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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
谷氨酸棒杆菌是重要的氨基酸生产菌株，已广
泛用于 L-谷氨酸、L-苏氨酸和 L-赖氨酸等氨基酸的
生产［1］。谷氨酸棒杆菌 SYPS-062 能够利用糖质原
料发酵大量积累 L-丝氨酸［2］，目前已达到 20 g/L，
但该菌同时也能够合成较多的副产物 L-缬氨酸。如
果能够对该菌进行改造，有望进一步提高原料的利
用率和 L-丝氨酸的发酵产量，使之成为具有工业应
用的生产菌株。
收稿日期 : 2012-04-18
基金项目 : 国家“973”课题（2007CB707804）, 国家“863”重点项目（2006AA020104）, 教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-07-0380）
作者简介 : 罗玉常 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生物制药 ; E-mail: lyc.356@163.com
通讯作者 : 史劲松 , 男 , 教授 , 研究方向 : 生物制药 ; E-mail: shijs@163.com
谷氨酸棒杆菌 ilvE 基因的敲除对相关
氨基酸合成的影响
罗玉常1  窦文芳1  张晓梅1  史劲松1  许正宏1，2
（1 江南大学医药学院，无锡 214122 ；2 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）
摘 要 ： L-缬氨酸是谷氨酸棒杆菌 SYPS-062 发酵生产 L-丝氨酸的主要副产物。为减少 L-缬氨酸的积累，利用基因重组技术
敲除 SYPS-062 转氨酶 B 编码基因 ilvE 内部的 987 bp 核苷酸序列，构建了 ilvE 基因缺失突变株 SYPS-062 △ ilvE。研究表明，重组
菌 ilvE 基因的缺失直接导致了分支氨基酸（Val、Ile、Leu）的合成能力的降低，影响了菌体的生长，其中 Ile 成为生长限制性因子，
在培养基中添加分支氨基酸能明显促进其生长。重组菌培养 96 h，发酵液中 L-缬氨酸含量低于 0.5 g/L，与出发菌株相比，其生成
率降低 90%。
关键词 ： 转氨酶 B ilvE 基因 L-缬氨酸 L-异亮氨酸 L-丝氨酸 谷氨酸棒杆菌
Effect of ilvE Gene Knockout on Amino Acids Synthesis of
Corynebacterium glutamicum
Luo Yuchang1 Dou Wenfang1 Zhang Xiaomei1 Shi Jinsong1 Xu Zhenghong1，2
（1School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122 ；2Key Lab of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，
Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract:  L-Valine was the main by-product during the production of L-Serine by Corynbacterium glutamicum SYPS-062. In order to
study the effect of ilvE deletion on the accumulation of L-Valine, ilvE gene deficient mutant strain Corynbacterium glutamicum SYPS-062△ilvE
was constructed by homologous recombination. The central fragment encoding 987 bp nucleotides of ilvE was deleted. The growth of the△ilvE
phenotype on the chemical defined medium was significantly retarded due to the reduced biosynthesis capability of branch-chain amino acids （Val,
Ile, Leu）. However, growth condition of the ilvE deleted mutant can be significantly improved when supplemented with 250 mg/L branched-
chain amino acids. L-Ile was the limiting factor for SYPS-062△ilvE growth. The results suggested that the productivity of L-Valine decreased
90% compared with the wild type strain, the concentration of L-Valine was decreased to 0.5 g/L in the 96 h culture.
