全 文 ：·综述与专论· 2013年第3期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
大 多 数 植 物 细 胞 壁 含 有 约 15%-40% 的 纤 维
素、30%-40% 的半纤维素、几丁质和 20% 的木质
素［1］。这些组分难以被畜禽降解，但是可以被某些
微生物产生的相应的酶系所降解。借助于这些酶的
作用，植物细胞中的淀粉、蛋白质和脂肪等营养物
质得以释放，从而提高植物饲料的消化利用率。微
生物产生的能降解植物细胞壁的酶系分为两类，第
一类为好氧真菌和细菌产生的游离纤维素酶系、半
纤维素酶系和一些辅酶 ；第二类为某些厌氧微生物
产生的大分子量胞外多酶复合体（分子量 650 kD-
2.5 MD）［2］，称为纤维体（cellulosome）。
纤维体的基本组件是非催化活性的脚手架蛋
收稿日期 ：2012-02-10
基金项目 ：“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAD26B00-04）
作者简介 ：李俊霞，女，博士研究生，研究方向 ：饲料生物技术 ；E-mail: lijunxia_cau@163.com
通讯作者 ：张日俊，男，教授，博士生导师，研究方向 ：饲料生物技术 ；E-mail: zhangrj621@yahoo.com.cn
嗜纤维梭菌纤维体研究进展
李俊霞  张日俊  陈东东
（中国农业大学动物科技学院，北京 100193）
摘 要 ： 植物细胞壁因含有纤维素类物质而难以被畜禽降解，但是可以被纤维素酶类降解。能降解植物细胞壁的纤维素酶
系包括游离纤维素酶和胞外多酶复合物—纤维体两种。纤维体的基本组件是非催化活性的脚手架蛋白和多个具有催化活性的糖基
水解酶亚单位，各酶亚单位通过自身的坞因子和脚手架蛋白上相应的黏附域特异性相结合。主要是对嗜纤维梭菌纤维体的结构、
功能、基因簇和基因工程方面的研究进展进行综述，为其他纤维体的研究提供思路及构建特殊功能的 mini-cellulosome、纤维体在
生物技术上的应用奠定理论基础。
关键词 ： 纤维体 嗜纤维梭菌 脚手架蛋白 纤维体酶 基因簇 表达调控
Research Progress of Clostridium cellulovorans Cellulosome
Li Junxia Zhang Rijun Chen Dongdong
（College Animal Science & Technology，China Agricultural University，Beijing 100193）
Abstract:  Cellulose, the main structural component of plant cell walls, is extremely difficult degrade. Cellulases play an important role
in the degradation of cellulosic materials, which have been found either as free enzymes or as a large extracellular enzyme complex called the
cellulosome. Cellulosomes consist of non-enzymatic scaffolding protein（s）and cellulosomal enzyme subunits. The scaffolding protein contains
cohesins for the cellulosomal enzyme subunits which have various defferent functions and invariably contain a cohesin-binding site named
dockerin. The composition, function, and gene cluster of Clostridium cellulovorans cellulosome were reviewed here, and the research advances
in biotechnology were also summarized, aiming to provide some basic information for the studies of other cellulosomes, the constructions of mini-
cellulosomes with precise functions and the applications in biotechnology.
Key words:  Cellulosome Clostridium cellulovorans Scaffoldin Cellulosomal enzyme Gene cluster Expression regulation
白（scaffoldin）和多个具有催化活性的糖基水解酶
亚单位。脚手架蛋白上含有多个黏附域（cohesin
modules），每个酶亚单位上也都含有坞因子（dockerin
domain），酶亚单位通过各自的坞因子和脚手架蛋白
上相应的黏附域特异性相结合，充分发挥各酶之间
的协同作用，高效降解植物细胞壁。因此，纤维体
是一个完美组合的实体，而非各个组分的简单聚集，
其降解细胞壁的效率远远高于几个游离酶的协同。
纤维体高效降解细胞壁的特性引起了广大研究者的
兴趣。
目前仅在一些厌氧细菌中得到了纤维体，尤其
是 梭 菌 和 瘤 胃 微 生 物， 如 Bacteroides cellulosolvens
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期38
（ 溶 纤 维 拟 杆 菌 ）［3］，Clostridium cellulovorans（ 嗜
纤 维 梭 菌 ）［4］，C. thermocellum（ 热 梭 菌 ）［5］，C.
