全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):220-228
现阶段最常用的三大基因编辑技术主要有锌
指核酸酶技术（Zinc finger nucleases，ZFNs）、转录
激 活 样 效 应 子 核 酸 酶 技 术（Transcription activator-
like effector nucleases，TALENs）、CRISPR/Cas9 技
收稿日期 ：2015-03-04
基金项目 ：国家自然科学基金面上项目（31371346）
作者简介 ：高敬，女，硕士研究生，研究方向 ：遗传学研究新技术与新方法 ；E-mail ：gaojing201201@126.com
通讯作者 ：聂凌云，女，博士，研究方向 ：遗传学研究新技术与新方法 ；E-mail ：nielingyun@126.com
TALENs 新型模块组装法及活性鉴定方法
高敬1，2  魏迪1，2  池振奋3  张癸荣1，2  张万明1  聂凌云1，2
（1. 河北北方学院，张家口 075000 ；2. 中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所，北京 100166 ；3. 中国科学院北京基因组研究所，
北京 100101）
摘 要 ： 旨在提供一种新型的转录激活样效应子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）模
块组装法（Unit assembly，UA）及活性鉴定方法。利用 TALE-NT 2.0 在线工具在线粒体 DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）设
计 TALENs 识别位点和剪切位点，借助 pEGFP-N1 质粒将该段靶序列随机整合于 HEK293F 核基因组中，构建 HEK293F-T1 细胞
系，用于 TALENs 活性鉴定。依据转录激活样效应子（Transcription activator-like effectors，TALEs）自然单元模块序列，设计
出一种新型的人工 TALEs 偏单元 ；根据 TALENs 识别位点，选取相应一单元模块，利用 UA 法组装 ；并设计出含有相应双酶切位
点的 TALEs 串联模块序列和 TALENs 载体序列，定向连接后瞬时转染 HEK293F-T1 细胞系。结果显示，新型模块组装法定向组装
TALEs 模块，克隆效率高且瞬时转染后可看到清晰的套峰。结果表明，新型模块组装方法提高了 TALENs 构建过程中的克隆效率，
并且不受末位 0.5 模块的 RVD（repeat-variable diresidue）限制，增加了靶序列设计的灵活性。
关键词 ： 转录激活样效应子核酸酶 ；模块组装法 ；线粒体 DNA ；HEK293F-T1
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.035
A Novel Method of Unit Assembly and Activity Assay for Transcription
Activator-like Effector Nucleases
GAO Jing1，2 WEI Di1，2 CHI Zhen-fen3 ZHANG Gui-rong1，2 ZHANG Wan-ming1 NIE Ling-yun1，2
（1. Hebei North University，Zhangjiakou 075000 ；2. Institute for Drug and Instrument Control，Health Department，the General Logistics
Department of People’s Liberation Army，Beijing 100166 ；3. Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）
Abstract: A novel method of unit assembly（UA）and activity assay based on transcription activator-like effector nucleases（TALENs）
are described. An online tool TALE-NT 2.0 was used to design recognition and splice sites on mitochondrial DNA（mtDNA）of TALENs. By
means of pEGFP-N1 plasmid, the segments of target sequence were randomly integrated in the nuclear genome of HEK293F. The constructed
cell line HEK293F-T1 was for activity assay of TALENs. Based on transcription activator-like effector（TALE）natural repeats, a new type of
artificial TALEs single-unit repeats were designed. According to the recognition sites of TALENs, appropriate single-unit repeats were selected
and assembled by UA. TALEs series unit sequence containing the corresponding double enzyme cutting sites and TALENs vector sequence
were designed, which was directionally ligated and transiently transfected into HEK293F-T1 cell line. The results showed that the TALES units
were directionally assembled by new method, and it had a high cloning efficiency ；moreover, the nested peaks clearly appeared after transient
transfection. In conclusion, the novel method of unit assembly improves cloning efficiency of constructing TALLENs, even is not limited by
repeat-variable residue（RVD）in the last 0.5 unit, and increases the flexibility of designing the target sequences.