Key words:  Transaminase B ilvE gene L-Valine L-Isoleucine L-Serine Corynebacterium glutamicum
利用代谢工程技术进行工业微生物改造是提高
发酵产率、减少副产物生成的一种最为有效的措施。
代谢工程的核心内容是利用重组 DNA 技术调控代谢
途径中的相关基因，对代谢网络进行功利性修饰，
最大限度地提高目标产物的产率，较大程度减少副
产物的产生［3］。代谢工程技术克服了传统诱变育种
的盲目性和周期长的不足，是一种理性育种和定向
改造策略。利用代谢工程进行理性的系统改造，已
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期186
使苏氨酸、赖氨酸的发酵水平得到显著提高［4，5］。
自谷氨酸棒杆菌全基因组测序工作完成以来［6］，其
氨基酸代谢网络及遗传操作体系已基本构建完成［7］，
为利用代谢工程技术改造谷氨酸棒杆菌创造了良好
条件。
前期研究中，通过对发酵液中氨基酸谱的分
析，L-缬氨酸作为副产物在谷氨酸棒杆菌 SYPS-062
发酵生产 L-丝氨酸过程中大量积累［2］。在综合分析
L-缬氨酸生物合成途径的基础上，以谷氨酸棒杆菌
SYPS-062 为供试菌株，采用基因重组技术拟将其转
氨酶 B 编码基因 ilvE 敲除，并研究 ilvE 基因缺失对
于菌株生长和 L-缬氨酸以及其他相关氨基酸代谢的
影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 谷氨酸棒杆菌 SYPS-062 和穿
梭质粒 pK19mobsacB［8］为江南大学制药工程研究
室 保 藏 ；pMD19-T simple Vector 购 自 大 连 宝 生 物
工 程 有 限 公 司 ；E. coli JM109 购 自 上 海 生 工 生 物
工 程 有 限 有 限 公 司 ；重 组 质 粒 pMD19-T△ilvE 和
pK19mobsacB△ilvE 均为作者构建。
1.1.2 试剂 分子生物学试验所需的 Taq DNA 聚合
酶、限制性内切酶 BamH I 和 Hind III、T4 DNA 连接酶、
硫酸卡那霉素、氨苄青霉素、细菌基因组提取试剂盒、
质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自上海捷瑞生
物工程有限公司。
Val、Ile、Leu 等生化试剂购自上海生工生物工
程有限公司。
1.1.3 引物 谷氨酸棒杆菌 SYPS-062△ilvE 构建所
需的引物如表 1 所示，由上海捷瑞生物工程有限公
司合成。
1.1.4 培养基 LB 培养基 ：蛋白胨 1.0%，酵母粉
表 1 扩增 ilvE 基因缺失片段所需的引物
编号 序列（5-3） 长度（bp）
ilvE-1 TATAGGATCCTATCCAGCTCCGCCAATG（BamH I） 28
ilvE-2 CCCATCCACTAAACTTAAACAAGCAAGGAAACGTTGAAG 39
ilvE-3 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCCTTCAGACGATCGGGTG 39
ilvE-4 ATTAAGCTTTGCTGCAAGTCCCAAATC（Hind III） 27
0.5%，NaCl 1.0% ；固体培养基另加琼脂 1.8%。
种子培养基 ：葡萄糖 2.5%，牛肉膏 1.0%，蛋
白胨 1.0%，酵母粉 0.5%，NaCl 0.3%，pH7.0 ；固体
培养基另加琼脂 1.8%。
全合成发酵培养基：蔗糖 10%，硫酸铵 3%，KH2PO4
0.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.002%，