cellulolyticum（解纤维梭菌）［6］，C. josui（约氏梭菌）［7］，
C. papyrosolvens（溶纸莎草梭菌）［8］，Ruminococcus
flavefaciens（生黄瘤胃球菌）［9］，R. albus（白色瘤
胃球菌）［10］。最近，有报道称在厌氧真菌 Piromyces
equi 中也发现了纤维体，但是并未发现编码脚手
架蛋白基因的存在。在产生纤维体的细菌中，C.
cellulovorans 分离自木浆粗纤维纸，是一种产孢、嗜
中温的革兰氏阳性菌，它产生大量的纤维素酶，能
降解晶型纤维素［11］。本研究就针对 C.cellulovorans
纤维体的结构、功能、基因簇和基因工程方面的研
究进展进行综述，以期为其他纤维体的研究提供思
路及构建特殊功能的 mini-cellulosome、纤维体在生
物技术上的应用奠定理论基础。
1 Clostridium cellulovorans 纤维体的组成
嗜纤维梭菌纤维体依附在细胞表面，分子量大
约为 1×106 Da，有至少 10 个亚单位组成。其中一
个重要的亚单位是脚手架蛋白 CbpA，并且只含有 1
个 CbpA［12］，分子量为 189 kD。脚手架蛋白不具有
催化活性，但是含有多个功能域，模型见图 1。
Cellulosomal Enzyme ：纤维体酶 ；Cellulose Binding Domain ：纤维素结合域 ；Hydrophobic Domain ：疏水区 ；
Surface Layer Homology Domain ：表层同源结构域 SLH
图 1 Clostridium cellulovorans 纤维体的图解模型［13］
CD
CBD HBD
Cell Surface
CbpA
HbpA CBD
CD
EngE
CD
EngY
CDCDCDCDCDCDCDCDCD
Plant Cell Wall Molecules
DS
=Cellulosomal
Enzymes
=Cellulose Binding
Domain
=Hydrophobic
Domain
=Surface Layer
Homology Domain
1.1 脚手架蛋白的结构和功能
嗜纤维梭菌纤维体的 SDS-PAGE 电泳分析结果
显示，纤维体存在多个亚单位，包括 3 个主要的条
带 170 kD（P170），100 kD（P100）和 70 kD（P70），
其他的小条带分子量范围在 35 kD-120 kD 之间［11］。
羧甲基纤维素酶活性分析显示，只有 P170 蛋白没有
催化活性。P170 蛋白具有多重功能，除了结合多酶
亚单位外，还可以将纤维素的结晶型排列方式转变
成易于被酶亚单位降解的非晶型排列，使得整个纤
维体能有效降解结晶型纤维素，而纤维体上单个游
离酶只能降解可溶性和非结晶纤维素［11］。
通过反相 PCR 得到了编码 P170 蛋白的全部基
因序列，此基因被命名为 cbpA，编码的蛋白称为脚
手架蛋白 CbpA，其分子量为 189 kD［14］。cbpA 基因
的 N 端编码信号肽，成熟蛋白的 N 端存在 1 个纤维
素结合域 CBD，4 个表层同源结构域 SLH［15］，9 个
黏附域或称酶结合域（也称疏水区）［14］。CBD 能结
合不同形式的纤维素，但是相对于非晶型纤维素来
说，此 CBD 更偏向于结合结晶型纤维素。CBD 能
结合和晶型纤维素结构相似的几丁质。CBD 对纤
维体和降解基质之间的结合发挥着重要作用。针对
C.cellulovorans 而言，纤维体上的 4 个表层同源结构
2013年第3期 39李俊霞等 ：嗜纤维梭菌纤维体研究进展
域也称亲水区。另外，在研究 EngE 的结构域时发
现 3 个重复的类 -SLH 域串联位于内切葡聚糖酶基因
engE 的 N 端，内切葡聚糖酶通过此结构域既和脚手
架蛋白 CbpA 相连又结合在细菌表面。9 个黏附域高
度保守、同源，各个酶亚单位通过坞因子 - 黏附域
特异结合在脚手架蛋白上。Park 等［16］研究黏附域
1、6 与两个酶亚单位 P100、P70 之间的亲和性，结
果显示黏附域 6 比黏附域 1 更高效的结合这两种酶
亚单位，说明黏附域结合酶亚单位的能力不同。但
是关于 C. thermocellum 和 C. cellulolyticum 纤维体的
相关研究结果表明，不同黏附域和酶亚单位上坞因
子的结合能力相同。另外一项相关研究是体外克隆 C.
