全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2011-10-18
基金项目 : 国家自然科学基金面上项目（30873082）, 中央高校基本科研专项资金项目（21610709, 21610506）
作者简介 : 杨辉 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 蓝藻抗病毒蛋白 ; E-mail: highman52@163.com
通讯作者 : 熊盛 , 男 , 博士 , 研究员 , 博士生导师 , 研究方向 : 生物技术药物 ; E-mail: xiongsheng@jnu.edu.cn
蓝藻抗病毒蛋白-N衍生物的克隆、发酵与纯化
杨辉 吴崇超 陈佳 陈伟 杨依丽 罗勇 姚冬生 熊盛
（暨南大学生物医药研究开发基地，广州 510632）
摘 要： 蓝藻抗病毒蛋白-N（Cyanovirin-N，CVN）能特异性与病毒表面糖蛋白结合，抑制病毒进入宿主细胞及抑制病毒感
染细胞与未感染细胞的融合。通过分子设计及优化，在 CVN的 N-末端连接了 5个氨基酸的柔性多肽（GGGGS），构建了 SUMO-L5-
CVN融合表达系统。SUMO-L5-CVN在大肠杆菌 BL21中呈可溶性表达；通过表达条件优化，以 0.5 mmol/L IPTG 在 20℃诱导 24 h
是最佳的诱导表达条件；SUMO-L5-CVN表达量占菌体总蛋白的 30%；经 Ni-NTA亲和层析获得融合蛋白 SUMO-L5-CVN，SUMO蛋
白酶酶切，以及进一步从 Ni-NTA亲和层析获得的目的蛋白 L5-CVN蛋白纯度 >98%。结果表明，低浓度的 L5-CVN与流感病毒表面
糖蛋白 gp120就有较高的亲和力。
关键词： 蓝藻抗病毒蛋白-N 连接肽 发酵 纯化
Expression, Fermentation and Purification of
Cyanovirin-N Derivative
Yang Hui Wu Chongchao Chen Jia Chen Wei Yang Yili Luo Yong Yao Dongsheng Xiong Sheng
（Development and Research Center of Jinan University，Guangzhou 510632）
Abstract: CVN acts by binding with high affinity to the viral envelope glycoprotein, thus inhibiting viral invasion and fusion of the virus
particle to the target cell. Through molecular design and optimization, a 5-amino acids flexible peptide（GGGGS）was linked to the N-terminus
of CVN. SUMO-L5-CVN was expressed in the cytoplasm of E. coli BL21 in a soluble form by SUMO fusion expression system. After the
optimization of expression conditions, SUMO-L5-CVN was highly expressed in E. coli BL21 under the induction of IPTG （20℃, 24 h, 0.5 mmol/L）.
The fusion protein was expressed up to 30% of the total protein. The recombinant L5-CVN was purified to homogeneity by 2 rounds of Ni-NTA
affinity chromatography and one round of SUMO protease cleavage. Nanomolar concentration of L5-CVN have a high affinity with the viral
envelope glycoprotein gp120.
Key words: Cyanovirin-N Linker Fermentation Purification