Key words: transcription activator-like effector nucleases ；unit assembly ；mitochondrial DNA ；HEK293F-T1
2016,32(1) 221高敬等：TALENs 新型模块组装法及活性鉴定方法
术（Clustered regularly interspaced short palindromic
Repeats/Cas9 nuclease）［1］。 其 中 TALENs 技 术 具
有无上下文效应［2］、脱靶效率低于 ZFNs 技术和
CRISPR/Cas9 技术［3］、特异性高等优点，现已成为
一种广泛应用的基因定点修饰技术。
TALENs 由转录激活样效应子蛋白（Transcription
activator-like effector，TALE）、识别域和 FokI Ⅱ核酸
酶及切割域组成［4］。其中，TALE 蛋白源自黄单胞
杆菌，一般由 N 端、C 端和中央串联重复模块组成，
N 端包含Ⅲ型转运信号（Translocation signal）；C 端
包 含 核 定 位 信 号（Nuclear localization signal，NLS）
和酸性转录激活域（Activation domain，AD）；中央
重复模块具有“一模块识别一碱基”的特点，且没
有上下文效应，其结构高度保守，一般由 34 个氨基
酸组成，仅在 12 和 13 位高度可变，又称这两位的
氨 基 酸 为 RVD（Repeat-variable diresidue）［2，5，6］。
本研究采用并改造 TALENs 的精简处理的骨架，即
N 端 包 含 136 个 氨 基 酸，C 端 包 含 63 个 氨 基 酸，
且 C 端 融 合 有 FokI Ⅱ 型 核 酸 内 切 酶［7-10］。 利 用
TALENs 这些结构特点可以构建识别任何 DNA 序列
的 TALENs，包括核基因组和线粒体基因组［11，12］。
在 TALENs 应用中，TALENs 的中央重复模块
的组装是限速步骤，目前为止，最常用的 TALENs
构建方法大体可分为 Golden Gate 法［13-16］、FLASH
（Fast Ligation-based automatable solid-phase high-
throughput） 法［17，18］、 模 块 组 装 法（unit assembly，
UA） 法［7］ 及 其 他 方 法， 如 LIC 法（Ligation-
independent cloning）［19］、ICA 法（Iterative capped
assembly）［20］、idTALE 法［21］、REAL 法（Restriction
enzyme and ligation）［22］ 等。 其 中 Golden Gate 法、
FLASH 法最为省时，然而这两种方法存在的酶切连
接效率问题或因 PCR 技术的限制性而出现非特异的
问题难以避免，相比之下，UA 法虽构建时间较长，
但 TALENs 编码序列可控且没有上述问题，同时可
以根据密码子简并原则改变 TALEs 编码序列，降低
TALENs 重复模块编码序列的重复性，降低 mRNA
的重复性，有助于提高 TALENs 在真核细胞内表达
效率。本研究提供了 TALENs 的一单元模块编码序
列库，并改造表达载体 pCS2-peas/perr，利用 UA 法
定向组装 TALENs。鉴于目前没有报告清晰的介绍
线粒体 DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）双链断
裂（Double-strand breaks，DSB） 的 修 复 机 制， 本
研究将 mtDNA 靶序列随机整合于核染色体中，利
用核基因组的同源重组（Homologous recombination，
HR）和非同源末端连接（Non-homologous DNA end
joining，NHEJ）修复方式［23］，以检测新型模块组装
法构建的 TALENs 活性，旨在为编辑 mtDNA 提供新
方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 HEK293F 细胞为本实验室保存。
1.1.2 试 剂 和 引 物 Xba I、Nhe I、AsiS I、Sac I、
BamH I 等限制性核酸内切酶购自 NEB 公司 ；质粒
小提试剂盒购自北京庄盟国际生物公司 ；高纯度小
提中量试剂盒购自天根生物科技公司 ；HA、Flag、
β-actin 抗 体 购 自 Sigma 公 司 ；Anti-Rabbit、Anti-
mouse 抗体购自 CST 公司 ；转染试剂 X-tremeGENE
HP DNA Transfection Reagent 购 自 Roche 公 司 ；
DMEM 高糖培养基购自 Invitrogen 公司 ；胎牛血清购
自 Biowest 公司 ；pUC19、pEGFP-N1 质粒由本实验
室保存 ；pCS2-peas/perr 质粒购自康为世纪公司 ；所
有引物序列（表 1）由生工生物工程（上海）股份
有限公司合成 ；测序由华大基因公司完成。
1.2 方法
1.2.1 细胞的培养 HEK293F 细胞以及 HEK293F-
T1 细胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基培养于
37℃、5%CO2 温箱中。
1.2.2 pCS2-peas/perr 载体骨架的改造 本研究于载
体 0.5 单元的 RVD 编码序列两侧分别构建 AsiS I 和
Xba I 酶切位点，如图 1 所示。实验方法如下 ：以
pCS2-peas/perr 载 体 质 粒 为 模 板，TALEN0.5_N-F/R
为引物对，扩增得到全长质粒对，PCR 产物经 DpnI
酶切，转化后挑单克隆菌落，pCS2-NF/CR 引物对测
序鉴定出阳性质粒，最终得到载体质粒 pCS2-0.5U-
peas/perr。
1.2.3 TALEs 一单元模块的构建 基于 TALEs 自然
单元模块序列［6］和 UA 法的人工单元模块序列［7］，
本研究设计的人工单元模块序列命名为偏单元（图
2），起始于 TALEs 自然模块的 +19 位氨基酸残基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1222
