全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-02-27
基金项目 : 公益性行业（农业）科研专项（200903037-06）, 江苏出入境检验检疫局科研项目（2011KJ03）
作者简介 : 王宗尧 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 人兽共患病及兽医公共卫生学 ; E-mail: best_zongyao@163.com
通讯作者 : 马志永 , 男 , 研究员 , 研究方向 : 人畜共患病 ; E-mail: zhiyongma@shvri.ac.cn
自 1976 年埃博拉出血热（ebola haemorrhagic
fever，EHF） 和 1967 年 马 尔 堡 出 血 热（marburg
haemorrhagic fever，MHF）首次暴发和确认以来，以
其高传染性的暴发流行和高致死性（死亡率高达
30%-90%）［1，2］，使人们开始关注 EHF 和 MHF 对
人类健康和公共卫生安全的潜在威胁。EHF 和 MHF
分别由埃博拉病毒（ebola virus，EBOV）和马尔堡
病毒（marburg virus，MARV）引起，可经人与人
之间的亲密接触传播，传染性强。目前尚无有效的
疫苗和特效的治疗药物。因此，加强对 EBOV 和
MARV 防控，开展这两种病毒诊断方法的相关研究
十分必要［3，4］。
1983 年由 Smith 等［5］建立的杆状病毒表达载
体系统，是首次利用苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病
毒（AcMNPV）成功表达人 β-干扰素。Bac-to-Bac
Expression System 是现在应用广泛的其中之一，它
EBOV-Z和MARV的 NP基因在杆状病毒表达系统的
表达及反应原性鉴定
王宗尧1，2 史子学1 刘阳1 朱紫祥1 吴德峰2 王水明3 刘学辉3 马志永1
（1 中国农业科学院上海兽医研究所 兽医公共卫生研究室，上海 200241 ；2 福建农林大学动物科学学院，福州 350002 ；
3 南京出入境检验检疫局，南京 211136）
摘 要： 利用昆虫杆状病毒表达系统，成功地对埃博拉（EBOV）扎伊尔型病毒和马尔堡病毒（MARV）的 NP基因进行表达。
Western blot结果显示，重组 EBOV蛋白和重组 MARV-NP与各自阳性血清有特异的反应原性，在血清学上无交叉反应。IFA检测
感染重组昆虫杆状病毒的 Sf9细胞表明，EBOV和 MARV NP获得大量表达，呈现强烈的荧光，对照组细胞无特异荧光。该研究为
EBOV和 MARV流行病学调查和研制诊断试剂盒奠定了基础。
关键词： 丝状病毒 埃博拉病毒 马尔堡病毒 NP 杆状病毒表达 反应原性
Expression and Characterization of Nucleocapsid Protein of Ebola-
Zaire and Marburg Viruses in Baculovirus
Wang Zongyao1，2 Shi Zixue1 Liu Yang1 Zhu Zixiang1 Wu Defeng2
Wang Shuiming3 Liu Xuehui3 Ma Zhiyong1
（1Shanghai Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Science，Shanghai 200241；2College of Animal Sciences，Fujian
Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002；3Nanjing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 211136）
Abstract: Ebola-Zaire Viruses （EBOV-Z） and Marburg Viruses （MARV） are the causative agents of Ebola haemorrhagic fever and
Marburg haemorrhagic fever，respectively. In this study，the nucleocapsid proteins （NP） of EBOV-Z and MARV were expressed using by
baculovirus expression system. Western blot analysis of the reactivity of the expressed NP showed that the NP of EBOV-Z was recognized by
sera specific for EBOV-Z，but not by sera specific for MARV，whereas，the NP of MARV was reacted only with the sera specific for MARV.
Indirect immunofluorescence assay of the NPs expressed in Sf9 cells indicated that the NPs of EBOV-Z and MARV were detected by the sera
specific for EBOV-Z and MARV，respectively. Taken together，these data showed that the NPs of EBOV-Z and MARV have been expressed.
