全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-05-03
基金项目 ：国家“863”高新技术发展计划（2006AA10Z198）
作者简介 ：田少囡，女，硕士研究生，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ; E-mail: tianshaonan111@163.com
通讯作者 ： 关伟军，男，教授，博士生导师，研究方向 ：动物遗传资源 ; E-mail: weijunguan301@gmail.com
马月辉，男，研究员，博士生导师，研究方向 ：动物遗传学 ; E-mail: Yuehui_Ma@hotmail.com
北京油鸡肺间充质干细胞的分离培养及鉴定
田少囡1 侯玲玲2 关伟军1 马月辉1
（1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193 ；2北京交通大学生命科学与生物工程研究院，北京 100044）
摘 要: 以 9-14 日龄北京油鸡肺脏组织为材料，Ⅳ型胶原酶消化，percoll 分离，获得肺间充质干细胞。进行免疫组化和
RT-PCR 鉴定，并比较 3 种培养体系对北京油鸡肺间充质干细胞增殖的影响。RT-PCR 结果显示，细胞免疫组化鉴定结果 CD44、
CD29 呈阳性，CD34 呈阴性。证实所培养的细胞为北京油鸡肺间充质干细胞 ；比较不同扩增培养体系，结果表明，培养体系
DMEM/F12+10%FBS+2.5 ng/mL bFGF 较有利于北京油鸡肺间充质干细胞的增殖。该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星
细胞，建立了适于北京油鸡肺间充质干细胞体外扩增的培养体系。
关键词: 北京油鸡 肺间充质干细胞 分离 培养 鉴定
Isolation, Culture and Identification of Pulmomary Mesenehymal Stem
Cells in Beijing Fatty Chicken
Tian Shaonan1 Hou Lingling2 Guan Weijun1 Ma Yuehui1
（1Institute of Beijing Animal Science and veterinary， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193;
2Institute of Biological Science and Technology， College of Science， Beijing Jiaotong Univeisity， Beijing 100044）
Abstract: PMSCs were isolated from 10-day-old chicken embryos， disassociated with collagenase Ⅳ and purified with percoll.
Identification was carried out by immunohistochemisty and RT-PCR. Proliferative capacities in three different culture systems were
compared as well. The results of immunohistochemisty and RT-PCR showed that PMSCs expressed the MSCs markers of CD29， CD44
while did not express endothelial cells specific marker CD34. It showed that they were indeed Beijing fatty chicken PMSCs. It represented
an optimal system for Beijing fatty chicken PMSCs to be cultured in media containing DMEM/F12+10%FBS+2.5 ng/mL basic fibroblast
growth factor （bFGF）. The present study successfully isolated and identified PMSCs in Beijing fatty chicken and established their
optimal in vitro culture system.
Key words: Beijing fatty chicken Pulmomary mesenehymal stem cells Isolation Culture Identification
干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜
能的细胞，近年来不断报道从人胚胎及成体组织中
分离得到干细胞 [1-3]。间充质干细胞是来源于中胚层
的一类多能干细胞，在细胞治疗应用中具有广阔的