Leu，终止于下一个自然模块的 +18 位氨基酸残基
Ala。于偏单元序列的两端分别构建 Xba I、Nhe I 同
尾酶识别位点，于 RVD 区附近构建 AsiS I 酶切位点。
根据 AsiS I 酶切位点的有无分为活动一单元模块（含
AsiS I 酶切位点）和固定一单元模块（不含 AsiS I 酶
切位点）。活动一单元模块位于 TALEs 重复模块的
首位，并命名为 0 序列，依次标记为 A0、C0、G0、
T0。固定一单元模块位于第 2 位及后续位置。由于
氨基酸密码简并性和第 4 位、32 位氨基酸残基的高
度可变，TALEN 模板序列数目模大，经排列组合计
算后结果如表 2 所示。选取了氨基酸序列一致的 4
种基本骨架 a1、c1、g1、t1，碱基序列不同但差异
率并非最大（折中差异 性 ），N-LETVQRLLPVLCQ
AHGLTPEQVVAIASNIGGKQA-C（ 灰 色 背 景 部 分 为
RVD 区）。依次构建含有 4 种 RVD（NI、HD、NN、
NG） 的 一 单 元 模 块， 依 次 标 记 为 A1、A2、A3、
A4，C1、C2、C3、C4，G1、G2、G3、G4，T1、
T2、T3、T4，如表 3 所示。
活动单元的构建以 C0 序列为例，构建方法如
下 ：以 C0 的 DNA 编码序列（表 3）为模板分别合
成 Oligo 片段 C0-L1、C0-L2 和 C0-S1、C0-S2（表 4），
C0-L1/C0-L2、C0-S1/C0-S2 分别退火，得到片段 C0-
L、C0-S，对 pUC19 质粒进行 BamH I/Sac I 双酶切，
将片段 C0-S 连入，再次进行 Xba I/AsiS I 双酶切，将
片段 C0-L 连入，得到包含 C0 序列的 pUC19-C0 质
粒（图 3）。合成 A0-S1/A0-S2、G0-S1/G0-S2（NN）、
T0-S1/T0-S2（序列见表 4），两两退火后，分别连入
AsiS I/Nhe I 双酶切后的 pUC19-C0 偏单元载体，得
到 分 别 包 含 A0、G0 和 T0 序 列 的 质 粒 pUC19-A0、
pUC19-G0、pUC19-T0。从合成方法来看，A0、C0、
T0 和 G0 序列除了 RVD 区编码序列不同外，其他位
置编码序列均相同。
固定单元的构建以 A1 为例，构建方法如下 ：
根 据 A1 的 DNA 编 码 序 列（ 表 3）， 合 成 Oligo 片
NLS N-Ter 136 C-Ter 63 FokI AS/RR
0.5 Unit
Nhe I
pCS2-peas/perr
3×FLAG/HAA
BamH I
NLS N-Ter 136 C-Ter 63 FokI AS/RR
0.5 Unit
Xba I
pCS2-0.5U-
peas/perr
3×FLAG/HA
B
BamH IAsisI
C CCCC C C C C C C C C C C
XbaIAsiS I
G GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGT T T T T T T T T AAAAAAAAAAAAA G
CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCG GGGG G G G G G G G G G GAAAAAAAAA
L
in frame with 3xFLAGT P E Q V V A I A S
0.5U
N G G G K Q A L E
T T T T T TT T T T T T T
表 1 pCS2-0.5U-peas/perr 构建所需引物
引物名称 引物序列（5-3）
TALEN0.5_N-F GATCGCTAGTAATGGCGGCGGCAAACAGGCTCTAGAGAGCATTGTTGCCCAGTTATCTC
TALEN0.5_N-R TCTAGAGCCTGTTTGCCGCCGCCATTACTAGCGATCGCCACCACCTGCTCCGGG
pCS2-NF GTGGCGGGAGAGTTGAGAGGTCCACCGTTACAG
pCS2-CR GCCAAGGCGACGAGGTGGTCGTTGGTCAACG
A ：pCS2-peas/perr 载体骨架改造示意图 ；B ：改造后 0.5U 序列及酶切位点详图
图 1 pCS2-0.5U-peas/perr 构建示意图
2016,32(1) 223高敬等：TALENs 新型模块组装法及活性鉴定方法
段 A1-L1、A1-L2 和 A1-S1、A1-S2（表 5），分别退
火，得到片段 A1-L、A1-S。以 A1-L1 和 A1-S2 为引
物，A1-L、A1-S 为模板，扩增得到 A1。以 A1 为骨
架，RVD 区 分 别 换 为 其 他 3 种 RVD（HD、NN 和
NG）的编码序列，可得到 C2、G2 和 T2。其他模块
构建方法为，将 A1-S2 的 RVD 去分别改为其他 3 种
1 11Spe I Nhe I Nhe IXba ICBA 19 34
A ：横线部分为 TALEs 自然单元重复模块序列，横线外部分为末位 0.5 单元模块 ；
B ：UA 法人工单元重复序列 ；C ：本课题组人工单元重复序列
图 2 TALEs 偏单元的氨基酸序列示意图
表 2 TALE 一单元模块排列组合计算表
OligoName Calculation Results Computational Formula Amino Acid Sequence
A1 173133498956120064
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*4*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*3*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASN
IGGKQA
A2 86566749478060032
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*2*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*3*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASN
