全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
收稿日期 ：2012-08-06
基金项目 ： 国家高技术研究发展计划（“863”计划）项目（2012AA101807），国家自然科学基金青年基金项目（21106102），天津市应用基
础及前言技术研究计划青年基金项目（12JCQNJC03600）
作者简介 ：李晨，男，硕士研究生，研究方向 ：木质纤维素生物炼制 ；E-mail ： heima00111@163.com
通讯作者 ：马立娟，女，博士，助理研究员，研究方向 ：生物质能源 ；E-mail ： ma_lj@tib.cas.cn
四种测定纤维素酶发酵过程生物量方法的比较
李晨1，2  赫荣琳2  武改红2  马立娟2  路福平1  陈树林2
（1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457 ；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所 天津市工业生物系统与
过程工程重点实验室，天津 300308）
摘 要 ： 分别采用测定菌丝体蛋白的方法、测定核酸的方法、酸洗干燥法和纤维素测定仪的方法测定以不溶性纤维素为底
物发酵产纤维素酶过程中的生物量。通过对发酵液取样测定比较，结果发现，采用测定核酸的方法精密度最高，其 RSD 值为 6.32%，
该法同纤维素测定仪的方法均可用于精确测定以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中的生物量。酸洗干燥法的测定结果精
密度较差一些，但由于操作简便，也可用于常规分析。而测定菌丝体蛋白的方法无论是在精密度上还是操作简便性上均不占优势，
该方法可作为另外 3 种方法的补充。为以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中生物量的分析检测提供了选择方法的依据。
关键词 ： 纤维素 纤维素酶 生物量 菌丝体蛋白 核酸 酸洗 纤维素测定仪
Comparison of Four Methods for Measuring the Biomass of the
Cellulase Production Process
Li Chen1， 2 He Ronglin2 Wu Gaihong2 Ma Lijuan2 Lu Fuping1 Chen Shulin2
（1College of Bioengineering， Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457 ；2Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological
Systems and Bioprocessing Engineering， Tianjin Institute of Industrial Biotechnology， Chinese Academy of Sciences， Tianjin 300308）
Abstract:  Biomass of the cellulase production process with insoluble cellulose as the substrate was measured using mycelial protein
determination, nucleic acid determination, acid washing and drying method as well as cellulose analyzer application, respectively. Measurement
results of fermentation broth samples indicated that the precision of nucleic acid determination method was the highest with RSD value at 6.32%.
This method and cellulose analyzer application method could be used to determine the biomass of the cellulase production process with insoluble
cellulose as the substrate more accurately. The precision of acid washing and drying method was poorer, but it could be used for routine analysis
of biomass due to its simple operation. The mycelial protein determination method was proved to be poorer neither in precision nor in operation
simplicity, and it could be used as the complement of the other three methods. This study provides a basis for selecting method in measuring the