MnSO4·H2O 0.002%，PCA 30 mg/L，Biotin 50 μg/L，
Thiamine·HCl 450 μg/L，CaCO3 6%。参考张晓娟等
［9］
并作一定改进。
1.2 方法
1.2.1 谷氨酸棒杆菌 ilvE 基因的敲除 参考阮红
等［10］试验方法。利用交叉 PCR 扩增中间含有缺失
987 bp 的 ilvE 片段。以谷氨酸棒杆菌 SYPS-062 基因
组为模板，分别以引物 ilvE-1 和 ilvE-2 PCR 扩增 ilvE
上游 691 bp 序列和 ilvE-3 和 ilvE-4 PCR 扩增 ilvE 下
游 706 bp 序列 ；再以上下游 PCR 产物片段为模板，
用引物 ilvE-1 和 ilvE-4 PCR 扩增中间含有缺失 987
bp 的 ilvE 片段。
将 ilvE 基因缺失片段连接至克隆载体，获得质
粒，转化至 E. coli JM109，重组菌送上海生工测序。
在重组 E. coli JM109 pMD19-T△ilvE 中提取质粒，利
用限制性内切酶 BamH I 和 Hind III 处理，将回收片
段与用相同处理的 pK19mobsacB 混合，T4 DNA 连接
酶过夜处理。连接产物转化至 E. coli JM109，转化
子为 E. coli JM109 pK19mobsacB△ilvE。
提取重组质粒 pK19mobsacB△ilvE，电击转化至
谷氨酸棒杆菌感受态细胞［11，12］，涂布至含 50 μg/mL
Kan 电击转化固体培养基。挑取单菌落用种子培养
基活化，涂布 10% 蔗糖的筛选固体平板，单菌落为
二次重组菌。挑取单菌落进行培养，用引物 ilvE-1
和 ilvE-4 对二次重组子进行 PCR 扩增，验证获取敲
除菌。
2012年第11期 187罗玉常等 ：谷氨酸棒杆菌 ilvE 基因的敲除对相关氨基酸合成的影响
1.2.2 营养条件对 ilvE 基因敲除菌株的影响 IlvE
的缺失影响到分支氨基酸的合成，进而影响到菌体
生长，故对营养成分进行外源性补充以保证重组菌
正常生长。根据氨基酸合成转氨反应的特点，尝试
添加不同的氨基供体进行代偿，营养物质添加策略
如下 ：
（1）以 α-酮-β-甲基戊酸合成 L-异亮氨酸仅由
IlvE 和 AvtA 催化，敲除 ilvE 基因之后仅剩 avtA 基因，
故首先考虑 L-异亮氨酸的代偿试验。设计向培养基
中 添 加 L-Ala、L-Gln 和 L-Ala+L-Gln 组 合， 作 为 氨
基供体由 AvtA 催化补偿 3 种分支氨基酸的缺失 ；
（2）AroT 能够接受 L-Ala、L-Glu 和 L-Asp 提供
氨基可以合成 L-缬氨酸和 L-亮氨酸，却不能合成 L-
异亮氨酸，故设计直接添加 L-Ile+L-Ala、L-Ile+L-Glu
和 L-Ile+L-Asp，以直接添加 L-Ile 作为对照 ；
（3） 向 培 养 基 中 直 接 添 加 3 种 分 支 氨 基 酸
Ile+Leu+Val。
在全合成发酵培养基中按照上述设计的方案添
加营养物质，发酵 96 h 观察不同营养物质对重组菌
SYPS-062△ilvE 生长和代谢的影响，所有添加物浓
度均为 250 mg/L。
1.2.3 菌浓测定 取适当体积的发酵液，以 0.25
mol/L 的稀盐酸溶液进行适当倍数稀释，紫外分光光
度计测定 OD562nm。
1.2.4 发酵液中氨基酸含量的测定 将发酵液用
ddH2O 稀释至合适浓度，以异硫氰酸苯酯（PITC）
作为衍生剂将氨基酸衍生化，产物苯氨基酸硫甲
酰 衍 生 物（PTC-AA） 在 254 nm 处 有 稳 定 的 强 紫
外吸收，高效液相色谱仪为 DIONEX Ultimate 3000
series HPLC system， 采 用 Venusil-AA 氨 基 酸 分 析