cellulovorans 的黏附域，结果发现克隆出的黏附域同
样可以与纤维体的酶亚单位相结合，说明了酶亚单
位上的坞因子是黏附域和酶亚单位结合的关键性因
素。根据这几项研究结果推测，黏附域和酶亚单位
的结合能力可能取决于酶亚单位上坞因子的某些特
性。如坞因子的大小和空间结构等，不同的产纤维
体菌种，其坞因子的这类特性不同。关于黏附域的
功能，Park 和 Doi 还发现了黏附域不仅结合酶亚单
位，而且不同的黏附域之间也能互相结合，这就使
得不同 CbpA 之间通过黏附域聚集从而形成多聚纤
维体。
纤维体上除 CbpA 非酶蛋白外，还存在另外一
个非酶蛋白 HbpA。其分子量为 24.94 kD，含有一个
SLH 和一个黏附域，其黏附域和 CbpA 的黏附域相似。
研究结果表明，HbpA 既可以通过其上的 SLH 连接
到 C. cellulovorans 的细胞壁上，又可结合纤维体酶
和多糖底物，如纤维素、几丁质和木聚糖［17］。
1.2 纤维体纤维素酶和非纤维体纤维素酶
C. cellulovorans 能合成纤维体纤维素酶和非纤维
体纤维素酶两种，非纤维体酶基因上不存在坞因子
序列，而纤维体酶一般含有坞因子序列（22 个氨基
酸的重复序列）。C. cellulovorans 的纤维体酶基因大
部分位于纤维体基因簇上，编码的纤维体酶包括 1
个外切葡聚糖酶（ExgS）、5 个内切葡聚糖酶（EngH、
EngK、EngL、EngM 和 EngN） 和 1 个 甘 露 聚 糖 酶
（ManA）。除了上述 7 种酶组分，纤维体酶还包括 2
个内切葡聚糖酶 EngB、EngE［18］（同时也具有木聚
糖酶活性）、1 个果胶酸酯酶（EngY-PelA）［19］和 1
个木聚糖酶（XynA）［20］，只是编码这几种酶的基因
位于染色体的其他位置而非纤维体基因簇上，并且
这几个酶基因互不相连。最近，Han［21］又分离和表
达了一种新的木聚糖酶基因 xynB。另外，Jeon 等［22］
检测到一种新的内切葡聚糖酶 EngZ，但此内切酶具
有很强的降解结晶纤维素活性。所有酶亚单位上的
坞因子高度保守。除了坞因子，每个酶亚单位还包
含催化域和信号肽，但是 CBD 和类 Ig 域并非每个
酶亚单位都有。C. cellulovorans 纤维体酶亚单位的种
类繁多使得合成的纤维体能有效降解植物细胞壁的
所有组分纤维素、木聚糖、甘露寡糖和果胶。
C. cellulovorans 不仅能合成纤维体纤维素酶，还
能产生游离纤维素酶——EngD（内切葡聚糖酶、木
聚糖酶）和 EngF（内切葡聚糖酶、纤维糊精酶）。
engD 和 engB 基因有较高的同源性［23］。
2 纤维体基因簇
C. cellulovorans纤维体基因簇含有 9 个相连基因，
顺 序 为 cbpA-exgS-engH-engK-hbpA-engL-manA-engM-
engN，总基因长 22 kb（图 2）。此纤维体基因簇的 5
端固定有非纤维体操纵子，由 nifV-orf1-sigX-regA 基
因组成，3 端跟随的是与转座酶基因（trp）、苹果酸
酯酶基因（mle）有同源性的非纤维体基因［24］。最
近研究者还发现了 engL 基因簇并对其进行了测序，
结果显示，engL 基因簇包括 5 个不同的开放阅读框，
包含编码 ManA 的基因序列［25］。除了 C. cellulovorans
纤维体，在 C. cellulolyticum 和 C. josui 纤维体中还发
现了纤维体基因簇，但并未在 C.thermocellum 中发现
纤维体基因簇，因此研究者推测，染色体上的纤维
体基因簇是嗜温梭状芽孢杆菌的典型特点。
cbpA exgS engH engK engL engM engNmanA trp mle
1 kb
hbpA
图 2 Clostridium cellulovorans 纤维体基因
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期40
3 纤维体基因的表达调控
研究者通过将 C.cellulovorans 培养在不同的基
质中研究纤维体上的纤维素酶基因和半纤维素酶基
因表达的调控因素［26，27］。当培养基中含有纤维二