前景。间充质干细胞可来源于不同的器官和组织（大
脑、心脏、脾、肝、肾、肺、骨髓、肌肉及胰腺）[4-7]。
人们也逐渐从外周血、骨骼肌或皮肤的组织结构中
发现了间充质干细胞的存在 [8,9]，并且在骨髓中发现
了一种更原始的细胞 [10]，称为多能成体祖细胞，也
属于间充质干细胞。从成体不同组织中得到间充质
干细胞，并将其用于修复自体的受损组织 [11,12]，为
组织工程带来了新的思路和希望。但是关于肺脏中
存在干细胞的报道较少 [13]。本试验旨在分离北京油
鸡的肺间充质干细胞（pulmomary mesenehymal stem
cells，PMSCs），建立适合的生长体系，为今后进一
步研究北京油鸡肺间充质干细胞提供技术平台。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期140
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 对象 北京油鸡 9-14 日龄鸡胚由中国农业科
学院北京畜牧兽医研究所家禽实验基地提供。试验
前对鸡胚进行紫外线照射 15 min 左右，喷洒酒精进
行消毒处理。
1.1.2 主要试剂 FBS、α-MEM：德国 Hyclone 公司；
bFGF：英国 Peprotech 公司；DMEM/F-12 培养基、B-27、
胰蛋白酶（Trypsin 1 250）：美国 Gibco 公司 ；Ⅳ型
胶原酶、TritonX-100、DMSO、L- 谷氨酰胺、台盼蓝：
美国 Sigma 公司 ；青霉素、链霉素、多聚甲醛 ：北
京化工厂 ；小鼠抗鸡 CD29、CD44 ：美国 ABcam 公
司；BSA、正常山羊血清、山羊抗小鼠 FITC 标记二抗：
中国北京中杉金桥生物技术有限公司 ；Trizol ：美国
Invitrogen 公司 ；反转录试剂盒 TaKaRa RNA PCR Kit
（AMV）Ver. 3.0 ：中国大连宝生物工程有限公司 ；
其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 油鸡肺间充质干细胞分离、培养 选取 9-14
日龄鸡胚，紫外线消毒。无菌台操作，剖胸取出肺
组织，置于平皿中，剔除气管和支气管等组织，用
PBS 反复冲洗，洗去血细胞。将肺组织剪成约 1 mm3
大 小， 用 0.2% 胶 原 酶 Ⅱ / Ⅳ（2 mg/mL）、37 ℃ 消
化 20 min。消化后的细胞悬液用移液器吹打数次，
200 目钢丝网过滤大块组织，制成单细胞悬液。用
Percoll（ 密 度 1.083 g/mL，1 500 r/min，15 min） 密
度梯度离心分离单个核细胞。收集白色细胞层，用
完全培养基重悬细胞计数。按 1×105/cm2 接种于六
孔培养皿中，培养体系含完全培养基、10% 胎牛血清、
100 U/mL 青霉素、100 U /mL 链霉素，37℃、5%CO2
和饱和湿度条件下培养。24 h 后换液去除未贴壁细
胞，每周换液 2 次。倒置相差显微镜及倒置荧光显
微镜下观察细胞的形态及生长情况。
1.2.2 北京油鸡 PMSCs 培养体系的优化 根据文献
设计了 3 种培养方案，具体如下：培养体系Ⅰ：α-MEM
基础培养基 +10%FBS + 2 mmol/L L- 谷氨酰胺 + 100
IU/mL 青 霉 素 + 100 μg/mL 链 霉 素。 培 养 体 系 Ⅱ ：
DMEM/F-12 基础培养基 +10%FBS + 2 mmol/L L- 谷氨
酰胺 + 100 IU/mL 青霉素 + 100 μg/mL 链霉素。培养
体 系 Ⅲ ： DMEM/F-12 基 础 培 养 基 +10% FBS +
2 mmol/L- 谷氨酰胺 + 100 IU/mL 青霉素 + 100 μg/mL
链霉素 + 2.5 ng/mL bFGF。
1.2.3 北京油鸡 PMSCs 的传代、冻存与复苏 当细
胞生长汇合至 70%-80% 时，便可进行传代。吸去
培养液，用 PBS 漂洗 3 次，0.25% 胰蛋白酶消化。
倒置显微镜观察细胞形态，发现大量细胞回缩变圆
时，吸去胰酶，加入完全培养基反复吹打细胞，根
据细胞密度以 1 2 或者 1 3 的比例进行传代。将
原代细胞标记为 P0，依次类推，标记为 P1、P2、
P3、……Pn。传代之后根据细胞情况进行换液，每
天观察细胞生长情况并进行拍照，每 2-3 d 更换一
次完全培养基。细胞冻存与复苏参照 Jenkins[12] 的
方法，取传至第 3 代的细胞，胰酶消化，收集脱壁
细胞，离心，弃上清，用细胞冻存液（50%DMEM
+40%FBS+10%DMSO）重悬细胞，-80℃冰箱过夜，
次日投入液氮罐中长期保存。细胞复苏时将冻存管
从液氮中取出，迅速投入 42℃水浴锅中，不停摇动
冻存管使受热融化，离心，弃上清，加入细胞培养
液重悬细胞，移至培养板 37℃、5%CO2 的培养箱中
继续培养。
1.2.4 北 京 油 鸡 PMSCs 免 疫 荧 光 鉴 定 （1） 制
备 细 胞 爬 片， 当 细 胞 汇 合 至 60%-70% 时， 取 出
爬 片， 用 PBS 漂 洗 3 次。（2） 4% 多 聚 甲 醛 室 温