IGGKQA
A3 173133498956120064
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*4*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*3*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASN
IGGKQA
A4 86566749478060032
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*2*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*3*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASN
IGGKQA
C1 115422332637413376
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*4*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*2*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASH
DGGKQA
C2 57711166318706688
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*2*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*2*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASH
DGGKQA
C3 115422332637413376
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*4*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*2*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASH
DGGKQA
C4 57711166318706688
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*2*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*2*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASH
DGGKQA
G1 115422332637413376
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*4*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*2*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASN
NGGKQA
G2 57711166318706688
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*2*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*2*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASN
NGGKQA
G3 115422332637413376
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*4*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*2*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASN
NGGKQA
G4 57711166318706688
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*2*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*2*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASN
NGGKQA
T1 230844665274826752
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*4*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*4*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASN
GGGKQA
T2 115422332637413376
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*2*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*4*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASN
GGGKQA
T3 230844665274826752
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*4*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*4*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASN
GGGKQA
T4 115422332637413376
6*2*4*2*2*6*6*6*4*2*6*2*2*2*2*4*6*4*4*2*2*2*2*4*3*
4*6*2*4*4*4*2*2*4
LETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASN
GGGKQA
注 ：表中标示黄色背景的字母分别为自然单元中 +32 位和 +4 位，以下序列中加粗字母与第一序列中黄色背景字母对应
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1224
RVD（HD、NN 和 NG）的编码序列，命名为 C2-ar、
G2-ar 和 T2-ar（表 5），分别和 A1-L1 组成引物对，
以 A1 为 模 板， 扩 增 得 到 C2、G2 和 T2。 最 终 得
到 A1、C1、G1、T1，A2、C2、G2、T2，A3、C3、
G3、T3，A4、C4、G4、T4。
1.2.4 靶 序 列 的 选 择 与 TALEs 中 央 重 复 模 块
的 组 装 在 NCBI 查 询 得 到 人 线 粒 体 DNA 序 列
（NC_012920.1）， 利 用 TALE-NT 2.0（TAL Effector
Nucleotide Targeter 2.0） 设 计 一 系 列 TALENs 靶 序
列。经过靶位点比对和筛选，本研究选取选择线粒
表 3 0 序列与 4×4 一单元模块序列表
序号 骨架 碱基序列（5-3）
A0 0
CTAGAGACCGTGCAACGGCTGCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGCCTGACTCCTGAGCAAGTTGTAGCGATcGCAAGTAATATT
GGTGGCAAACAGGCG
A1 a1
CTAGAGACTGTCCAGCGCCTGCTTCCCGTGCTGTGCCAAGCGCACGGCCTCACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCCTCCAACATT
GGCGGGAAACAGGCG
A2 c1
CTAGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGTTTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCtATCGCAAGCAACATT
GGAGGAAAGCAAGCG
A3 g1
CTAGAAACGGTGCAGAGGCTCCTTCCAGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCAATCGCGAGCAACATT
GGCGGAAAACAGGCG
A4 t1
CTAGAAACCGTACAACGATTGCTGCCGGTGCTGTGCCAAGCGCACGGGCTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCCATTGCCTCGAACATT
GGGGGCAAACAGGCG
C0 0
CTAGAGACCGTGCAACGGCTGCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGCCTGACTCCTGAGCAAGTTGTAGCGATcGCAAGTCATGAC
GGTGGCAAACAGGCG
C1 c1
CTAGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGTTTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCtATCGCAAGCCACGAC
GGAGGAAAGCAAGCG
C2 a1
CTAGAGACTGTCCAGCGCCTGCTTCCCGTGCTGTGCCAAGCGCACGGCCTCACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCCTCCCACGAC
GGCGGGAAACAGGCG
C3 g1
CTAGAAACGGTGCAGAGGCTCCTTCCAGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCAATCGCGAGCCACGAC
GGCGGAAAACAGGCG
C4 t1
CTAGAAACCGTACAACGATTGCTGCCGGTGCTGTGCCAAGCGCACGGGCTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCCATTGCCTCGCACGA
CGGGGGCAAACAGGCG
G0 0
CTAGAGACCGTGCAACGGCTGCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGCCTGACTCCTGAGCAAGTTGTAGCGATcGCAAGTAACAAT
GGTGGCAAACAGGCG
G1 g1
CTAGAAACGGTGCAGAGGCTCCTTCCAGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCAATCGCGAGCAATAAC
GGCGGAAAACAGGCG
G2 a1
CTAGAGACTGTCCAGCGCCTGCTTCCCGTGCTGTGCCAAGCGCACGGCCTCACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCCTCCAATAAC
GGCGGGAAACAGGCG
G3 c1
CTAGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGTTTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCtATCGCAAGCAATAAC
GGAGGAAAGCAAGCG
G4 t1
CTAGAAACCGTACAACGATTGCTGCCGGTGCTGTGCCAAGCGCACGGGCTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCCATTGCCTCGAATAA
CGGGGGCAAACAGGCG
T0 0
CTAGAGACCGTGCAACGGCTGCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGCCTGACTCCTGAGCAAGTTGTAGCGATcGCAAGTAATGGG
GGTGGCAAACAGGCG
