.
［20］ 丁文超 , 胡健饶 , 史雨红 , 等 . 环介导恒温扩增技术快速检测
溶藻弧菌［J］. 分子细胞生物学报 , 2009, 42（1）：70-76.
［21］ 李明云 , 丁文超 , 陈炯 , 史雨红 . 环介导恒温扩增技术快速检
测对虾白斑综合征病毒方法的建立［J］. 农业生物技术学报 ,
2011, 19（1）：186-190.
［22］ 彭帅 , 石磊 . 环介导恒温扩增法快速检测海产品中的副溶血
弧菌［J］. 生物技术通报 , 2011（2）：184-186.
［23］ 张金凤 , 曾令兵 , 张辉 , 等 . 草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等
温扩增（RT-LAMP）检测方法的建立［J］. 中国水产科学 ,
2013, 20（1）：129-136.
［24］ Kaewphinit T, Arunrut N, Kiatpathomchai W, et al. Detection of
Mycobacterium tuberculosis by using loop-mediated isothermal
amplification combined with a lateral flow dipstick in clinical
samples［J］. Biomed Res Int, 2013, 2013 ：926230. doi ：
10.1155/2013/926230.
［25］ Khunthong S, Jaroenram W, Arunrut N, et al. Rapid and sensitive
detection of shrimp yellow head virus by loop-mediated isothermal
amplification combined with a lateral flow dipstick［J］. J Virol
Methods, 2013, 188 ：51-56.
［26］ Han FF, Ge BL. Evaluation of a loop-mediated isothermal
amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in Raw Oysters.
Foodborne Pathog Dis, 2008, 5（3）：311-320.
［27］ Hossain MT, Kim YR, Kim EY, et al. Detection of Vibrio cholerae
and Vibrio vulnificus by duplex PCR specific to the groEL
gene［J］. Fish Sci, 2013, 79 ：335-340.
（责任编辑 狄艳红）