蓝藻抗病毒蛋白-N（Cyanovirin-N，CVN）是
1997 年美国国家癌病研究院从蓝藻中分离得到的一
种全新的具有抗病毒活性的水溶性糖蛋白［1］。CVN
具有广谱的抗病毒活性，对 HIV、流感病毒、HSV
和抗埃博拉（Ebola）等病毒都有拮抗作用，同时具
有稳定的理化特性，能抵抗变性剂、去垢剂和有机
溶剂的处理［2］。CVN 与病毒表面糖蛋白上甘露寡糖
有高亲合性，它能阻止宿主细胞表面受体与病毒的
结合，阻止了病毒的传播，这一特点使它不易引起
耐药性［3-5］。这些使得 CVN 蛋白成为一种很有价值
的抗病毒药物［6-9］。
CVN 是小分子蛋白，内部有两个二硫键，使
得该蛋白在大肠杆菌中表达困难［3］。到目前为止，
CVN 的表达已经在一些系统中完成，包括细菌和
转基因植物，但是蛋白产量低且生物活性大多不
高［9-12］。本实验室通过分子设计及优化，借助
SUMO 融合表达系统，实现了 SUMO-CVN 在大肠杆
菌中可溶性、高效表达。
2012年第5期 117杨辉等 ：蓝藻抗病毒蛋白-N 衍生物的克隆、发酵与纯化
在前期研究中，本课题组已经实现了 SUMO-
L15-CVN（Linker 序列为 15 个氨基酸）的高表达，
它具有可溶、生物活性高等特点［3］。 研究发现，
Linker 序列会对蛋白的折叠与活性产生影响，故为
了追求更好的具有生物活性的 CVN 衍生蛋白，还需
对其他长度 Linker 的 SUMO-L-CVN 进行研究。本研
究通过重叠 PCR 合成连接肽为（GGGGS）的 SUMO-
L5-CVN，通过一系列的诱导、表达、纯化以及抗病毒
活性的研究，希望获得一种活性更高的 CVN 衍生蛋
白。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒 宿主菌大肠杆菌 BL21（DE3）、
质粒pET-3c及菌种SUMO-L15-CVN由本实验室保存。
1.1.2 酶及生化试剂 蛋白 Marker、Taq酶、T4 DNA
连接酶、限制性内切酶、IPTG、考马斯亮蓝均购自
上海生工生物公司。引物由上海生工生物工程有限
公司合成。NdeⅠ、BamHⅠ 购自宝生物（大连）有
限 公 司。Ni SepharoseTM 6 Fast Flow 购 自 Amersham
公司。测序由上海英骏生物技术有限公司完成。其
它生化试剂如氨苄青霉素（Amp）、无水乙醇、甲醇、
琼脂糖等试剂均为进口分装试剂或国产试剂。
1.1.3 SUMO-L5-CVN 基因的引物设计与扩增 根据
SUMO-L5-CVN 基因序列设计合成了 4 条引物，引入
两个酶切位点 BamH Ⅰ和 NdeⅠ，设计的引物分别
为 R-SUMO ：5-TCCGCCACCACCACCAATCTGTTCT-
CTG-3，F-SUMO：5-CAGCATATGCATCATCATCATC
-3，下划线部分为 NdeⅠ酶切位点 ；F-CVN ：5-CA-
GATTGGTGGTGGTGGCGGAGGGAGCCTTGGTAAATT-
CTCCCAG-3；R-CVN：5-AGAGGATCCTCATCATTC-
GTATTTCAGGGTAC-3，下划线部分为 BamH Ⅰ酶切
位点。
1.2 方法
1.2.1 PCR 合成 SUMO-L5-CVN 全序列 如图 1 所
示， 以 SUMO-L15-CVN（Linker 序 列 为 15 个 氨 基
酸）为模板，设计特异性引物，分别添加 BamH Ⅰ
和 NdeⅠ酶切位点，通过引物重叠延伸的方法合成
SUMO-L5-CVN 的全长基因，分别以（F-CVN、R-CVN）
为引物对合成 A1、以（F-sumo、R-sumo）为引物
对合成 A2、A1 含有 CVN 全长的 DNA 序列，A2 含
图 1 PCR合成 SUMO-L5 -CVN全长序列方案
有 SUMO 全长的 DNA 序列。A1 和 A2 为模板并以
（F-SUMO，R-CVN）为上下游引物，进行 PCR 反应，
从而得到目的基因的全长 DNA 序列。
1.2.2 表达质粒的构建及序列分析 将载体质粒
pET-3c 与 PCR 扩增后产物用 NdeⅠ与 BamH Ⅰ进行
双酶切，酶切产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，回收
酶切产物，按 1 8 的比例用 T4 DNA 连接酶在 16℃
连接过夜，重组质粒转化大肠杆菌 DH5α 感受态细
胞，于 37℃培养过夜，随机挑取 4 个菌落，接种到
LB 培养基中（Amp 终浓度为 100 μg/mL），然后进
