全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
收稿日期 ：2012-06-26
基金项目 ：国家质检总局公益项目（200910132），国家质检总局科研专项（2012IK266）
作者简介 ：邓俊花，女，硕士，助理研究员，研究方向 ：动物检疫科研工作 ；E-mail ：dengqifei-198825@163.com
通讯作者 ：吴绍强，男，博士，研究员，研究方向 ：动物检疫管理及科研工作 ；E-mail ：sqwu@sina.com
裂谷热（Rift valley fever，RVF）是由蚊子作为
传染媒介的病毒性传染病，主要感染反刍动物，如
绵羊、山羊和牛，可引起怀孕动物流产和幼小动物
死亡［1］。在疫病流行期间，也会引起人类发病。世
界动物卫生组织（OIE）将其列为法定上报的 A 类
动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。历史上，
裂谷热主要在非洲撒哈拉以南地区流行，2000 年 8
月向北蔓延到亚洲的阿拉伯半岛（也门和沙特阿拉
伯），对我国构成了严重威胁［2］。
裂谷热假病毒颗粒研制及鉴定
邓俊花  林祥梅  张永宁  冯春燕  王彩霞  吴绍强
（中国检验检疫科学研究院，北京 100029）
摘 要 ： 裂谷热是危害严重的人畜共患病，为了给该病的分子生物学检测提供 RNA 阳性质控品，制备了裂谷热假病毒颗粒
并进行了检测和验证。将 pGEM-T-RVF 质粒与假病毒载体 p-MS2 质粒分别进行 Pst I 和 Hind Ⅲ双酶切，然后连接构建 p-MS2-RVF
重组质粒。将 p-MS2-RVF 重组菌进行表达、酶消化及盐沉淀后纯化假病毒颗粒，在特性检测的基础上，借助荧光 RT-PCR 方法进
行鉴定。结果表明，裂谷热假病毒颗粒耐核酸酶，室温至少保持 1 个月，稳定，易运输；荧光 RT-PCR 检测表明最低可达到 4.25×102
copies 检测限。构建的裂谷热假病毒颗粒将为裂谷热分子生物学检测提供阳性质控物质。
关键词 ： 裂谷热 假病毒颗粒 鉴定
The Development and Identification of Rift Valley Fever
Virus-like Particles
Deng Junhua Lin Xiangmei Zhang Yongning Wang Caixia Feng Chunyan Wu Shaoqiang
（Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029）
Abstract:  It was to develop Rift valley fever（RVF）virus-like particles（VLPs）to effectively offer positive material for molecular
biological detection. pGEM-T-RVFV plasmid and p-MS2 were individually digested with both Pst I and Hind Ⅲ , and then purified ligated to
generate recombinant plasmid p-MS2-RVFV. The plasmid was cotransformed into E. coli. DH5α cell and induced with IPTG, incubated with
RNase A and DNase I, and then subsided with salt to obtain the rough-wrought virus-like particles. The method of gradient centrifugation was
used to prepared rarefied virus-like particles which was determined for characteristic property. The puried particles were verified by Real-time
RT-PCR. Results showed that the rarefied virus-like particles were able to endure RNase A, saved at any rate one month under subzero climatic
condition, which indicated that the virus-like particles were stable and were simple transported；it indicated that the VLPs could attain a minimum
detectable limit of 4.25×102 copies. The construction of virus-like particles could provide positive material for RVF molecular detection.