T1 t1
CTAGAAACCGTACAACGATTGCTGCCGGTGCTGTGCCAAGCGCACGGGCTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCCATTGCCTCGAATGG
AGGGGGCAAACAGGCG
T2 a1
CTAGAGACTGTCCAGCGCCTGCTTCCCGTGCTGTGCCAAGCGCACGGCCTCACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATCGCCTCCAATGGA
GGCGGGAAACAGGCG
T3 c1
CTAGAAACAGTACAGAGGCTGTTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGTTTAACCCCAGAGCAGGTCGTGGCtATCGCAAGCAATGGA
GGAGGAAAGCAAGCG
T4 g1
CTAGAAACGGTGCAGAGGCTCCTTCCAGTGCTTTGTCAGGCACACGGCCTCACTCCGGAACAAGTGGTCGCAATCGCGAGCAATGG
AGGCGGAAAACAGGCG
2016,32(1) 225高敬等：TALENs 新型模块组装法及活性鉴定方法
体 DNA（NC_012920.1） 的 16347-16387 位 为 靶 序
列，5-TCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGACCC
CCCTCAGA TA-3，并依据该靶序列设计 TALEs 的
串联重复模块。本研究设计选取 12.5 个 TALEs 模
块，Left-arm ：5 -CAAATCCCTTCTC-3 ；Right-Arm ：
5-ATCTGAGGGGGGT-3。
用 Nhe I/Sac I 和 Xba I/sac I 分别对模块载体和目
的模块序列进行酶切、连接，依次由一单元得到二
单元，得到四单元，再根据设计序列进行灵活连接［7］。
本研究组构建的三单元模块库，分别由 4 个三单元
模块两两相连，得到 2 个六单元模块，再次相连后
与活动一单元连接，最后得到 13 单元 TALE-13U，
Left-arm 的构建如图 4 所示，然后将其进行 AsiS I 和
Nhe I（Xba I 的同尾酶）双酶切，连接入 pCS2-0.5U-
peas/perr 载体，得到 pCS2-12.5U-L/R 质粒对。
1.2.5 HEK293F-T1 细胞系的构建 合成 5 端和 3
Hind III
233
Xba I
Bam HI Asis I
Asis I
74 nt
68 nt
Nhe I Sac I 54 nt
46 nt
pUC19 MCS
Pst I Xba I BamH I Kpn I EcoR ISac I
图 3 TALEs 偏单元重复模块的碱基序列设计示意图
表 4 0 序列构建中所需 oligo 序列表
名称 碱基序列（5-3）
C0-L1 CTAGAGACCGTGCAACGGCTGCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGCCTGACTCCTGAGCAAGTTGTAGCGAT
C0-L2 CGCTACAACTTGCTCAGGAGTCAGGCCGTGGGCTTGACAGAGAACTGGGAGCAGCCGTTGCACGGTCT
C0-S1 GATCCGCGATCGCAAGTCATGACGGTGGCAAACAGGCGCTAGCGGTACCGAGCT
C0-S2 CGGTACCGCTAGCGCCTGTTTGCCACCGTCATGACTTGCGATCGCG
A0-S1 CGCAAGTAATATTGGTGGCAAACAGGCG
A0-S2 GATCGCGGACAAACGGTGGTTATAATGAACGcTA
G0-S1（NN） CGCAAGTAACAATGGTGGCAAACAGGCG
G0-S2（NN） GATCGCGGACAAACGGTGGTAACAATGAACGcTA
T0-S1 CGCAAGTAATGGGGGTGGCAAACAGGCG
T0-S2 GATCGCGGACAAACGGTGGGGGTAATGAACGcTA
A0-S1 CGCAAGTAATATTGGTGGCAAACAGGCG
表 5 4×4 序列构建中所需 oligo 序列表
名称 序列（5-3）
A1-L1 gctCTAGAGACTGTCCAGCGCCTGCTTCCCGTGCTGTGC-
CAAGCGCACGGCCTCACCCCAGAGCAGGTCGT
A1-L2 TGGGGTGAGGCCGTGCGCTTGGCACAGCACGGGAAGC-
AGGCGCTGGACAGTCTCTAGAGC
A1-S1 GGCAATCGCCTCCAACATTGGCGGGAAACAGGCgCTA-
GCGAATTCcgc
A1-S2 gcgGAATTCGCTAGcGCCTGTTTCCCGCCAATGTTGGAG-
GCGATTGCCACGACCTGCTC
C2-ar gcgGAATTCGCTAGcGCCTGTTTCCCGCCGTCGTGGGAG-
GCGATTGCC
G2-ar gcgGAATTCGCTAGcGCCTGTTTCCCGCCGTTATTGGAG-
GCGATTGCC
T2-ar gcgGAATTCGCTAGcGCCTGTTTCCCGCCTCCATTGGAG-
GCGATTGCC
A
A
C A
C A A A T C C C T T C T C
A A T C C C T T C T C
A A T C C C T T C T C
A A T C C C T T C T C
图 4 TALE-13U 构建示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1226
端分别含有 Nhe I、Age I 酶切位点的靶序列片段，
分别对靶序列片段和 pEGFP-N1 质粒进行 Nhe I/Age I
双酶切后，将二者进行连接、转化，挑取单克隆菌落，
经 PCR 检测，测序验证含有靶序列的目标质粒，转
染培养于 35 mm dish 的 HEK293F 细胞，24 h 后消化
转移至 10 cm dish 培养，同时加 G418 筛选，在推荐
药物浓度附近设置浓度梯度，经摸索得到 G418 的