行 PCR 鉴定和 NdeⅠ与 BamH Ⅰ双酶切鉴定，将双
酶切鉴定正确的质粒送上海英骏生物技术有限公司
测序。
1.2.3 三角瓶中的诱导表达 将连接成功的质粒转
化进大肠杆菌 BL21 中，涂布到含 Amp 的 LB 平板上，
挑单克隆接种于 50 mL 的 LB 培养基中（含 Amp
100 μg/mL），于 37℃培养过夜，按 1% 的比例接种
到 300 mL 的 LB 培养基中，37℃摇床中培养，当培
养液 OD600 值达到 0.6-0.8 时，加入 150 μL 的 IPTG
（终浓度为 0.5 mmol/L），调节温度到 20℃，诱导 24 h，
进行 SDS 电泳，观察表达情况，挑选高表达的菌株
进行 -80℃保存。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期118
1.2.4 SUMO-L5-CVN 融合蛋白的发酵
1.2.4.1 融合蛋白的摇瓶发酵 选取高表达菌株接
种到 1 L LB 培养基中（含 Amp 100 μg/mL），按 1.2.3
中的条件，诱导并离心收集菌体，超声破碎（400 W，
20 min），离心分离上清和沉淀，分别对上清和沉淀
SDS-PAGE 分析，观察目的蛋白的表达情况，从而
对目的蛋白进行可溶性分析。
1.2.4.2 融合蛋白的中试发酵 将过夜培养的种子
以 10% 比例接种于含 16 L 发酵培养基的 30 L 发酵
罐中进行培养。最初培养温度为 37℃。培养 2 h 后，
连续流补充 30%（g/L）的葡萄糖，至 OD600 到 8-10
时，加入终浓度为 0.5 mmol/L IPTG，温度调至 20℃
后诱导表达 24 h。整个发酵过程 pH 通过自动酸碱
调节装置控制在 7.0 左右。溶氧通过控制转速和通
气装置控制在 30% 以上。诱导后每隔 4 h 取样保存
于 -80℃备用。发酵结束后，发酵液通过连续离心机
在 4℃条件下离心 60 min 后，收集菌体保存于 -80℃。
1.2.5 L5-CVN 蛋白纯化及 Western blotting 鉴定
CVN 蛋白纯化步骤按参考文献［1］进行，Western
blotting 鉴定步骤按参考文献［3］进行。
1.2.6 gp120 蛋白结合试验 gp120 蛋白结合按参考
文献［1］进行。
2 结果
2.1 PCR合成SUMO-L5-CVN全序列
以 SUMO-L15-CVN 为模板，根据设计好的引物进
行 PCR。PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，目
的基因大小为 652 bp （图 2），电泳结果与理论一致。
可以见到 4 638 bp 和 652 bp 两条带（图 3），理论与
电泳结果吻合。同时挑选阳性克隆送英骏公司测序，
结果表明，其序列与预期一致。
M. DNA Marker ；1. SUMO-L5-CVN
图 2 PCR合成 SUMO-L5-CVN的 DNA序列
M. DNA Marker ；1. pET-SUMO-L5-CVN ；2. pET-SUMO-L5-
CVN/BamH Ⅰ +NdeⅠ双酶切
图 3 重组 pET-SUMO-L5-CVN质粒限制酶分析
2.3 SUMO-L5-CVN表达蛋白的摇瓶发酵及可溶性
分析
在 300 mL 摇瓶中培养液 OD600 值达到 0.8 时，
加入 IPTG 150 μL（终浓度为 0.5 mmol /L），调节温
度到 20℃，诱导 24 h。取样品诱导前及诱导后 2、4、
8 和 24 h 5 个时间点进行全蛋白 SDS-PAGE。对离心
后得到的菌体 PBS 溶解后超声破碎，然后高速离心，
对沉淀和上清等样品进行 SDS-PAGE。结果（图 4）
表明，重组蛋白在上清和沉淀之中都有分布，且灰
度扫描分析确定 24 h 表达量最高且约为 30%。
M.蛋白质标准分子量；1.诱导前；2-5.分别经2、4、8和24 h诱导表达；
6. 超声破碎后上清 ；7. 超声破碎后沉淀
图 4 目的蛋白诱导后不同时间的 SDS-PAGE及
表达产物的可溶性分析
2.2 SUMO-L5-CVNDNA序列的合成及表达载体构建
对重组质粒进行 BamH Ⅰ和 NdeⅠ双酶切鉴定，
2012年第5期 119杨辉等 ：蓝藻抗病毒蛋白-N 衍生物的克隆、发酵与纯化
2.4 L5-CVN蛋白的纯化及Western blotting鉴定
取上清进行 Ni-NTA 树脂亲和纯化，得到纯度