Key words:  Rift valley fever virus（RVFV） Virus-like particles（VLPs） Identification
为了有效监控并防止裂谷热疫情的传播，Sall
等［3，4］建立了裂谷热的巢式 RT-PCR 检测方法，并
在肯尼亚（1998 年）及南非（1999 年）的两次疫情
诊断中发挥了重大作用。Drosten 等［5，6］建立了裂
谷热一步法实时定量 RT-PCR 检测方法。但由于安
全有效阳性质控物质的缺乏，导致上述检测技术难
以在非疫区推广应用。近几年，Pasloske 等［7，8］提
出了一种新的 RNA 质控品制备技术，即装甲 RNA
（Armored RNA）技术，利用该技术制备的假病毒
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期136
颗粒稳定、安全，并能有效监控 RNA 样品核酸制
备 及 RT-PCR 反 应 的 全 过 程。 病 毒 样 颗 粒（Virus
like particle，VLP）是含有某种病毒的一个或多个
结构蛋白的空心颗粒，不含病毒核酸，不能自主复
制，但可以组装成颗粒样结构，其结构和抗原表位
与天然的病毒颗粒十分相似，具有较强的免疫原性
及较好的安全性。在体外通过特殊方法将病毒样
颗粒与重组质粒 DNA（如基因疫苗）融合，转录
成的重组 RNA 包入病毒样颗粒内，即形成假病毒
（pseudovirus）。
RVFV 属布尼亚病毒科白岭病毒属（phlebovinzs）
RNA 病毒，具包膜，核酸共分 L、M 和 S 3 个节段，
L 节段编码 RNA 多聚酶，M 节段编码病毒包膜蛋
白，均为负链 RNA。S 节段编码核蛋白和非结构蛋
白，部分为负链，其他部分为正链，即呈所谓双义
（ambisense）结构。补体结合反应抗原同部分 S 节段
编码的 N 蛋白相关。
本研究针对裂谷热病毒中比较保守的 S 基因设
计引物和探针，研制裂谷热假病毒颗粒，并进一步
借助荧光 RT-PCR 方法进行鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
MS2-T 质粒，是包含 MS2 第 12-1 796 位的 T 载
体重组质粒，由华大吉比爱生物技术有限公司陈唯
军 教 授 惠 赠。pGEM-T-RVF 质 粒， 是 包 含 RVFV S
基因第 12-576 位的 T 载体重组质粒，由本实验室构
建、保存。pTrcHis2A 载体购自 Invitrogen 公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据 GenBank 上裂谷热病毒 S 基
因序列（GenBank 登录号 DQ380149）设计了荧光
RT-PCR 引物 rvfv-u1/L1 和探针 rvfv-p1［9］，同时设计
了 2 套 PCR 引物 RVF-F/R（分别引入酶切位点 Pst I
和 Hind Ⅲ）和 Vector-F/R。引物序列见表 1。
1.2.2 p-MS2 假病毒载体构建 MS2-T 质粒和表达载
体 pTrcHis2A 分别进行 Nco I 和 Bgl II 双酶切，酶切
体系为 ：Nco I/Bgl II 1 μL，10×K buffer 2 μL，0.1%
BSA 2 μL，模板 1 μg，补水至 20 μL，37℃ 2 h。酶
切产物分别命名为 pTrcHis2A（N/B）和 MS2-T（N/B）。
分别将酶切产物进行胶回收纯化，用 T4 DNA 连
接酶连接，连接体系为 ：10× buffer 1 μL，T4 酶 5
U，pTrcHis2A（N/B）50 ng，MS2-T（N/B）150 ng，
25℃，10 min，然后立即放冰上。将连接产物进行
转化，挑取单克隆摇菌，以 Vector-F/R 为引物对菌
液进行 PCR 鉴定。将 PCR 鉴定为阳性的克隆抽提
质粒，送北京诺赛基因组研究中心测序。测序正确
的菌株命名为 p-MS2，于 -86℃保存备用。
1.2.3 p-MS2-RVF 重组质粒构建 pGEM-T-RVF 质
粒与 p-MS2 质粒分别进行 Pst I 和 Hind Ⅲ双酶切。
将酶切产物回收纯化，用 T4 DNA 连接酶连接。连
接产物转化，分别以 RVF-F/R、Vector-F/R 为引物进
行 PCR 鉴定，测序。测序正确菌株命名为 p-MS2-RVF，
于 -86℃保存备用。
1.2.4 p-MS2-RVF 假病毒颗粒纯化及特性鉴定
1.2.4.1 假病毒颗粒的表达与初步纯化 p-MS2-RVF
重组菌加入 1 mmol/L 的 IPTG 诱导表达 16 h，离心，
菌体沉淀用 1×TE buffer 混匀，按 1 1 000 加入溶菌
酶（25 mg/mL），37℃裂解处理 30 min，4℃，12 000
