全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-09-19
基金项目 : 河南省科技攻关重点项目（092102310069）
作者简介 : 廖春丽 , 女 , 讲师 , 研究方向 : 微生物发酵研究
通讯作者 : 单林娜 , 女 , 教授 , 研究方向 : 环境生物技术研究 ; E-mail: liaoliao8178@yahoo.com.cn
溶藻菌株 NP23的紫外诱变选育
廖春丽 万亚涛 李亚平 姬晓娜 单林娜
（河南城建学院 生物工程系，平顶山 467044）
摘 要： 应用紫外诱变技术对溶藻菌株 NP23进行紫外诱变处理。经过粗筛后，从 8株诱变株中选出 2株对绿藻中小球藻
和蓝藻中惠氏微囊藻的去除效果明显优于原始菌株的突变株 NP23-1和 NP23-4，其溶藻率（叶绿素 a的去除率）比原始菌株提高
30%-35%。连续 6代测试，2株诱变菌株 NP23-1和 NP23-4溶藻率都很稳定，表明所得突变株是比原始菌株更优秀的溶藻菌株。
关键词： 紫外诱变技术 小球藻 惠氏微囊藻 溶藻率
UV Induced Mutagenesis of Algae-lysing Bacteria NP23
Liao Chunli Wan Yatao Li Yaping Ji Xiaona Shan Linna
（Department of Biology Engineering， Henan Institute of Urban Construction， Pingdingshan 467044）
Abstract: A UV induced mutagenesis was carried out for algae-lysing bacteria NP23. By preliminary screening from 8 mutants , our
obtained two mutants NP23-1 and NP23-4, both of which showed satisfactory removal effect on Chlorella vulgaris of Chlorophyta and Microcystis
wesenbergii of Cyanophyta. Its Algae-lysing rate（the removal rates to chlorophyll a） of induced strains NP23-1and NP23-4 increased about
30%-35%. Algae-lysing rate of two induced strains NP23-1and NP23-4 remained unchanged after six generations. Results showed that mutants
preferable strains with algae-lysing effect.
Key words: UV induced mutagenesis Chlorella vulgaris Microcystis wesenbergii Algae-lysing rate
随着工业、农业的迅速发展，向环境中排放的
营养物质日趋增多，水体的富营养化现象日益加剧，
由此造成的有害藻类水华爆发也日趋频繁［1］，因此
寻求有效的水华防治途径势在必行。而常规的治理
方法， 如化学法和物理法在应对有害藻华时效果不
甚理想［2， 3］， 在此情况下，利用溶藻细菌（Algicidal
bacteria）控藻成为防治水华和赤潮的可能手段，引
起了众多科研人员的关注［4， 5］。本课题组筛选出一
株藻的降解菌命名为NP23， 经鉴定为肠杆菌属细菌，
对绿藻中小球藻和蓝藻中惠氏微囊藻有一定的去除
效果，为了提高溶藻率，因此选育优势变异菌有重
要的实践意义。
紫外诱变技术机理是紫外光照射能使微生物的
脱氧核糖核酸分子结构形成 “胸腺嘧啶二原体”， 造