biomass of the cellulase production process with insoluble cellulose as the substrate.
Key words:  Cellulose Cellulase Biomass Mycelial protein Nucleic acid Acid washing Cellulose analyzer
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的
总称，是起协同作用的多组分酶系。根据纤维素酶
系中各种酶组分的功能不同，纤维素酶可分为三大
类 ：内切葡聚糖苷酶（endo-β-1，4-glucanase，EG，
EC 3.2.1.4）、外切葡聚糖苷酶（exo-β-1，4-glucanase，
CBH，EC3.2.1.94）和 β- 葡萄糖苷酶（β-1，4-gluco-
sidase，CB，EC 3.2.1.21）。除此之外，近年来新的纤
维素酶组分也不断被发现。利用纤维素酶降解纤维
素的优点在于特异性高，反应条件温和，环境污染
小。随着人们对纤维素酶分子结构及作用机理等各
方面的研究工作的深入，纤维素酶已在食品、饲料、
环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来
越大的作用。
现有的纤维素酶生产方法主要采用微生物液体
2013年第1期 199李晨等 ：四种测定纤维素酶发酵过程生物量方法的比较
发酵法，生产菌株以里氏木霉（Trichoderma reesei）
及其近缘菌株应用最为广泛［1 － 3］。此外，真菌纤维
素酶多数是诱导酶，其合成及表达须在诱导物存在
下才能进行，而廉价的纤维素类物质作为纤维素酶
液体发酵的原料其本身就是良好的诱导剂。但是，
由于纤维素类物质是不溶于水的，为检测纤维素酶
发酵过程中的生物量带来了很大难度而发酵过程中
生物量不但是生产中发酵工艺优化及过程控制必需
监测的指标，同时也是过程传质、物质转化及酶合
成等理论研究方面的一个重要的参数［4 － 6］。测定菌
丝体蛋白的方法［7， 8］、测定核酸的方法［9］和酸洗干
燥法［10， 11］均被文献报道过用来测定以不溶性纤维
素为底物发酵产纤维素酶过程中的生物量，但是这
几种方法均存在各自的优缺点。如前两种方法均需
以可溶性碳源为底物进行纯培养以做出标准曲线，
处理过程、测定步骤繁琐，导致测定结果存在一定
的误差。后一种方法虽然简单，但是由于酸处理后
需反复洗涤沉淀以及干燥称重本身也存在较大误差。
纤维素测定仪的方法由于受仪器本身的限制未见文
献报道应用于测定纤维素酶发酵过程中的生物量。
因此，本研究在大量测定以不溶性纤维素为底
物发酵产纤维素酶过程中生物量的基础上，分别采
用测定菌丝体蛋白、测定核酸、酸洗干燥和纤维素
测定仪 4 种方法对生物量进行分析检测，同时在精
密度、误差分析以及影响因素等方面对几种方法进
行比较，通过对测定结果进行统计检验，综合分析
各方法的优缺点，以期为精确、快速地测定以不溶
性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中的生物量提
供选择方法的参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 冰醋酸、浓硝酸、氢氧化钠、三氯乙
酸、十水硼酸钠、乙二胺四乙酸二钠、十二烷基硫
酸钠和无水磷酸氢二钠均为实验室常规试剂，分析
纯 ；乙二醇乙醚为有机溶剂 ；牛血清白蛋白（BSA）
为生化试剂，购于 Sigma ；试验用水为二次重蒸水。
中性洗液配制如下 ：将 6.81 g 十水硼酸钠和
18.61 g 乙二胺四乙酸二钠放入烧杯中加热并用蒸馏
水溶解，加入 30 g 十二烷基硫酸钠和 10 mL 乙二醇
乙醚 ；同时，用蒸馏水单独溶解 4.56 g 磷酸氢二钠
直至其完全溶解 ；将两种溶液混合，并用蒸馏水定
容至 1 000 mL，控制 pH 值在 6.9 和 7.1 之间。
1.1.2 仪 器 与 设 备 连 续 波 长 酶 标 仪
（SPECTRAMAX 340PC384， 美 国 Molecular Devices
公司），纤维素测定仪（FIWE6，意大利 VELP 公司），
离心机（SIGMA 3-18K 型，德国 Sigma 公司），恒温
水浴锅（XMTD-6000，北京市长风仪器仪表公司），
台式冷冻干燥机（FD-1A-50，北京博医康实验仪器
有限公司），电热鼓风干燥箱（DHG-9140A 型，上
海一恒科学仪器有限公司）。
1.1.3 样品 试验中分析所用样品为采用本实验室
保藏的里氏木霉（Trichoderma reesei）Rut C-30 突变
株 30s-3-13 于 5 L 发酵罐发酵 36 h 取样所得。
1.2 方法
1.2.1 测定菌丝体蛋白的方法 精密称取提前以可
溶性碳源为底物培养好的 0.3 g 纯的干菌丝体，悬浮
于装有 15 mL、0.2 mol/L NaOH 的 50 mL 离心管中，
将该悬浮液置于沸水浴中 20 min 后，取出离心管静
置 12 h，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，采用
Bradford 法测定上清液中的蛋白浓度。
取 10 mL 发酵液样品于 50 mL 离心管中，4 000
r/min 离心 10 min 后，弃去上清液，沉淀用蒸馏水洗
涤 3 次，按照上述步骤提取菌丝体蛋白，即将洗涤
后的沉淀物悬浮于 15 mL、0.2 mol/L NaOH 中，置于
沸水浴 20 min 后，取出静置 12 h，测定样品上清液