r/min 离心 15 min，上清即为含假病毒颗粒的表达产
物。按表达产物∶酶量 =125 1 1 分别加入 RNaseA
（1 mg/mL）和 DNase I（1 mg/mL）37℃消化 1 h。消
化产物依次经过盐沉淀、氯仿作用后，得到粗纯的
假病毒颗粒溶液。参照文献［10］。
1.2.4.2 假病毒颗粒的纯化 在超速离心管中制备
蔗糖密度梯度溶液，加入含假病毒颗粒的溶液，最
后 用 SM（0.1 mol/L NaCl，8 mmol/L MgSO4·7H2O，
50 mmol/L Tris-Cl pH7.5，2% 明胶溶液）溶液补满。
分级梯度于 4℃，40 000 r/min，离心 12 h。回收含
假病毒颗粒的区域，再超速离心，去上清，加入适
量 SM 溶液，重悬沉淀，进行 PCR 与 RT-PCR 鉴定
纯化效果。
1.2.5 假病毒颗粒特性鉴定 敏感性试验 ：将 50
μL/管纯化的假病毒颗粒溶液分别放置于 56℃（1 d）、
37℃（20 d）、 常温（30 d）、 4℃（30 d）、 -20℃（60
表 1 所用基因的引物及探针序列
引物名称 引物序列（5-3）
RVFV-F CTGCAGCCCTAGTGCTTATCAAGTATATCATG
RVFV-R AAGCTTGGCAACAGGCACAGGTCAATC
Vector-F GAGGTATATTAATGTATCG
Vector-R GATTTAATCTGTATCAGG
2013年第2期 137邓俊花等 ：裂谷热假病毒颗粒研制及鉴定
d），每种条件下 5 份样本，每份样本各取 10 μL 混
匀，进行样品处理后 RT-PCR 鉴定。RNase A 攻击
试验 ：在 50 μL 假病毒颗粒溶液中分别加入 RNase
A（1 mg/mL）1-4 μL 后，37℃放置 30 min，对照组
不加 RNase A，每种条件下 5 份样本，每份样本各
取 10 μL 混匀，RNA 抽提后进行 RT-PCR 鉴定。电
镜观察 ：纯化的假病毒颗粒溶液经 1% 醋酸双氧
铀负染后，利用透射电镜（JEM-1400）进行形态
鉴定。
1.2.6 裂谷热假病毒颗粒荧光 RT-PCR 方法鉴定
将裂谷热假病毒颗粒溶液进行 10 倍系列稀释，采用
Trizol（Invitrogen，USA）试剂分别提取 RNA，对应
4.25×108-4.25×102 copies/mL，裂谷热荧光 RT-PCR
检测体系如下：10×PCR Buffer（Mg2+）2.5 μL，MgCl2
（2.5 mmol/L）5.0 μL，d NTP（各 2.5 mmol/L）2.5 μL，
rTaq DNA Polymerase 2.5 U，AMV-XL 2.5 U，RNase
Inhibitor 20 U，Rvfv-u1/L1（10 μmol/L）10 pmol/10
pmol，Rvfv-p1（10 μmol/L）10 pmol， 模 板 RNA 10
ng。RT-PCR 反应程序 ：50℃反转录 30 min ；94℃预
变性 5 min ；94℃变性 30 s，47℃退火 30 s，扩增 40
个循环，每个循环反应结束时收集荧光信号。
2 结果
2.1 p-MS2质粒测序结果
p-MS2 质粒经测序，MS2 目的片段完全正确插
入载体 pTrcHis2A 中。
2.2 p-MS2-RVF菌液PCR鉴定及测序结果
以 p-MS2-RVF 菌液为模板，分别以 RVF-F/R，
Vector-F/R 为引物进行 PCR 鉴定。PCR 产物经 1%
琼脂糖电泳（图 1）显示，目的条带分别在 500-700
bp、2 000-3 000 bp 之间，与预设计的目的基因片段
大小（584 bp 和 2 479 bp）相符。经测序 RVFV 目
的片段已正确插入至载体 p-MS2 中。
2.3 假病毒颗粒纯化效果鉴定
纯化产物作为 RT-PCR 反应模板，其中一组不
经过反转录直接进行 PCR 鉴定，检测结果为阴性，
表明制备的假病毒颗粒溶液中无 DNA 污染。另一组
样本进行 RT-PCR 鉴定，检测结果呈阳性，表明裂
谷热基因片段已经重组于假病毒颗粒中，而且模板
以 RNA 形式存在（图 2）。
M ：Marker 2000 ；1 ：PCR 鉴定结果 ；2 ：RT-PCR 鉴定结果 ；3 ：空白对照
图 2 假病毒颗粒纯化效果
M1 ：Marker 1kb ；1 ：空 白 对 照 ；2 ：PCR 产 物（Vector-F/R）；M2 ：Marker
2000 ；3 ：PCR 产物（RVF-F/R）；4 ：空白对照
图 1 裂谷热 p-MS2-RVF 菌液 PCR 鉴定
M1 M2 3 421
2479
bp
565
1 2 3M
584
bp
2.4 纯化后的假病毒颗粒温度敏感试验
经试验，假病毒颗粒溶液在 37℃情况下至少可
以保存 20 d，随着保存温度降低，保存时间越长。