成复制错误， 引起基因突变， 从而获得高效降解活性
的变异菌种［6］。本研究利用紫外诱变技术诱变筛选
的野生细菌 NP23，旨在为溶藻细菌实际用于处理富
营养化湖泊水奠定良好的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 菌种 溶藻菌 NP23， 来自课题组从河南省平
顶山市白龟山水库大坝下游水体中经富集、分离纯
化得到的一株野生细菌。
1.1.2 藻种 绿藻 ：小球藻 ；蓝藻 ：惠氏微囊
藻，这些藻种来自中国科学院水生生物研究所藻
种保藏中心。藻种经活化后， 在 25℃、光照强度为
2 500 lx、光暗期为 12 h 12 h 的条件下培养。藻种
的接种及传代过程均严格按照无菌操作规则进行。
1.1.3 培养基 溶藻菌 NP23 液体培养基 ：1% 葡萄
糖，0.4% （NH4）2SO4，0.03% MgSO4·7H2O，0.03 %
2012年第6期 175廖春丽等 ：溶藻菌株 NP23 的紫外诱变选育
NaCl，0.003% FeSO4·7H2O，0.003% MnSO4·H2O，
0.04% 酵母膏，0.03% CaCl2.，0.3% K2HPO4，pH7.0。
藻培养基 ：绿藻使用 SE 培养基［7］；蓝藻使用 BG11
培养基［8］。
1.2 方法
1.2.1 NP23 对数生长期的测定 在无菌条件下，挑
取活化菌株按 10% 接种量，在 28℃ 180 r/min 振荡
培养，并定时取样测定在 660 nm 处的吸光值，根据
吸光值的大小绘制菌的生长曲线。
1.2.2 藻生长曲线的测定 在无菌条件下，按照藻
种 ：培养基为 1 2 的体积比将小球藻和惠氏微囊藻
转接分别转接到 SE 培养基和 BG11 培养基中，设置
3 组平行，在 25℃、光照强度为 2 500 lx、光暗期
为 12 h 12 h 的条件下培养。定时取样采用丙酮冻融
法［9， 10］提取藻中叶绿素 a，通过分光光度计法测量
叶绿素 a 的吸光值，按照下面的公式求出叶绿素 a
的含量，根据叶绿素 a 的含量绘制藻的生长曲线。
叶 绿 素 a（mg/m3）=［11.64×（D663-D750）-
2.16×（D645-D750） +0.10×（D630-D750）］V1/V/δ
式中，V 为取样体积（L）， D 为吸光度，V1 为提取
液定容后的体积（mL），δ 为比色皿光程（cm）。
1.2.3 NP23 对藻的溶藻率的测定 将培养至对数期
的菌液（菌浓 108 个 /mL）与培养至对数期的藻液（叶
绿素 a 含量 725 mg/m3）按照 1 9 的比例混合培养，
培养条件与藻的相同。设置对照和加菌样各 3 组平
行。对照和加菌样每隔 12 h 取样一次，每次 5 mL，
取出的藻样按照丙酮冻融法测量叶绿素 a 的的吸光
值，进而求出叶绿素 a 的含量，计算出菌株对藻的
溶藻率。
溶藻率（R）=（C0-Ce）/C0
式中，C0 为对应时刻对照样藻中叶绿素 a 的含量
（mg/m3）；Ce 为对应时刻处理样藻中叶绿素 a 的含量
（mg/m3）。
1.2.4 紫外诱变剂量的选择［11］ 取 18个直径为9 cm
的平皿，每 3 个为 1 组，共分为 6 组。每皿分别装有
新制备的 108 CFU/mL 菌悬液 5 mL，每个皿中放一
无菌磁力搅拌子后置磁力搅拌器上， 18 W 紫外线下
28 cm 处分别照射 20 s、40 s、60 s、80 s、100 s 和
120 s［12］，然后每皿取 1 mL 适当稀释后涂平板，平
板用黑布包裹后置于黑暗闭光的 28℃恒温箱培养，
待平板长出菌落后，菌落计数。
1.2.5 NP23 诱变株的初筛 以最佳的照射剂量诱变
NP23， 连续诱变 5 代。每代诱变后后培养 2 h，然后
稀释涂平皿，最后选出 8 株菌落直径最大、生长最
旺盛的诱变株把它们做成菌悬液接着第二代诱变，
同上步一样操作，每代都控制挑选 8 个菌落直径最
大、生长最旺盛的诱变株进行下一代的诱变。最后