专 用 柱（4.6×250 mm，5 μm）， 在 紫 外 下 检 测 衍
生物。
流动相 A 相 ：92.6 mmol/L 乙酸钠，用冰醋酸将
pH 调节到 6.50±0.05 ；流动相 B 相 ：80% 乙腈，流
速 1.0 mL/min，柱温 ：40℃，紫外检测器波长 254
nm。 梯 度 洗 脱 程 序 为 ：0-4 min，100% A ；4-16
min，97% A；16-17 min，89% A；17-32 min，79% A；
32-34 min，66% A ；34-38 min，0% A ；38.01 min，
100% A。
2 结果
2.1 重组菌SYPS-062△ilvE的构建
2.1.1 重组克隆和敲除质粒的构建 以 SYPS-062 基
因组 DNA 为模板，通过 PCR 方法获得 ilvE 基因上游
691 bp 片段及下游 706 bp 片段，以 PCR 产物为模板
通过交叉 PCR，获得 ilvE 基因内缺失 987 bp 的 DNA
片段△ilvE（图 1-A）。将获得的 1 376 bp 目的片段
△ilvE 与 pMD19-T 相连，转化 E. coli JM109 感受态
细胞，挑取单菌落培养提取质粒，BamH I 和 Hind
III 酶切鉴定（图 1-B）；利用限制性内切酶 BamH I
和 Hind III 处理，将回收片段与用相同处理的 pK19
mobsacB 混合，T4 DNA 连接酶过夜处理。连接产物
转化至 E. coli JM109，转化子为 E. coli JM109 pK19
mobsacB△ilvE。挑取单菌落培养提取质粒，BamH I
和 Hind III 酶切鉴定（图 1-C）。
图 1 PCR 产物和重组质粒酶切验证结果
A ：M. DL2000 DNA Marker ；1. ilvE 基因 5 端片段 ；2. ilvE 基因 3
端片段 ；3. ilvE 基因缺失 987 bp 片段△ilvE ；4. ilvE 基因未缺失原
始序列 ；B ：M. DL2000 DNA Marker ；1. BamH I 和 Hind III 双酶切
pMD19-T△ilvE 后 的 产 物 ；C ：M. DL5000 DNA Marker ；1. BamH I
和 Hind III 双酶切 pK19mobsacB△ilvE 后的产物
M 1 M 1 M 12 3 4
2000
bp
1000
750
500
100
250
2000
bp bp
1000
750
500
100
250
2000
3000
5000
1000
1500
750
500
100
250
A B C
2.1.2 重组菌 SYPS-062△ilvE 的构建 将 pK19mo-
bsacB△ilvE 电 击 转 化 至 SYPS-062 感 受 态 细 胞 中，
进行两次重组分别以 50 μg/mL Kan 和 10% 蔗糖筛选，
长出的单菌落包括回复野生型和目的片段缺失型，
分别挑取 6 个单菌落进行 PCR 扩增验证基因表型。
结果如图 2 所示，2#、3#、5# 和 6# 单克隆为 ilvE 基
因缺失型，1# 和 4# 单克隆 PCR 扩增产物与出发菌
株大小一致，为回复野生型。
2.2 营养条件对重组菌生长的影响
重组菌 SYPS-062△ilvE 在种子培养基中能够正
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期188
常生长，在全合成培养基中表现为生长停滞。按照
1.2.2 设计的氨基酸添加方案，考察对不同营养物质
添加方式对重组菌生长的影响。
代偿营养物质的添加方式及其对重组菌和出发
菌株生长的影响，如图 3 所示。
添加后，相对于 L-Ile 单独添加时生长分别提高 6.27%
和 7.43%，生长提高并不显著，表明其他转氨酶可
以发挥功能补偿由 ilvE 基因敲除引起的 L-缬氨酸和