糖和纤维素中，纤维素基因（engE）和半纤维素基
因（xynA）共表达 ；基质中纤维素、木聚糖和果胶
的存在，使得纤维体中大部分的基因得到表达 ；而
将纤维二糖和果糖作为碳源的时候，cbpA、engH、
manA、engE 和 xynA 的表达减弱 ；将碳源换为葡萄
糖、半乳糖、麦芽糖和蔗糖等可溶单糖或二糖的时
候，cbpA、engH、manA、engE 和 xynA 基本不表达。
xynA 基因和 pelA 基因只有基质中分别含木聚糖和果
胶的时候才会特异性表达。根据这些结果研究者推
测出纤维素酶基因和半纤维素酶基因之间存在协同
表达，在纤维素酶基因表达过程中可能存在一种降
解物阻遏调控机制。
Cho 等［28］的研究结果显示，当碳源为微晶纤维
素和 AXP（微晶纤维素 - 木聚糖 - 果胶，3∶1∶1）时，
EngE、ExgS、EngK、XynB 和 ManA 都表达，但是，
EngY 只在 AXP 培养基中才能检测到。Han 等［29］还
观察了 C.cellulovorans 培养在不同基质中纤维体与非
纤维体酶的 mRNA 和蛋白表达的变化，以此理解纤
维体和非纤维体水解酶之间的协同作用。结果发现，
在多种碳源底物（纤维素、果胶、木聚糖、纤维二
糖和玉米纤维）中纤维体和非纤维体酶都有协同活
性。与非纤维体酶相比，碳源对纤维体的蛋白质组
学影响更大。纤维素、果胶和木聚糖的混合物可以
诱导多种酶表达。
4 Clostridium cellulovorans 纤维体基因工程
研究进展
在过去几年中研究者已对纤维体中纤维素酶各
亚单位基因 engB、engE、engH、engK、engL、engM、
engY、exgS、木聚糖酶基因 xynA 、甘露聚糖酶基
因 manA 及果胶酶基因 pelA 进行了克隆和测序，并
已经研究不同组分之间对降解植物细胞壁的协同
效应，包括纤维素酶亚单位之间的协同［30］、纤维素
酶亚单位和半纤维素酶亚单位之间的协同［31，32］及纤
维体纤维素酶与非纤维体纤维素酶之间的协同［33］。
在这些协同效应的研究中，构建 mini-cellulosome 是
一种有效的方法。如，Jeson 等［34］设计 mini-cellulo-
so-me 研 究 EngE 和 ManB 对 半 乳 甘 露 聚 糖 降 解 的
协同作用。这些研究也为体外构建重组高活性的或
有 特 定 功 能 的 mini-cellulosome 做 足 了 准 备。mini-
cellulosome 是目前的研究热点，是由 mini-CbpA 和
一种或几种不同的酶组合成的小复合物。mini-CbpA
上的黏附域可以是种特异性的，也可以是来自不同
种的黏附域，种特异性的黏附域只能结合来自同种
的酶，而后者的黏附域可以结合那些种的同源酶。
mini-cellulosome 和 mini-CbpA 示意图分别见图 3，图
4。当脚手架蛋白 CbpA 基因在 E. coli 中表达时，得
到的是不同大小的蛋白片段（9 个），因为 CbpA 上
的 9 个黏附域两两之间被切割开，所以得不到完整
的 CbpA 蛋白。因此，Murashima 等［35］分别将 engB
基因克隆转入 Bacillus subtilis WB800 菌株，将 mini-
cbpA 基因转化至 E. coli 中表达。最后，将纯化的含
有坞因子的活性木聚糖酶和 mini-CbpA 两部分体外
聚集构成 mini-cellulosome。在随后的研究中，Cho
等［36］又将这两部分的基因串联融合，使得两种基
因 在 Bacillus subtilis WB800 共 表 达 以 进 行 体 内 聚
集构建 mini-cellulosome。 这种体内体外构建 mini-
cellulosome 的方法为得到高活性的多功能纤维素酶
提供思路。Lilly 等［37］实现了 mini-cellulosome 在酿
酒酵母系统中的成功表达，增加了成功构建具有纤
维素水解活性的啤酒酵母菌株的可行性。Hyeon 等［38］
构建了酿酒酵母工程菌，异源表达 C.cellulovorans 的
mini-CbpA 和 C.thermocellum 的内切葡聚糖酶 CelE 基