Key words: Filovirus Ebola-Zaire viruses Marburg viruses NP Baculovirus expression Reactivity
2012年第9期 105王宗尧等：EBOV-Z和MARV的NP基因在杆状病毒表达系统的表达及反应原性鉴定
借鉴 1993 年 Luckow 等［6］改良的细菌体内转座的方
法，后来逐步商业化。杆状病毒表达系统不仅可用
于表达外源蛋白，现已成功地用于表达如人类乳头
瘤病毒（human papilloma virus）的 VLPs（virus-like
particles）［7］，以及丙型肝炎病毒、人类严重急性
呼吸综合症冠状病毒（human severe acute respiratory
syndrome coronavirus）［8］、轮状病毒［9］等的 VLPs。
杆状病毒表达系统已被广泛用于表达病毒样颗粒，
2007 年 Narinder 等［10］通过 Bac-to-Bac Expression Sy-
stem 成功地表达了禾谷缢管蚜病毒（Rhopalosiphum
padi virus），为其他病毒在杆状病毒表达系统中的表
达提供了理论与实践依据。杆状病毒表达系统具有
良好的应用前景。
EBOV 和 MARV 为不分节段的单股负链 RNA
病毒，有囊膜，同为丝状病毒的成员［10］。基因组编
码7种蛋白即3-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5，
其中 NP 是核蛋白的主要成分，其基因定位于基因
组的 3端，带有一个前导序列，编码区含 2 217 个
核苷酸，编码一个含 737 个氨基酸残基的蛋白质，
分子质量为 83.3 kD［11，12］。该蛋白在病毒复制方面
起到了重要的作用，有着很好的抗原性，并且没有
感染性，可用于检测病毒特异性抗体。因此本试验
利用杆状病毒表达系统对 EBOV 和 MARV 的 NP 基
因进行了表达，对表达产物的反应原性进行鉴定，
旨在为研制出有效的检测技术储备，同时也为两种
病毒分子生物学研究积累材料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 目的基因、血清 Ebola-Z-NP 基因的质粒
pUC57-Ebola-Z-NP 和含有 Marburg-NP 基因的质粒
pUC57-Marb-NP 由本室保存。抗鼠 His 单抗购自
Invitrogen 公司，大鼠阳、阴性血清由本实验室自
备［13， 14］，采自健康的试验用大鼠。
1.1.2 BAC-TO-BAC 杆状病毒表达系统 转移载体
pFastBacTM HT、DH10Bac 宿主菌、昆虫细胞 Sf9 均
购自 Invitrogen 公司。
1.2 方法
1.2.1 重组杆状病毒的构建 将 pUC57-Ebola-Z-
NP 和 pUC57-Marburg-NP 及载体 pFastBacTM HT 双酶
切，酶切位点分别为 ：EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ。胶回收
目的片段，T4 DNA 连接酶 16℃连接过夜，转化到
DH5α 感受态以 Amp 抗性筛选。重组质粒再转化到
DH10Bac 感受态，蓝白斑筛选（48 h），挑取白色透
明菌落经 PCR 验证（载体 pFastBacTM HT 通用引物）
获得重组 Bacmid。小提试剂盒（Invitrogen）提取重
组 Bacmid 和 Bacmid 空载体。用 LipofectamineTM 将
重组 Bacmid 和未转座的 Bacmid 分别转染 Sf9 细胞，
转染方法参考说明书。转染后待细胞出现病变时收
获 P1 代重组杆状病毒，得到的病毒命名为 rBacNP-
EBOV-Z（含 EBOV-Z NP 基因）、rBacNP-MARV（含
MARV NP 基因），rBacNPV（不含目的基因的野生
型杆状病毒）。将 rBacNP-EBOV-Z 和 rBacNP-MARV
重组病毒作 10-3-10-8 稀释，接种 Sf9 细胞，以间接
免疫荧光法测定病毒感染 Sf9 细胞的荧光斑数，计
算病毒的滴度。
1.2.2 重组 NP 蛋白的表达 按照杆状病毒表达系
统（BAC-TO-BAC baculovirus expression system，Invi-
trogen）手册，以约0.5个MOI的P1感染9×105个细胞，
获得 P2 病毒。将滴度提高 10 倍同样感染 Sf9 细胞，
获得三代毒（P3）。将 9×105 个细胞传至 6 孔板，