最适浓度为 1 mg/mL。挑取单克隆细胞系，继续培养，
经 PCR 扩增并测序，得到整合有靶序列的目标细胞
系，标记为 HEK293F-T1。
1.2.6 TALENs 在 细 胞 内 表 达 活 性 的 检 测 将
HEK293F-T1 细胞接种于两个 10 cm dish 中，待两
盘细胞长至生长对数期且细胞密度一致（约 24 h），
选取其中一盘细胞瞬时转染 1.2.4 中构建的质粒对
pCS2-12.5U-L/R，另一盘作为 control，再继续培养
48 h，收细胞，提取基因组，PCR 扩增后测序鉴定
打靶效果。PCR 反应为活性检测的关键步骤，反应
体系为：基因组（模板）200 ng，上 / 下游引物各 0.5
μL，LA Taq 0.5 μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ 2.5 μL，
dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L）4 μL，ddH2O 补足至
25 μL。反应程序 ：95℃ 2 min ；95℃ 15 s、60℃ 30 s，
72℃ 1 min（35 个循环）；72℃ 5 min。
2 结果
2.1 靶序列的确定
2.1.1 HEK293F 细胞线粒体中靶序列的确定 依据
线粒体 DNA（NC_012920.1），在靶序列附近设计引
物，以提取的 HEK293F 基因组为模板，扩增含有靶
序列的片段并测序，测序结果峰图如图 5 所示。
2.1.2 细胞系 HEK293F-T1 中靶序列的确定 提取
HEK293F-T1 细 胞 基 因 组 并 作 为 模 板， 在 pEGFP-
N1-T1 质粒靶序列两侧设计引物，扩增靶序列，测
序结果峰图 6 如图所示。
2.2 TALENs的构建及酶切鉴定
模 块 组 装 法 组 装 TALENs， 构 建 得 到 pCS2-
12.5U-L/R 质粒，经 AsiS I/BamH I 酶切鉴定，片段为
1 448 bp，大小如图 7-A 所示，测序结果经 Blast 比对，
左右臂的氨基酸比对结果如图 7-B 所示。
2.3 TALENs活性检测
通 过 提 取 瞬 时 转 染 pCS2-12.5U-L/R 质 粒 的
280 290 300 310
图 5 mtDNA 中靶序列测序峰图
HEK293F-T1 基因组，扩增、测序分析后，观察到靶
序列强峰下出现套峰，结果（图 8）表明，TALENs
成功的作用于 HEK293F-T1 基因组上的靶序列，造
成双链断裂后，在细胞核内进行了修复。
3 讨论
3.1 TALENs编码序列重复性与活性
TALENs 识别域是由 n 个串联的高度重复的模
块组成，在细胞转录与翻译过程中，能否对高度重
复的序列十分准确的转录翻译成重复的蛋白模块，
至今还未有研究组论证，本研究组尝试着尽量降低
TALENs 编码序列的重复性，而模块组装法恰好能够
保证构建的 TALENs 编码序列的高保真性［24］，使得
TALENs 编码序列重复性可控，提高了 TALENs 的表
达效率。
3.2 针对mtDNA的相关编辑研究
因 mtDNA 的 碱 基 序 列 长 度 远 远 小 于 nDNA
（Nuclear DNA），且线粒体中针对双链断裂的修复
机制尚未准确解析。本研究组中将 mtDNA 序列整
合于核基因组中，利用核基因组中的 HR 和 NHEJ
340 350 360 370
图 6 HEK293F-T1 基因组中靶序列测序峰图
2016,32(1) 227高敬等：TALENs 新型模块组装法及活性鉴定方法
1
76
Query
Sbjct
Query
Sbjct
Query
Sbjct
Query
Sbjct
Query
Sbjct
181
256
361
436
541
616
631
807
Query
Sbjct
811
627
Query
Sbjct
991
447
Query
Sbjct
1171
267
180
255
360
435
540
615
705
780
810
628
990
448
1170
268
1278
160
2000
bp
L
A B
R M
M: DNA Marker;
L: TAL-Left-Arm;
R: TAL-Right-Arm
1000
750
250
500
图 7 pCS2-12.5U-L/R 质粒酶切（A）及 pCS2-12.5U-L 质粒测序比对（B）结果
340330 350 360 3
图 8 pCS2-12.5U-L/R 打靶结果图
机制对其进行修复，同时考虑到 TALENs 中央重复
模块的数目是否会影响打靶效率，本研究中设计的
TALENs 均选取 12.5 个重复模块，对 nDNA 打靶效
果比较理想，进而为 mtDNA 的编辑研究奠定了基础。
Bacman［12］实验组首次利用 TALENs 编辑 mtDNA 的
相关研究，为本实验室提供了可参考的思路与方法，
本 实 验 组 下 一 步 将 进 行 mtTALENs（Mitochondria-
targeted TALENs）的研究。
4 结论
本研究中提供的新型模块组装法可定向的组
装 TALENs，提高克隆效率，并增加了靶位点设计
的灵活性，在表达强度和打靶效果上均可达到理想
效果。
参 考 文 献
［1］ Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF. ZFN, TALEN, and CRISPR/
Cas-based methods for genome engineering［J］. Trends in
Biotechnology, 2013, 31（7）：397-405.
［2］ Moscou MJ, Bogdanove AJ. A Simple Cipher Governs DNA
Recognition by TAL Effectors［J］. Science, 2009, 326（5959）：
1501.
［3］ Chen L, Tang L, Xiang H, et al. Advances in genome editing
technology and its promising application in evolutionary and
ecological studies［J］. GigaScience, 2014, 3 ：24.