L-亮氨酸减少，以满足正常生长对其的需求 ；但是，
L-Ile+L-Glu 组合添加后相对于 L-Ile 单独添加时生长
提高 27.54%，表明其他转氨酶更加偏向于利用 L-谷
氨酸作为氨基供体。
直接添加 Ile+Leu+Val 后，重组菌能够较好地生
长，发酵 96 h 后菌浓较仅添加 Ile 时提高了近 45%，
已满足进行其他试验的要求。
2.3 重组菌SYPS-062△ilvE和出发菌株氨基酸积累
的比较
ilvE 基因敲除突变株发酵 96 h 后，利用高效液
相色谱测定发酵液中氨基酸的含量，计算出 L-丝氨
酸、L-丙氨酸和 L-缬氨酸的单位菌体产率，结果如
图 4 所示。
2000
bp
M 21 3 4 5 6 7
1000
750
250
500
100
M. DL2000 DNA Marker ；1-6. 1#-6# 单克隆基因组 PCR 扩增 ilvE
基因片段 ；7. 出发菌株基因组 PCR 扩增 ilvE 基因片段
图 2 PCR 筛选二次重组菌中 ilvE 基因缺失菌株
60 WT
WT△ilvE
50
40
30
20
10
0 -- --Ala
Gln
Gln&Ala
lle&Ala
lle&Asp
lle&Glu
lle&Leu&Val
lle
O
D
56
2n
m
-- 空白对照（不添加代偿营养物质）
图 3 不同方式添加代偿营养物对重组菌和出发
菌株生长的影响
以 L-Ala、L-Gln 和 L-Ala + L-Gln 组合添加后重
组菌生长仍处于停滞状态，表明 ilvE 基因编码的转
氨酶 B 在 L-异亮氨酸生物合成末端转氨反应中发挥
主要作用，avtA 基因编码的转氨酶活性较低 ；单独
添加 L-Ile 后菌株能够较好生长，故 ilvE 基因敲除后
重组菌株 L-异亮氨酸生物合成能力降低，L-Ile 成为
生长限制性因子。单独添加 L-Ile 后重组菌株能够较
好地生长，表明 ilvE 基因敲除后不表现 L-亮氨酸和 L-
缬氨酸营养缺陷型 ；L-Ile+L-Ala 和 L-Ile+L-Asp 组合
2000
1000
1500
500
0
Ser Ala Val
≘ส
䞨ӗ
⦷m
g/
g·
C
D
W

WT
WT△ilvE
图 4 出发菌株和重组菌 L-丝氨酸、L-丙氨酸和
L-缬氨酸产率的比较
敲除 ilvE 基因之后，L-缬氨酸的产率由出发菌
株 525.5 mg/（g·CDW）减少至 50 mg/（g·CDW），
降幅达 90%，96 h 发酵中 L-缬氨酸浓度小于 0.5 g/L，
达到去除副产物的目的，同时也说明转氨酶 B 在催
化 α-酮异戊酸生成 L-缬氨酸反应中发挥主导作用。
L-丙氨酸的产率由 750 mg/（g·CDW）降低至 550
mg/（g·CDW），降低 25%。
重组菌 L-丝氨酸的产率与出发菌株相比减少近
20%，进一步研究发现，与 TCA 循环相关的 L-Glu、
2012年第11期 189罗玉常等 ：谷氨酸棒杆菌 ilvE 基因的敲除对相关氨基酸合成的影响
L-Pro、L-Thr 和 L-Lys 产率也相应发生了变化（图
5）。以 α-酮戊二酸为前体合成的 L-谷氨酸和 L-脯氨
酸含量较出发菌株高，其中 L-脯氨酸提高 3.3 倍，L-
谷氨酸也提高 15% ；以 TCA 中间代谢物草酰乙酸为
前体合成的 L-赖氨酸，由于 ilvE 基因敲除 L-异亮氨
酸合成受阻，使得代谢流从 L-天冬氨酸向 L-赖氨酸
转移，导致 L-赖氨酸产率和含量的提高，L-赖氨酸
产率提高 1.7 倍，而 L-苏氨酸产率降低近 50%。同
时对丝氨酸相关联途径进行分析，发现 L-甘氨酸在
两株菌中产率均在 60 mg/（g·CDW），表明 L-丝氨
酸通过丝氨酸羟甲基转移酶转化提供 1C 单元的量恒
定，L-甘氨酸在发酵液中含量约为 0.5 g/L 左右。L-