以约 5 个 MOI 的 P3 重组毒接种，设立 rBacNPV 接
毒细胞和正常 Sf9 细胞作对照。在感染 96 h 后收取
细胞，上清和细胞沉淀分别收样保存。
1.2.3 重组蛋白的反应原性鉴定
1.2.3.1 Western blot 上清和沉淀分别制样。上清
用 5×SDS-PAGE 上样缓冲液稀释后煮沸 5 min，于
12 000 r/min 离心 5 min，以未见沉淀为宜。细胞沉淀
在蛋白酶抑制剂的保护下用细胞裂解液裂解 10 min，
8 000 r/min离心5 min，上清和沉淀分别5×SDS-PAGE
上样缓冲液和 1×SDS-PAGE 上样缓冲液稀释及重
悬，煮沸 5 min。制备的样品经 SDS-PAGE 电泳后转
印 PVDF 膜（Millipore），以正常 Sf9 细胞培养作对
照，分别与大鼠抗 EBOV-Z-NP（1 5 000）和大鼠抗
MARV-NP（1 5 000）作用，加入 HRP 标记的羊抗
大鼠酶标二抗（1 10 000），作用后显色。
1.2.3.2 间接免疫荧光 将 Sf9 细胞传至 96 孔细胞
培 养 板（Costar）， 接 种 rBacNP-EBOV-Z、rBacNP-
MARV、rBacNPV 重组病毒，设立正常的 Sf9 细胞
和 BacNPV 感染细胞作对照 ；28℃培养 72 h 后，吸
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期106
弃培养液，丙酮固定 ；0.5% PBST 洗涤 3 次，每次
3 min，用 10% 羊抗体血清封闭，分别加入小鼠抗
EBOV-Z-NP（1 1 000）和 MARV-NP（1 1 000）阳
性血清、小鼠阴性血清（1 100）100 μL，37℃作用
1 h。PBS 洗涤 3 次，加入 50 μL（1 500）FITC 标记
的羊抗鼠荧光二抗（Sigma），作用 1.5 h。DAPI 染核
后显微镜下观察。
2 结果
2.1 重组载体 pFastbacHT-EBOV-Z和pFastbacHT-
MARV的构建
载体质粒 pFastBacTMHT 和 pUC57-Ebola-Z-NP、
pFastBacTMHT 和 pUC57-Ebola-M-NP 同时用 EcoR Ⅰ
和 Hind Ⅲ双酶切消化，回收约 2 200 bp 的 NP 目
的片段，将目的片段与载体进行连接，转化感受态
DH5α，提取质粒酶切鉴定，得到片段分别 4 856 bp
和 2 217 bp，与预期相符（图 1）。经序列测定表明
构建的载体正确。
分细胞发生脱落。将所获 P1 重组杆状病毒连续感染
Sf9 细胞，TCID50 方法测定 P3 重组杆状病毒的滴度
为 6.2×107 PFU/mL。
M. 1 kb DNA 分子量标准；1. pFastbacHT-HA 双酶切产物；
2. pFastbacHT-MARV 双酶切产物
图 1 pFastbacHT-EBOV和 pFastbacHT-
MARV双酶切鉴定
2.2 重组杆状病毒载体构建
将重组质粒 pFastbacHT-EBOV 和 pFastbacHT-
MARV转化到DH10Bac中，通过庆大霉素、卡那霉素、
四环素 3 种抗性和 Bluo-Gal、IPTG（1 100）蓝白斑
筛选得到阳性单菌落克隆，提取质粒，用特异性引
物 pUC/M13 通过菌液 PCR 鉴定重组杆状病毒包含目
的片段（图 2）。
2.3 昆虫细胞的转染
将重组杆状病毒转染昆虫细胞 72 h 后，观察细
胞病变，如图 3 所示，相对于未感染病毒的对照组，
感染病毒的细胞呈明显病变，变大、变圆，还有部
M1. 1 kb DNA 分子量标准 ；1. Bacmid 空载体（300 bp）；2. 重组质粒
pFastbacHT-MARV（4 647 bp）；3. 重组质粒 pFastbacHT-EBOV（4 647
bp）；M2. 2 000 bp DNA 分子量标准
图 2 PCR 鉴定重组杆状病毒
A. 感染重组杆状病毒 72 h 细胞 ；B. 正常细胞
图 3 重组杆状病毒转染 Sf9细胞病变
2.4 重组蛋白的反应原性鉴定结果
2.4.1 Western blot 鉴定重组 EBOV 和 MARV NP 蛋
白 P3 代重组杆状病毒感染 sf9 细胞 72 h 后，收集
上清和细胞样品，进行 Western blot 分析。一抗分别
为大鼠抗 EBOV-Z-NP 和大鼠抗 MARV-NP，二抗为
羊抗大鼠IgG，以野生杆状病毒表达的蛋白作为对照，
结果（图 4）显示，两种病毒 NP 蛋白只针对特异性
抗体反应。重组 EBOV NP 不与大鼠抗 MARV-NP 反