中的蛋白浓度。按照下式计算生物量 ：
生物量（g/L）=（15×C2/（15×C1/0.3））/0.01 （1）
式中 ：C1- 样品中蛋白浓度（g/L），C2- 纯菌体
上清中蛋白浓度（g/L）。
1.2.2 测定核酸的方法 精密称取提前以可溶性碳
源为底物培养好的纯的干菌丝 0.1、0.2、0.4、0.6、
0.8 g，分别置于装有 25 mL 5% 的三氯乙酸溶液的
50 mL 离心管中，于 80℃水浴提取 25 min，同时用
玻璃棒不间断进行搅拌，取出后水浴冷却，于 4℃
8 000 r/min 离心 15 min，将上清液进行适当稀释，以
5% 三氯乙酸作为零点对照，分别于 260 nm 处测定
吸光度，以菌体质量为横坐标，260 nm 处吸光值为
纵坐标，做标准曲线（图 1）。菌体质量在 0-0.8 g
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期200
范围内线性关系良好，其回归方程为 y=1.2412x，
R2=0.9988。其中，x 为菌体质量（g），y 为 OD260。
1.2.4 纤维素测定仪的方法 取 10 mL 发酵液样品
于 50 mL 离心管中，4 000 r/min 离心 10 min 后，弃
去上清液，沉淀物于 -60℃真空干燥至恒重后称重，
将干燥后的沉淀放入恒重好的坩埚内，加入 100 mL
中性洗液，0.5 g 亚硫酸钠和几滴辛醇，加热至沸腾，
并从沸腾开始计时，回流 60 min。用沸水过滤并清
洗 3 次，然后用冷丙酮清洗 2 次。于 105℃干燥 8 h，
放于干燥器中冷却，称重。按照下式计算生物量 ：
生物量（g/L）=（M1-M2）/0.01 （4）
式中 ：M1 为发酵液离心后底物干重（g），M2 为
残渣重（g）。
2 结果
2.1 测定结果与精密度分析
采用 4 种方法测定以不溶性纤维素为底物发酵
36 h 后生物量的结果见表 1。由表 1 可见，采用测
定核酸的方法所测得的结果最大，生物量为 16.97
g/L ；酸洗干燥法和纤维素测定仪法的测定结果较为
接近，生物量分别为 15.74 g/L 和 15.6 g/L ；测定菌
丝体蛋白的方法所测得的结果最低，为 14.28 g/L。
由此可见，由于各种方法的测定过程及其影响因素
不同，采用几种方法所测得的生物量的值存在一定
的差异。
同时，由表 1 可见，采用 4 种方法多次测定结
果的相对标准偏差（RSD）值均在 10% 以内，认为
各测定结果准确有效。其中，采用测定核酸的方法
结果 RSD 值最小，为 6.32%，酸洗干燥法最大，为
8.23%。由于 RSD 值通常用来表示分析测试结果的
精密度，因此，几种方法相比，采用测定核酸的方
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
A
26
0
㧼փ䟿g
图 1 菌体质量标准曲线
取 10 mL 发酵液样品于 50 mL 离心管中，4 000
r/min 离心 10 min 后，弃去上清液，沉淀于 -60℃冷
冻真空干燥至恒重后，采用与上述相同的处理方法，
260 nm 处测定吸光值。按照下式计算生物量 ：
生物量（g/L）=（A260/1.2412）/0.01 （2）
1.2.3 酸洗干燥法 取 10 mL 发酵液样品于 50 mL
离心管中，4 000 r/min 离心 10 min 后，弃去上清液，
沉淀物于 -60℃真空干燥至恒重后称重。将干燥后
的沉淀悬浮于 3 mL 醋酸 - 硝酸溶剂中（150 mL 80%
醋酸与 15 mL 纯硝酸混合），置于沸水浴中 30 min，
冷却后，4 000 r/min 离心 10 min，弃去上清液，沉
淀物用 10 mL 蒸馏水洗涤 2 － 3 次，于 40℃减压干
燥至恒重。6 个平行样测定。按照下式计算生物量 ：
生物量（g/L）=（M1-M2）/0.01 （3）
式中 ：M1 为发酵液离心后底物总干重（g），M2
为经过酸处理后剩余底物的干重（g）。
表 1 不同方法测定以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中生物量的结果
测定次数（n）
测定方法及结果（g/L）
菌丝体蛋白法 核酸法 酸洗干燥法 纤维素测定仪法
1 13.18 17.32 15.17 17.01
2 13.87 17.46 16.21 15.78
3 12.89 15.05 16.70 13.97
4 15.34 18.02 15.92 15.35
5 14.83 17.52 16.58 16.69
6 15.62 16.44 13.85 14.77
平均值（x
-
） 14.28 16.97 15.74 15.60
多次测定标准偏差（s） 1.044 6 1.072 9 1.294 8 1.070 3
RSD（%） 7.32 6.32 8.23 7.28
2013年第1期 201李晨等 ：四种测定纤维素酶发酵过程生物量方法的比较
法来测定生物量的结果精密度最高，纤维素测定仪
的方法和菌丝体蛋白法次之，酸洗干燥法最差。
2.2 测定方法差异性检验
以精密度最高的核酸测定法所得的结果为标
准，对其余 3 种方法与核酸测定法在测定结果的
平均值的差异程度上进行配对 t 检验，计算公式如
下［12， 13， 14］：
d
-
=∑d/n （5）
Sd = ∑d 2∑d2/n/n1 （6）
t = d/Sd / n  （7）
df=n-1 （8）
利用公式（5）-（7），计算得到 t 值结果见表