由此可以看出，该假病毒颗粒具有良好的稳定性
（图 3）。
M ：Marker 2000 ；1-5 ：分别对应 56℃、37℃、25℃、
4℃、-20℃ RT-PCR 产物
图 3 假病毒颗粒温度敏感性检测结果
1 2 3 4 5 M
2.5 稳定性试验（RNase A攻击试验）
用 RNaseA 处理的假病毒颗粒溶液与对照组样
品分别进行 RT-PCR 鉴定，检测结果一致，表明制
备的假病毒颗粒溶液可抵抗 RNaseA 的降解（图 4）。
2.6 电镜观察
超声破碎表达产物经 SYBR Green 染色后通过
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期138
M：Marker 2000；1-4：分别对应 1、2、3 和 4 μg RNase A 量的 RT-PCR 产物；
5 ：对照组的 RT-PCR 产物
图 4 假病毒颗粒稳定性检测结果
1 2 3 4 5M
图 5 假病毒颗粒的电镜观察结果
蔗糖密度梯度离心，可以看到在密度为 35% 区域内
有绿色荧光条带出现。利用透射电镜对假病毒颗粒
纯化样品进行观察图 5，可以看到直径大约为 26 nm
的多边形颗粒，即诱导表达的假病毒颗粒。
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0 5 15 25 35 4540
オⲭሩ➗101
302010
Cycle
100
69.45
107
106
104
105
108
103
102
PC
R
B
as
e
Li
ne
S
ub
tra
ct
ed
C
ur
ve
F
it
R
FU
图 6 不同稀释浓度假病毒颗粒溶液与荧光信号 Ct 值关系图
3 讨论
早期 MS2 噬菌体的研究发现，在复制酶 5 端
存在一个由 19 个碱基组成的茎环结构（发夹结构），
碱 基 序 列 为 5-ACAUGAGGAUUACCCAUGU-3， 是
包膜蛋白二聚体与 RNA 相互作用的部位，这种相
互作用形成的复合物是噬菌体自我包装的信号，在
复合物的基础上，成熟酶蛋白与其他包膜蛋白分子
结合并在自由能的驱动下形成相应的空间构象，完
成 MS2 噬菌体的组装［8，11-17］。本研究在该结构相应
的基因序列下游插入了外源基因 RVFV 的 S 基因片
段，借助载体上的转录启动子和终止子进行基因调
节，表达产物经过菌裂解，双酶（DNase I 和 RNase A）
消化，梯度离心等处理，获得含有 RVFV 外源基因
的假病毒颗粒。
研究表明没有成熟酶蛋白的 VLPs，其内包装
的 RNA 易 被 RNase 降 解［18，19］。 另 外， 在 成 熟 酶
蛋白的基因上存在一个与包装位点相似的一致性序
列［20］，有研究［21］认为这个类包装位点的存在使
MS2 的包膜蛋白在包装时出现了协同效应，这种协
同效应可以使 RNA 在低浓度的时候就可以引起包
装，增加了包装的效率。另外，成熟酶蛋白有两个
位点与 RNA 相互作用［22］，这使得 MS2 包膜蛋白的
包装更容易进行。本研究通过对制备的假病毒颗粒
先后进行温度敏感试验、RNase A 攻击试验数据表
明，此假病毒颗粒具有耐 RNase 的特性，稳定性良
好，在室温可以保存至少 30 d，4℃可以保存更长时
间，从而解决了 RNA 质控品使用、保存和运输的稳
定性问题。
在大肠杆菌中表达的假病毒颗粒主要存在于裂
解物的上清中，由于在裂解过程中，大量复制的质
粒 DNA 也同样随病毒样颗粒进入上清中，如果加
入 DNase I 的比例不当，很难将质粒 DNA 完全降解。
本研究通过摸索，优化表达产物和酶加入的比例，
纯化的假病毒颗粒溶液先进行纯度鉴定，提取的
RNA 直接进行 PCR 鉴定，呈阴性，表明此溶液中无
DNA 污染 ；另一组 RNA 先反转录再进行 PCR 鉴定，
呈阳性，则表明此病毒颗粒中包含有 RVFV 外源基
因。进一步以假病毒颗粒提取的 RNA 为材料，进行
荧光 Real-time RT-PCR 方法鉴定，该方法中裂谷热
2.7 假病毒颗粒荧光RT-PCR鉴定及其敏感性检测
如图 6 所示，随着稀释倍数的增加，Ct 值逐渐
增加。经多次试验表明，本方法对裂谷热假病毒颗
粒溶液最低检测可达 4.25×102 copies。
2013年第2期 139邓俊花等 ：裂谷热假病毒颗粒研制及鉴定
假病毒颗粒溶液最低检测限可达 4.25×102 copies。
4 结论
在国内外首次构建了包裹裂谷热病毒 S 基因片
段 RNA 的假病毒颗粒，稳定性良好，具有耐 RNase
的特性，安全无污染，易运输。研制的裂谷热假病
毒颗粒，凭借荧光 RT-PCR 方法最低可达到 4.25×102
copies 检测限，可作为参比物质应用于裂谷热临床
分子生物学检测方法。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）