应。同样重组 MARV 蛋白也不与大鼠抗 EBOV-Z-NP
作用反应。
2.4.2 间接免疫荧光 两种重组杆状病毒感染细
胞 72 h 后，80% 冷丙酮固定后，一抗分别用大鼠
抗 EBOV-Z-NP 和大鼠抗 MARV-NP，经荧光二抗
反应荧光显微镜观察结果（图 5）。接种重组病毒
rBacNP-EBOV-Z 的 Sf9 细胞仅在使用大鼠抗 EBOV-
Z-NP 检测能显示绿色荧光，接种重组病毒 rBacNP-
MARV 的 Sf9 细胞仅与大鼠抗 MARV 阳性血清反应
2012年第9期 107王宗尧等：EBOV-Z和MARV的NP基因在杆状病毒表达系统的表达及反应原性鉴定
（图 5-A，图 5-B）。接种 rBacNPV 和正常的 Sf9 细胞
与大鼠抗 EBOV-Z-NP 和大鼠抗 MARV-NP 阳性血清
不产生非特异性荧光（图 5-C，图 5-D），阴性血清
与接毒的细胞和正常的 Sf9 细胞反应后也未能观察
到荧光。
病毒中的表达，杆状病毒表达系统已成为病毒蛋白
质结构功能研究的重要工具，具有安全性高、对外
源基因克隆容量大、重组病毒易于筛选、具有完备
的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力
等特点，并且其表达产物具有很高的生物活性，抗
原性和免疫原性均与天然蛋白相似［8］。昆虫杆状病
毒表达系统在研究基因功能、制备目的蛋白远远优
于大肠杆菌和酵母表达系统。
本研究 IFA 结果表明，表达的 NP 蛋白可与其
特异性抗体反应，IFA 方法可进一步研究用于 EBOV
或 MARV 流行病毒学调查，成为 ELISA 或 RT-PCR
图 4　 EBOV-Z-NP和MARV-NP重组蛋白与大鼠抗
EBOV-Z（A）和大鼠抗MARV（B）血清反应
的 Western blot 鉴定结果
A. 接种 rBacNP-EBOV-Z Sf9 细胞与大鼠抗 EBOV-Z-NP 血清作用的 IFA 图片；B. 接种 rBacNP-MARV Sf9 细胞与大鼠抗 MARV-NP 血清作用的 IFA 图片；
C. 接种 rBacNPV Sf9 细胞与大鼠抗 EBOV-Z-NP 血清作用的 IFA 图片 ；D. 接种 rBacNPV Sf9 细胞与大鼠抗 MARV-NP 血清作用的 IFA 图片
图 5 接种重组病毒的 Sf9细胞与大鼠抗 EBOV-Z和大鼠抗MARV阳性血清反应的间接免疫荧光（IFA）检测结果
3 讨论
EBOV 和 MARV 是两种高度危险的病原，非生
物安全 4 级实验室不能对病原进行操作，而检测方
法的建立多利用基因工程方法生产重组蛋白模拟病
毒的反应和免疫原性。重组蛋白的反应原性鉴定结
果说明，表达的 NP 蛋白只针对各病毒特异的 NP 抗
体反应，两种蛋白在血清学上没有交叉反应性。说
明两种具有相似形态的病毒虽然同属丝状病毒科的
RNA 病毒，并在致病机理和临床症状上存在许多相
似点［15］，但抗原性却是不同的，这对区别两种病毒
具有很高的临床应用价值。研究显示，两种病毒的
NP 蛋白在感染细胞内丰度较高，被感染动物能产生
较高水平 NP 抗体［16］，因此检测 NP 抗原和抗体成
为 EBOV 和 MARV 检测方法之一。目前我国尚未发
现 EBOV 和 MARV 存在，但面临着病毒从周边国家
传入的巨大风险。因此进行 EBOV 和 MARV NP 蛋
白杆状病毒表达的研究，对我国 EBOV 和 MARV 检
测技术的建立具有重要意义。
本试验成功获得 EBOV 和 MARV 的 NP 在杆状
检测的一种补充方法。本研究通过开展杆状病毒表
达 EBOV 和 MARV NP 的表达，为我国加快建立该
病毒的防控技术提供了必要的基础，必将在我国野
生动物 EBOV 和 MARV 流行病学监测中发挥重要作
用［17］。该研究为 EBOV 和 MARV 流行病学调查和
研制诊断试剂盒奠定了基础。
4 结论
利用昆虫杆状病毒表达系统，成功地对埃博
拉扎伊尔型病毒和马尔堡病毒的 NP 基因进行了表
达。Western blot 结果显示，重组 EBOV 蛋白和重组
MARV-NP 与各自阳性血清有特异的反应原性，在血
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期108
清学上无交叉反应。IFA 检测感染重组昆虫杆状病
毒的 Sf9 细胞表明，EBOV 和 MARV NP 获得大量表
达，呈现强烈的荧光，对照组细胞无特异荧光。
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（责任编辑 马鑫）