对第 5 代筛选出 8 株诱变菌进行溶藻效果的测定。
1.2.6 稳定性试验［13-15］ 挑取诱变后溶藻率提高
的菌株进行斜面培养，传代 6 代后，测量其对小球
藻、惠氏微囊藻的溶藻率，将测定出的溶藻率与诱
变第 5 代菌的溶藻率比较，观察菌的溶藻功能是否
稳定，最终筛选稳定性菌株。
2 结果
2.1 菌种对数生长期的确定
以培养时间为横坐标，测得的光吸收值（OD660
值）为纵坐标，绘制出菌的生长曲线。由图 1 可知，
菌株的停滞期在 0-12 h 左右，在 12 h 后进入对数生
长期，培养至大约 21 h 后可达到稳定期。
图 1 菌株 NP23的生长曲线
2.2 藻种对数生长期的确定
以藻的培养时间为横坐标，叶绿素 a 含量为纵
坐标绘制出藻的生长曲线。从图 2 可知，几种藻在
转接于新的培养基中都有一个短暂的适应期，此时
叶绿素 a 的含量有所下降，但是随着时间延长藻适
应环境而迅速的生长，即进行对数期的生长，之后
由于培养基的营养成分的消耗，藻的生长速度变得
缓慢，叶绿素 a 的变化微小。所以，小球藻在培养
大约 3 d 时可以达到对数期，惠氏微囊藻在培养大
约 2 d 时可以达到对数期。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期176
2.3 紫外诱变剂量的选择
以诱变时间为横坐标，以致死率为纵坐标，作
出菌 NP23 紫外诱变剂量效应曲线， 其中，致死率 =
（A对照-BUV）/ A对照×100%。由结果（图 3）可以看
出，该菌对紫外线较为敏感，随着照射时间的延长，
致死率急剧上升。100 s 照射时的致死率为 95%，
80 s 时菌数为 75% ，由于致死率不能过高或过低，
过低诱变效果不佳 ；过高则负变菌株增多，且总体
存活率太少而无从选择。而大量的研究表明紫外照
射处理菌的致死率在 70%-80% 时诱变效果较好，
所以由图 3 可知，本试验选择 80 s 作为紫外诱变育
种的适宜照射时间。
而诱变后的菌株 NP23-3、NP23-5、NP23-6 和 NP23-8
的溶藻率呈现负诱变趋势，低于原菌株 NP23 的溶藻
率，所以菌株 NP23-1、NP23-2、NP23-4 和 NP23-7
有可能成为高溶藻率的优势菌株。
从图 5 可以看到原菌 NP23 对惠氏微囊藻的溶
藻率为 53.1%，诱变后菌株 NP23-1、NP23-3、NP23-
4 和 NP23-5 的溶藻率呈现正诱变趋势，溶藻率分
别为 94.9%、92.3%、96.8% 和 83.9%，提高了 30%-
33%，而 NP23-2、NP23-6、NP23-7 和 NP23-8 的溶藻
率呈现负诱变趋势，低于原菌株 NP23 的溶藻率，所
以诱变后菌株 NP23-1、NP23-3、NP23-4 和 NP23-5
有可能成为高溶藻率的优势菌株。
图 2 藻的生长曲线
图 3 不同剂量紫外线照射的致死率
2.4 诱变前后菌NP23对藻的溶藻率的比较
以横坐标为试验号，纵坐标为溶藻率，绘制
诱变前后菌株对藻溶藻效果的比较的图示（图 4，
图 5）。
从图4可以看到诱变前菌NP23对小球藻的溶藻
率为 64.1%，诱变后菌株 NP23-1、NP23-2、NP23-4、
NP23-7 的溶藻率呈现正诱变趋势，溶藻率分别为
97.3%、98.5%、96.1% 和 94.7%，提高了 30%-35%，
图 4 诱变前后菌对小球藻的溶藻率比较
菌株号 1-8 为诱变筛选出来的 8 株菌株的标号，分别记为 NP23-1，
NP23-2，NP23-3，NP23-4，NP23-5，NP23-6，NP23-7，NP23-8
菌株号 1-8 为诱变筛选出来的 8 株菌株的标号，分别记为 NP23-1，
NP23-2，NP23-3，NP23-4，NP23-5，NP23-6，NP23-7，NP23-8
图 5 诱变前后菌对惠氏微囊藻的溶藻率的比较
将菌株和藻混合培养一定时间之后，由于菌对
藻的直接或间接作用，使藻中的叶绿素 a 的被降解，