丝氨酸转化提供 1C 单元是其主要去向之一，在降解
代谢恒定的情况下，代谢流从 3-磷酸甘油酸大量进
入 TCA 循环是 L-丝氨酸产率降低的原因。
和 D-泛酸合成受阻，D-泛酸缺失将影响辅酶 A 的合
成进而影响菌体的生理功能。综合考虑，为维持菌
体正常的生理功能，在不影响 L-亮氨酸和 D-泛酸生
物合成对前体 α-酮异戊酸需求的同时，选择 L-缬氨
酸生物合成途径末端转氨反应作为改造靶点，将编
码转氨酶 B 的 ilvE 基因敲除，以期达到在一定程度
上阻断 α-酮异戊酸向 L-缬氨酸转化，减少 L-缬氨酸
的积累。
ilvE 基因编码的转氨酶 B 除了催化 α-酮异戊酸
转氨生成 L-缬氨酸，还参与 L-亮氨酸和 L-异亮氨酸
生物合成的转氨反应［18］（图 6），敲除该基因可能会
造成分支氨基酸营养缺陷。但是，一些转氨酶在功
能上相互重叠，分支氨基酸生物合成途径中转氨反
应还有其他转氨酶参与补偿［19，20］。
3.2 营养物质代偿策略
途径分析已表明，IlvE 以 L-Glu 为氨基供体，
分别催化 α-酮异戊酸、α-酮-β-甲基戊酸和 α-酮异己
酸转化为 L-缬氨酸、L-异亮氨酸和 L-亮氨酸，IlvE
的缺失影响到上述氨基酸的合成和积累，进而影响
到菌体生长。
由于不同转氨酶功能具有重叠性，营养物质添
加策略应考察不同外源氨基供体的代偿能力。鉴于
AvtA 能够以 L-Gln 和 L-Ala 为氨基供体，分别催化 α-
酮异戊酸、α-酮-β-甲基戊酸和 α-酮异己酸转化为 L-
缬氨酸、L-异亮氨酸和 L-亮氨酸；AroT 能够以 L-Ala、
L-Gln、L-Glu 和 L-Asp 为氨基供体，分别催化 α-酮
异戊酸和 α-酮异己酸转化为 L-缬氨酸和 L-亮氨酸 ；
HisC 能够以 L-Ala、L-Gln、L-Glu 和 L-Asp 为氨基供
体催化 α-酮异己酸转化为 L-亮氨酸 ；Ncgl0780 编码
的转氨酶以 L-Glu 为氨基供体催化 α-酮异己酸转化
为 L-亮氨酸［19，20］。
据此，设计出 1.2.2 的营养物质代偿方案。
利用代谢工程改造工业微生物的研究过程中，
改造对象的选择尤为重要。对代谢旁路改造时，选
择菌体自身能够进行代偿的反应作为改造对象是一
种较好的策略。
3.3 重组菌SYPS-062△ilvE的代谢特性和研究展望
重组菌 SYPS-062△ilvE 发酵 96 h，发酵液中 L-
缬氨酸含量大幅降低的同时 L-丙氨酸产率也降低 ；
≘ส
䞨ӗ
⦷m
g/
g·
C
D
W

WT
WT△ilvE
600
500
400
300
200
100
0
Glu Gly Thr Pro Lys
图 5 出发菌株和重组菌 L-Gly 和 TCA 相关的 L-Glu，
L-Pro，L-Thr 和 L-Lys 产率的比较
3 讨论
3.1 代谢途径分析与改造对象的确定
在谷氨酸棒杆菌中，L-缬氨酸的生物合成是以
丙酮酸为前体，其合成途径中间代谢产物 α-酮异戊
酸（O-Val），除了通过转氨反应生成 L-缬氨酸外，
还是 L-亮氨酸和 D-泛酸两种重要代谢物生物合成的
前体［13-16］（图 6）。同时，L-缬氨酸又作为氨基供体，
能够由 avtA 基因编码的转氨酶催化丙酮酸生成 L-丙
氨酸［17］。
丙酮酸经四步酶促反应生成 L-缬氨酸，如果选
择阻断前三步反应，必将造成 L-缬氨酸、L-亮氨酸
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期190
有研究报道，avtA 基因编码的转氨酶可催化 L-缬氨
酸和丙酮酸生成 L-丙氨酸，该途径是 L-丙氨酸合成
途径之一。为了积累 L-缬氨酸，Marienhagen 等［17］
将 avtA 基因敲除，使得 L-丙氨酸由 95 mmol/L 降低
到 70 mmol/L，同时 L-缬氨酸产量也得到提高。本研