因，在体内聚集成 mini-cellulosome，同时在表达的
葡萄糖苷酶的协助下发酵纤维质生产乙醇，实现了
一步加工纤维质的目的，这种途径将大大降低生产
成本。为了相同的目的，Jeon 等［39］构建酿酒酵母
工程菌，只是简单的表达 C.cellulovorans 的 EngD 和
Saccharomycopsis fibuligera 的 β-葡萄糖苷酶基因，没
有构建 mini-cellulosome。
研究者还对改善纤维体酶的生物学特性进行
了相关研究。如 Murashima［40］ 用“分子育种”技
术将 engB 基因和 engD 基因体外重组，得到了热稳
定性比两种母本酶都提高并且活性不变的酶分子。
Lee［41］将 engD 基因和 Clostridium thermocellum 的纤
维体纤维素酶基因 celE 体外重组，大大提高了内切
2013年第3期 41李俊霞等 ：嗜纤维梭菌纤维体研究进展
葡聚糖酶 EngD 的热稳定性和水解活性。另外，为
搞清纤维体水解多糖的分子机制，研究者最近对几
种梭菌进行了全基因组分析。Tamaru 等［42］完成了
C.cellulovorans 743B（ATCC35296）的全基因组测序
工作。基因组分析结果显示，C.cellulovorans 基因组
包括 57 个纤维体基因和大量的编码非纤维体酶基
因［43］。纤维体基因不仅编码纤维素酶、脂肪酶和肽
酶，还发现了两种新的脚手架蛋白 CbpB 和 CbpC。
另 外，C.cellulovorans 基 因 组 分 析 结 果 显 示， 纤 维
体中还含有 3 个蛋白酶 / 肽酶抑制剂——cyspin 1、
cyspin 2 和 cyspin 3。Meguro 等［44］的研究结果首次
展示了 3 个蛋白酶 / 肽酶抑制剂的功能，即保护纤
维体和产纤维体的微生物免遭植物蛋白酶的降解，
保证纤维体对植物的降解顺利进行。
5 小结
研究者对嗜纤维梭菌纤维体系统进行近 20 年的
研究成果为其他纤维体的研究提供了基本信息。归
因于纤维体中糖基水解酶的多样性、水解酶之间的
协同作用和纤维体与底物的紧密黏合，纤维体能高
效降解植物细胞壁中的纤维素、半纤维素和几丁质
等组分。对纤维体的基础研究会促进生物反应器和
生物传感器的发展。纤维体的应用可提高饲料的消
化利用率，还可将纤维素类物质转变为可发酵糖，
以此产生可再生燃料如乙醇，为人们寻找再生性能
源提供途径。提高纤维体的产量和纤维体的水解效
率等都将会扩展纤维体的应用范围，但是如何提高
目前还没有取得进展，有待于深入研究。
参 考 文 献
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EngH
CBM
CBD
Mini CbpA
Host cell surface
1 2 3
Cell wall polymer
ExgS EngK
lg-like
domain
CBD
Dockerin
domain
Cohesin
domain
Hydrophilic
domain
Catalytic
domain
图 3 设计的 mini-cellulosome 模型图［1］
Cellulose Binding
DomainCBD CohesinDomain
TACCATGGCAGCG
M
2S 578
Xho INco I
A A I G D P I L E
ATTGGAGATCCTATACTCGAG
HHHHHH
His Tag from pET22b
CbpA
57.2 kD
mini-CbpA
57828
Signal
Sequence
Surface layer
HomologousSLH
Signal Sequence ：信号肽序列 ；Cellulose Binding Domain（CBD）：纤维
素结合域 ； Surface Layer Homologous（SLH）：表层同源结构域
图 4 mini-CbpA 示意图［35］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期42
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（责任编辑 狄艳红）