［4］ Christian M, Cermak T, Doyle EL, et al. Targeting DNA double-
strand breaks with TAL effector nucleases［J］. Genetics, 2010,
186（2）：757-761.
［5］ Boch J, Scholze H, Schornack S, et al. Breaking the code of DNA
binding specificity of TAL-type III effectors［J］. Science, 2009,
326（5959）：1509-1512.
［6］ Boch J, Bonas U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors ：
discovery and function［J］. Annual Review of Phytopathology,
2010, 48 ：419-436.
［7］ Huang P, Xiao A, Zhou MG, et al. Heritable gene targeting in
zebrafish using customized TALENs［J］. Nature Biotechnology,
2011, 29（8）：699-700.
［8］ Miller JC, Tan S, Qiao G, et al. A TALE nuclease architecture for
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1228
efficient genome editing［J］. Nature Biotechnology, 2011, 29（2）：
143-148.
［9］ Szurek B, Rossier O, Hause G, et al. Type III-dependent
translocation of the Xanthomonas AvrBs3 protein into the plant
cell［J］. Mol Microbiol, 2002, 46（1）：13-23.
［10］ Mussolino C, Morbitzer R, Lutge F, et al. A novel TALE nuclease
scaffold enables high genome editing activity in combination with
low toxicity［J］. Nucleic Acids Research, 2011, 39（21）：9283-
9293.
［11］ Li T, Liu B, Spalding MH, et al. High-efficiency TALEN-based
gene editing produces disease-resistant rice［J］. Nature
Biotechnology, 2012, 30（5）：390-392.
［12］ Bacman SR, Williams SL, Pinto M, et al. Specific elimination
of mutant mitochondrial genomes in patient-derived cells by
mitoTALENs［J］. Nature Medicine, 2013, 19（9）：1111-1113.
［13］ Cermak T, Doyle EL, Christian M, et al. Efficient design and
assembly of custom TALEN and other TAL effector-based
constructs for DNA targeting［J］. Nucleic Acids Research, 2011,
39（12）：e82.
［14］ Weber E, Gruetzner R, Werner S, et al. Assembly of designer TAL
effectors by Golden Gate cloning［J］. PloS One, 2011, 6（5）：
e19722.
［15］ Zhang F, Cong L, Lodato S, et al. Efficient construction of
sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian
transcription［J］. Nature Biotechnology, 2011, 29（2）：149-
153.
［16］ Sanjana NE, Cong L, Zhou Y, et al. A transcription activator-like
effector toolbox for genome engineering［J］. Nature Protocols,
2012, 7（1）：171-192.
［17］ Reyon D, Tsai SQ, Khayter C, et al. FLASH assembly of TALENs
for high-throughput genome editing［J］. Nature Biotechnology,
2012, 30（5）：460-465.
［18］ Reyon D, Maeder ML, Khayter C, et al. Engineering customized
TALE nucleases （TALENs） and TALE transcription factors by fast
ligation-based automatable solid-phase high-throughput （FLASH）
assembly［J］. Current Protocols in Molecular Biology, 2013,
Chapter 12 ：Unit 12.6.
［19］ Schmid-Burgk JL, Schmidt T, Kaiser V, et al. A ligation-independent
cloning technique for high-throughput assembly of transcription
activator-like effector genes［J］. Nature Biotechnology, 2013, 31
（1）：76-81.
［20］ Briggs AW, Rios X, Chari R, et al. Iterative capped assembly ：
rapid and scalable synthesis of repeat-module DNA such as TAL
effectors from individual monomers［J］. Nucleic Acids Research,
2012, 40（15）：e117.
［21］ Li L, Piatek MJ, Atef A, et al. Rapid and highly efficient
construction of TALE-based transcriptional regulators and
nucleases for genome modification［J］. Plant Mol Biol, 2012, 78
（4-5）：407-416.
［22］ Sander JD, Cade L, Khayter C, et al. Targeted gene disruption in
somatic zebrafish cells using engineered TALENs［J］. Nature
Biotechnology, 2011, 29（8）：697-698.
［23］ Larsen NB, Rasmussen M, Rasmussen L J. Nuclear and mitochond-
rial DNA repair ：similar pathways?［J］. Mitochondrion, 2005, 5
（2）：89-108.
［24］ 沈延，肖安，黄鹏，等 . 类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）
介导的基因组定点修饰技术［J］. 遗传 , 2013, 35（4）：395-
409.

（责任编辑 李楠）