藻液颜由原来的绿色变浅，并伴随黄化现象，直至
藻液变成乳白色。从图 6、图 7 可以看到小球藻和
惠氏微囊藻藻液的明显变化。
2012年第6期 177廖春丽等 ：溶藻菌株 NP23 的紫外诱变选育
2.5 高溶藻率的诱变菌株稳定性分析
将得到的溶藻率有明显提高的突变株进行连续
传代 6 次，每代所得到的菌株溶藻率结果为表 1。
从表 1 可以看到筛选出来的 6 株菌株均对相应的藻
种保持较高的溶藻效果，同时 NP23-1、NP23-4 对两
种藻均具有较高的溶藻率，并且遗传稳定性较好。
图 7 诱变前后的菌对惠氏微囊藻的影响
图 6 诱变前后的菌对小球藻的影响
表 1 六株菌株溶藻率稳定性分析结果
菌种 藻种
溶藻率（%）
第 1 代 第 2 代 第 3 代 第 4 代 第 5 代 第 6 代 平均值 传代前溶藻率
NP23-1 小球藻 96.3 97.2 95.9 93.4 97.8 98.5 96.5 97.3
惠氏微囊藻 94.3 96.4 93.3 97.4 92.8 95.7 95.0 94.9
NP23-2 小球藻 97.0 98.4 97.3 92.5 98.3 98．7 97.0 98.5
NP23-3 惠氏微囊藻 93.4 96.3 88.5 90.5 91.2 95.6 92.6 92.3
NP23-4 小球藻 97.5 97.1 96 97.3 95.6 96.4 96.7 96.1
惠氏微囊藻 97.1 95.8 97.9 95.8 96.7 97．6 96.8 96.8
NP23-5 惠氏微囊藻 82.3 86.8 90.7 89.5 88.2 93.4 88.5 83.9
NP23-7 小球藻 96.8 93.4 95.1 92.3 94.6 93.7 94.3 94.7
3 讨论
采用 U.V 诱变处理菌种，设备简单操作方便，
是长时间以来工业菌种诱变最常用的最有效地方法
之一。但诱变法选育菌种工作量较大，要筛选到性
能优异稳定的菌株，需要做大量工作。利用粗筛方
法，首先筛选生长旺盛、生长速率快的菌株，缩小
了筛选范围， 再利用精筛方法，进一步缩小筛选范
围，最后对 6 株诱变株进行详细、系统的研究，并
从中筛选到所需 2 株菌株。本试验的特点就是连续
诱变 5 代而且每代都控制挑选 8 个菌落直径最大、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期178
生长最旺盛的诱变株进行下一代的诱变，最后对第
5 代筛选出 8 株诱变菌进行溶藻效果的测定，这种
筛选方法大大降低了工作量，并且工作效率高。
该研究首先确定了筛选菌株和藻的最佳生长
时期及菌对藻的溶藻率，然后是紫外诱变剂量选
择，最后通过紫外诱变技术对菌株 NP23 进行诱变
和稳定性遗传分析筛选出溶藻率较高且溶藻性能较
稳定遗传的 2 株菌。最终对筛选出对小球藻、惠氏
微囊藻的溶藻率都明显提高的可稳定遗传的诱变株
NP23-1、NP23-4 进行保存。
惠氏微囊藻和小球藻在我国淡水领域广泛分布，
是具有代表性的蓝藻和绿藻，有时它和其他藻以不
同的比例混合在一起，飘浮于水面，形成厚厚的水
华，引起水体富营养化。诱变前的 NP23 菌株对这两
种藻具有很好的溶藻效果，并且在诱变后又能够明
显提高其溶藻效果，所以诱变菌株 NP23-1、NP23-4
具有能力成为除去水体中藻的优势菌株。
4 结论
（1）菌株 NP23-1 和藻的最佳生长时期分别是菌
株 15-21 h、小球藻 3 d 和惠氏微囊藻 2 d ；藻的溶
藻率，对小球藻 64.1% 和惠氏微囊藻藻 53.1%。（2）
本研究紫外诱变剂量的适宜照射时间 80 s。（3）诱
变后筛选出两株菌 NP23-1、NP23-4 对小球藻溶藻
率平均是 96.5%，对惠氏微囊藻溶藻率平均是 96%，
比诱变前提高了近 30%-33% ；且经过遗传稳定性分
析溶藻性能较较稳定。
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（责任编辑 李楠）