2。同时，测定次数为 6 次，即 n = 6，代入公式（8）
计算得 df = 5，因此，查 t 介值表 t0.05（5）=2.571。
由表 2 中数据可知，3 种方法的 t 值均小于 2.571，
即小于 t0.05（5），说明 P>0.05，因此，t 检验结果表明，
这 4 种方法的测定结果平均值之间的差异不显著，
均可作为以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过
程中生物量的测定方法。但是，由于核酸法具有较
高的精密度，可作为较精确监测以不溶性纤维素为
底物发酵产纤维素酶过程中生物量变化趋势的方法，
但是，由于该方法需要以可溶性碳源为底物进行菌
丝体纯培养，从而进行换算以确定发酵过程中生物
量的绝对值，导致操作步骤繁琐，测定过程耗时较长，
而酸洗干燥法和纤维素测定仪法则可代替核酸法和
菌丝体蛋白法来直接测定不溶性底物纤维素的含量，
同时也得到发酵过程中的生物量。
表 2 不同方法测定结果的 t 检验
测定次数 核酸法 菌丝体蛋白法 酸洗干燥法 纤维素测定仪法
（n） （g/L） （g/L） d d2 （g/L） d d2 （g/L） d d2
1 17.32 13.18 4.14 17.139 6 15.17 2.24 5.017 6 17.01 0.40 0.160 0
2 17.46 13.87 3.59 12.888 1 16.21 1.34 1.795 6 15.78 1.77 3.132 9
3 15.05 12.89 2.16 4.665 6 16.70 -1.58 2.496 4 13.97 1.15 1.322 5
4 18.02 15.34 2.68 7.182 4 15.92 2.18 4.752 4 15.35 2.75 7.562 5
5 17.52 14.83 3.69 7.236 1 16.58 1.03 1.060 9 16.69 0.92 0.846 4
6 16.44 15.62 0.82 0.672 4 13.85 2.66 7.075 6 14.77 1.74 3.027 6
Σd 16.08 7.38 8.24
Σd2 49.784 2 20.909 2 14.691 6
t 2.1059 1.4824 1.984
3 讨论
测定菌丝体蛋白、酸洗干燥以及测定核酸的方
法通常被文献报道用来检测以廉价的不可溶性纤维
素底物为原料发酵产纤维素酶过程中的生物量。但
是，几种测定方法均存在优缺点。本研究综合比较
了上述 3 种方法以及尚未见文献报道过的纤维素测
定仪的方法，从测定结果可见，采用不同方法所测
得的生物量的值存在一定的差异，这可由这 4 种测
定方法的检测步骤来解释。首先，核酸测定法需要
先将细胞破壁，提取核酸，通过显色反应，测定吸
光度，然后结合可溶性碳源培养的菌体采用相同方
法处理得到的标准曲线，计算得到样品的生物量。
该方法产生的误差主要在细胞破壁提取核酸环节，
如提取温度、时间以及搅拌方式等均是影响细胞破
壁程度的因素，进而影响生物量测定结果的准确性。
同时，该方法需要提前以可溶性碳源为底物进行菌
丝体纯培养，以制定标准曲线，因此，该方法操作
过程耗时较长。测定菌丝体蛋白的方法与核酸测定
法的原理类似，其过程是直接采用氢氧化钠对发酵
液沉淀进行处理，溶解出菌体中的蛋白质，测定溶
解出的蛋白量，结合采用可溶性碳源为底物培养得
到的纯的菌丝体，通过一定的系数进行计算得到的
生物量。采用可溶性碳源为底物培养所得的纯菌丝
体，其细胞内的蛋白含量较以不可溶性纤维素为底
物发酵所得菌丝体中的蛋白含量要低一些，因此，
采用纯的菌丝体作为参考，导致所测得的生物量偏
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期202
低。与核酸测定法所得的结果相差 2.69 g/L。
酸洗干燥法和纤维素测定仪法的测定原理类似，
均是采用试剂对发酵液沉淀进行处理，以除去沉淀
中的菌体，测定不溶底物纤维素的含量，然后利用
总干重与底物纤维素含量的差值进行计算得到相应
的生物量。因此，采用这两种方法测得的结果相差
不大，仅为 0.14 g/L。在这两种测定方法中，经过试
剂处理后，需要经过反复的洗涤离心，部分沉淀在
去上清的过程中会损失掉，造成测定结果存在一定
的误差。此外，由于沉淀以及坩埚均需干燥至恒重，
以及中性洗液处理样品需沸腾回流 1 h 等，使得纤
维素测定仪的方法操作时间也较长。
检测以不溶性纤维素为底物进行发酵产纤维素
酶过程中的生物量，需要一个精密度高、误差相对
较小以及操作相对较为简便的方法，由此可见，采
用精密度较高的测定核酸的方法可较精确地测定以
不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中的生物
量，采用精密度稍差但操作较为简单的酸洗干燥法
也可用于普通常规检测分析，而纤维素测定仪的方
法精密度高于酸洗干燥法但测定过程稍显繁杂，其
更多还是应用于测定木质纤维素类生物质的组分含
量分析上，但如果需要同时较精确的直接测定底物
纤维素和生物量，采用纤维素测定仪的方法是较好
的选择。由本文中对几种方法测定结果的比较可见，
文献报道中较多采用的菌丝体蛋白法无论是在精密
度上还是操作简便性上均无优势可言。
4 结论
本研究通过采用 4 种不同的方法测定以不溶性
纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中的生物量，测
定核酸的方法精密度最高，可较精确地测定以不溶