较高的 SUMO-L5-CVN，用 SUMO 酶对蛋白进行 30℃
酶切。酶切产物的 SDS-PAGE 电泳，30℃，1.5 h 条
件下，融合蛋白被完全切开。酶切产物再次用 Ni-
NTA 亲和层析柱进行纯化得到目的蛋白 L5-CVN，
SDS-PAGE 电泳，灰度扫描显示目的蛋白纯度达到
95% 以上。将目的蛋白进行 Western blotting 鉴定，
结果（图 5）显示，17 kD 和 10 kD 之间有条带，与
理论值 11 kD 相符，证明该蛋白是 L5-CVN。
M. 蛋白质标准分子量 ；1. L5-CVN 蛋白 ；2. L15-CVN 蛋白
图 5 Western blotting分析
3 讨论
近年来“非典”、手足口病及禽流感等已经严重
危害到了人类的健康和生命，但对病毒性疾病的治
疗至今仍缺乏专属性强的药物。CVN 是一种极具潜
力的天然药物资源，其具有较高的稳定性 ；较小的
细胞毒性 ；并且具有多种抗病毒活性，被认为是当
前最具潜在应用价值的抗病毒制剂。CVN 的作用靶
点不在宿主细胞上，而在病毒表面。CVN 能结合病
毒表面的 gp120，使 gp120 构象发生改变，不能结合
细胞表面的 CD4 和其他受体，进而阻断病毒与细胞
或感染细胞与未感染细胞间的黏附与融合，从而阻
断病毒感染，相当于病毒的钝化剂。Bolmstedt 等［13］
图 7 目的蛋白的中试发酵
M. 蛋白标准分子质量 ；1. 诱导前 ；2-7. 分别诱
导 2、6、10、14、18 和 22 h
图 6 中试发酵时诱导不同时间的目的蛋白的
SDS-PAGE电泳图
图 8 ELISA分析重组蛋白与 gp120的亲和力
2.5 SUMO-L5-CVN的中试发酵
在发酵过程中，每隔一段时间对 OD、通气（Air）、
pH、溶氧（DO）进行取值。样品进行 SPS-PAGE 电
泳发现，目的蛋白在中试发酵条件下可获得高效表
达（图 6），通过灰度扫描测得表达量达 25%。细胞
在诱导 11 h 后即停止生长，最终 OD600 为 30 左右（图
7）。同时 L5-CVN 的中试发酵工艺的建立，为今后
L5-CVN 药效学的进一步研究以及 CVN 的其他衍生
蛋白的中试发酵提供基础。
2.6 CVN与gp120蛋白的亲和力
利用 ELISA 试验分析了重组蛋白与 gp120 蛋白
的结合力。结果（图 8）表明，CVN 及 CVN 衍生蛋
白与 gp120 蛋白都有较高的亲和力，并且呈现出一
定的浓度依赖性，且 L5-CVN 在低浓度剂量依旧有着
较高的结合率，从理论上说明了 L5-CVN 可能具有更
好的抑制 HIV 的活性。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期120
发现，CVN 只结合在 HIV 的 gp120 或 HSV-1 游离下
来的甘露糖寡糖上，而不是糖蛋白的其他寡糖上 ；
他们的试验还证实了 CVN 分子上有对 8-9 个甘露糖
的识别位点［1, 14］。
过去在大肠杆菌中表达的 CVN 蛋白，多以包涵
体形式表达的，纯化过程复杂。Mori 等［15］用 pelB
信号肽序列替换 ompA，并在 pET-26b（+）载体中
表达成功，但该表达重组蛋白的方法产量较低，每
升高密度培养产物最高只能纯化得到 10 mg 目的蛋
白，无法满足大规模生产的需要。SUMO 蛋白融合
表达系统是一种有效地表达小分子量蛋白的表达方
法，具有抗蛋白酶解、增加重组蛋白表达量、促进
蛋白正确折叠、能准确无误地切除融合标签、纯化
工艺简单等优点［8］。本实验室先前构建了 SUMO-
L15-CVN 融合表达系统，实现了菌株的高表达且蛋
白以可溶的形式成在，每升高密度培养产物最高能
纯化得到 70-80 mg 目的蛋白，为今后开展产业化生
产奠定了基础。
4 结论
本试验成功构建了重组表达载体 pET-SUMO-
L5-CVN，SUMO 中含有 His 标签，所以用 Ni-NTA 亲
和层析即可简单方便地纯化出目的蛋白，SUMO 又
可以被 SUMO 蛋白酶切除，可以在纯化后切除融
合 SUMO 标签。建立了中试发酵工艺，发现目的蛋
白在中试发酵条件下可获得高效表达，表达量可达
25%。ELISA 试验验证了 L5-CVN 在低浓度剂量依旧
有着较高的结合率，从理论上说明了 L5-CVN 可能具
有更好的抑制 HIV 的活性。
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（责任编辑 马鑫）