究将 ilvE 基因敲除后，同时在未对 avtA 基因进行改
造的情况下，观察到 L-丙氨酸的产生率降低 25%，
说明 SYPS-062 中存在 L-缬氨酸向 L-丙氨酸转化的
途径。
ilvE 基因的缺失已达到降低发酵液中副产物 L-
缬氨酸和 L-丙氨酸的目的，但是，该菌株仍需进一
步进行有效改造以提高 L-丝氨酸的积累能力。
本研究结果表明，要减少发酵副产物、提高主
产物 L-丝氨酸的产量，单一阻断副产物 L-缬氨酸的
合成不能使主产物 L-丝氨酸合成能力提高，需要研
究不同代谢途径的系统结构关系，系统地进行代谢
工程改造才能提高主产物的积累。谷氨酸棒杆菌中 L-
丝氨酸生物合成是以糖酵解途径中间产物 3-磷酸甘
油酸为前体，分别在 3-磷酸甘油酸脱氢酶（3-PGDH）、
3-磷酸丝氨酸氨基转移酶（3-PSAT）和 3-磷酸丝氨
酸磷酸酶（3-PSP）的催化下合成［21］（图 6）；3-磷
酸甘油酸同时也转化为丙酮酸进入 TCA 循环，为维
持菌体正常的生理功能提供必需的物质和能量。
TCA 循环与菌体生命活动密切相关，而丝氨酸
的生物合成途径与中心代谢途径存在竞争关系，L-
丝氨酸的大量积累需要改变 3-磷酸甘油酸节点处代
谢流的分配，使得代谢流最大化用于合成 L-丝氨酸，
且与菌体生长协调统一。作者现已构建了 3-磷酸甘
油酸脱氢酶过表达重组质粒，并使得 3-磷酸甘油酸
节点处流向 L-丝氨酸合成途径的代谢流提高（结果
另文发表）。
在本研究的基础上，后续研究将对谷氨酸棒杆
菌 SYPS-062 进行系统代谢工程改造，以期突破发酵
法生产 L-丝氨酸的瓶颈。
4 结论
本研究通过代谢工程手段将编码转氨酶 B 的
ilvE 基因敲除，获得重组菌 SYPS-062△ilvE。重组
菌表现为 L-异亮氨酸营养缺陷型，其代谢产物中 L-
缬氨酸低于 0.5 g/L，同时 L-丙氨酸的生成率减少
25%，但是 L-丝氨酸的产率并未得到提高，相反与
TCA 循环相关的 L-Glu 和 L-Pro 生成率得到提高，这
与代谢流由 3-磷酸甘油酸节点处大量进入 TCA 循环
有关。
参 考 文 献
［1］ Hermann T. Industrial production of amino acids by Coryneform
Sucrose
Glucose
3-P-Glycerate P-Hydroxypyruvate
3-P-glycerate dehydrogenase
serC 3-phosphserine aminotransferase
serB 3-phosphserinc phosphatase
P-Serine
L-Serine
L-Glu
ilvD
avtA
aroT
avtA
aroT
hisC
ilvE transaminase B
L-Alanine
α-KG
α-Ketoglutarate
α-KG
α-KG
ilvC
ilvBN
serA
D-Pantothenate
Pyruvate
Coenzyme A
O-Val transaminase B
ilvE
O-ValPyruvate
avtA
L-Valine
L-Glu
O-Lcu
L-Leucine
L-Glutamate L-Proline
TCA cycle
OxalacetateL-Asp
L-Thr
L-Aspartate
Semialdehyde
L-Lysine
O-lle
L-Isoleucine
L-Glu
ilvE transaminase BavtA
图 6 谷氨酸棒杆菌转氨酶 B 参与的反应和 L-丝氨酸生物合成途径
2012年第11期 191罗玉常等 ：谷氨酸棒杆菌 ilvE 基因的敲除对相关氨基酸合成的影响
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（责任编辑 马鑫）