性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中的生物量，
酸洗干燥法精密度较差但其操作较为简便，可用于
常规监测，而纤维素测定仪的方法可同时较精确的
测定底物纤维素和生物量。菌丝体蛋白法无论是在
精密度上还是操作简便性上均不占优势。
参 考 文 献
［1］ Martinez D, Berka RM, et al. Genome sequencing and analysis of
the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei （syn. Hypocrea
jecorina）［J］. Nature Biotechnology, 2008, 26 ：553-560.
［2］ 覃玲灵 , 何钢 , 陈介南 . 里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研
究进展［J］. 生物技术通报 , 2011（5）：43-49.
［3］ Chandra M, Kalra A, Sangwan NS, et al. Development of a
mutant of Trichoderma citrinoviride for enhanced production of
cellulases［J］. Bioresource Technology, 2009, 100 ： 1659-1662.
［4］ Bader J, Klingspohn U, Bellgardt KH, Schugerl K. Modeling and
simulation of the growth and enzyme production of Trichoderma
reesei Rut C30［J］. Journal of Bitechnology, 1993, 29 ： 121-135.
［5］ Velkovska S, Marten MR, Ollis DF. Kinetic model for batch cellulase
production by Trichoderma reesei RUT C30［J］. Journal of
Biotechnology, 1997, 54 ： 83-94.
［6］ Muthuvelayudham R, Viruthagiri T. Fermentative production and
kinetics of cellulase protein on Trichoderma reesei using sugarcane
bagasse and rice straw［J］. African Journal of Biotechnology,
2006, 5（20）： 1873-1881.
［7］ Mohagheghi A, Grohmann K, Wyman CE. Production of cellulase
on mixtures of xylose and cellulose in a fed-batch process［J］.
Biotechnology and Bioengineering, 1990, 35 ： 211-216.
［8］ He J, Yu B, Zhang KY, Ding XM, Chen DW. Strain improvement of
Trichoderma reesei Rut C-30 for increased cellulase production［J］.
Indian Journal of Microbiology, 2009, 49 ：188-195.
［9］ Prasetyo J, Zhu J, et al. Efficient production of cellulase in the
culture of Acremonium cellulolyticus using untreated waste paper
sludge［J］. Biotechnology Progress, 2011, 27（1）： 104-110.
［10］ Ahamed A, Vermette P. Culture-based strategies to enhance
cellulase enzyme production from Trichoderma reesei RUT-C30
in bioreactor culture conditions［J］. Biochemical Engineering
Journal, 2008, 40 ： 399-407.
［11］ Ahamed A, Vermette P. Effect of culture medium composition on
Trichoderma reesei’s morphology and cellulase production［J］.
Bioresource Technology, 2009, 100 ： 5979-5987.
［12］ 陈宇鸿 , 沈仁富 . 虾米中氯化钠不同测定方法的对比研究［J］.
中国卫生检验杂志 , 2011, 21（12）：3010-3011.
［13］ 张琦 , 杨先泉 . 从污染物微核检测实验分析实验误差原因［J］.
生物学通报 , 2011, 46（10）：57-59.
［14］ 韩丙军 , 何秀芬 , 张月 , 等 . 叶面肥中磷含量测定方法的比较
研究［J］. 中国土壤与肥料 , 2011, 6 ：83-86.
（责任编辑 李楠）