下 固 定 15 min，PBS 漂 洗 3 次， 每 次 5 min。（3）
0.1%TritonX-100 室温下破膜处理 15 min，PBS 漂洗
3 次，每次 5 min。（4） 10% 正常山羊血清室温下封
闭 30 min。（5） 将一抗原液按 1 100 比例用 3% BSA
稀释后滴加到细胞爬片上，将爬片置于湿盒内，室
温下孵育 1 h。（6） 用 PBS 仔细漂洗细胞爬片 3 次，
每次 10 min，以洗去与细胞非特异性结合的抗体。（7）
将 FITC 标记的二抗按 1 100 比例用 PBS 稀释后滴
加到细胞爬片上，将爬片置于湿盒内，37℃条件下
避光孵育 1 h。（8） PBS 漂洗 3 次，每次 10 min。（9）
将 PI 按 1 100 比例用 PBS 稀释后滴加到细胞爬片上，
将爬片置于湿盒内染核 5 min。（10） PBS 漂洗 3 次，
每次 5 min。于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
1.2.5 北京油鸡 PMSCs RT-PCR 鉴定
1.2.5.1 收 集 PMSCs 细 胞 当 细 胞 生 长 汇 合 至
70%-80% 时，常规法消化收集细胞，1 000 r/min 离
2011年第12期 141
心 10 min 后用预冷的 PBS 洗涤细胞沉淀 2 次。
1.2.5.2 细胞总 RNA 的提取 用 DEPC 水提前处理
RNA 提取过程中所用器具均需要 24 h 以上。
（1）用 1 mL Trizol 溶解细胞沉淀后，将细胞
悬液转移至 1.5 mL 离心管中，于室温下静置 5 min，
充分裂解细胞。（2）向离心管中加入 0.2 mL 氯仿，
上下颠倒震荡 15 s（需注意用力不要过猛），于室温
下静置 2-3 min。（3）将离心管放入低温高速离心机
中，4℃，12 000 r/min，离心 12 min。离心后可见液
体分为 3 层，从上至下依次为水相层、中间层及有
机相层。RNA 处于水相层中。（4）将水相层转移至
另一离心管中，加入 0.4 mL 异丙醇沉淀核酸，混匀
后于室温下静置 10 min。（5）4℃，12 000 r/min，离
心 10 min。离心后可见管侧壁及底部有白色 RNA 沉
淀。（6）去上清，用 75% 乙醇（DEPC 水配制）洗
涤 沉 淀 2 次。（7）4 ℃，12 000 r/min， 离 心 5 min。
弃去上清后，于室温下晾干，视提取的 RNA 的量加
入 10-50 μL 无 Rnase 的 DEPC 水。于紫外分光光度
计下测定 260 和 280 nm 下的 OD 值。若提取的 RNA
无污染、无降解，则 OD260/280 的值应在 1.8-2.0 之间。
1.2.5.3 cDNA 的 合 成 提 取 的 总 RNA 用 TaKaRa
RNA PCR Kit（AMV）Ver. 3.0 反 转 录 合 成 并 扩 增
cDNA。反应体系见表 1。反应程序 ：30℃ 10 min;
42℃ 30 min ；99℃ 5 min，5℃ 5 min，1 个循环。合
成的 cDNA 于 -20℃保存备用。
组成 用量（μL）
MgCl2 2.0
10×RT Buffer 1.0
Rnase Free H2O 3.75
dNTP Mixture（各 10 mmol/L） 1.0
Rnase Inhibitor 0.25
AMV Reverse Transcriptase 0.5
Random 9mers 0.5
RNA 1.0
总体积 10
表 1 RT-PCR 反应体系
表 2 北京油鸡 PMSCs RT-PCR 检测引物
基因 引物序列 退火温度 Tm（℃） 产物长度 （bp） 循环数
CD29
S 5 GAACGGACAGATATGCAACGG 3
A 5 TAGAACCAGCAGTCACCAACG 3
60 300 30
CD44
S 5 CATCGTTGCTGCCCTCCT 3
A 5 ACCGCTACACTCCACTCTTCAT 3
58 290 30
GAPDH
S 5 TAAAGGCGAGATGGTGAAAG 3′
A 5 ACGCTCCTGGAAGATAGTGAT 3′
53 244 30
表 3 PCR 反应体系
组成 用量（μL）
dNTP（2.5 mmol/L） 2.0
10×Buffer 2.5
TaKaRa EX-Taq HS 0.25
ddH2O 16.75
上游引物（10 μmol/L） 1.0
下游引物（10 μmol/L） 1.0
cDNA 模板 1.5
总体积 25
田少囡等 ：北京油鸡肺间充质干细胞的分离培养及鉴定
1.2.5.5 PCR 检测 反应体系见表 3。 反应程序 ：预变性 94℃ 5 min ；变性 94℃ 30 s ；
退火（53-60℃） 30 s，延伸 72℃ ；30 s 延伸 72℃ 10
min，30 个 循 环。 将 8 μL PCR 产 物 与 2 μL loading
buffer 混匀后于进行 2% 琼脂糖凝胶电泳。电泳结束
后，用紫外透射仪检测目的基因表达情况。
2 结果
2.1　北京油鸡PMSCs的分离
刚分离的鸡 PMSCs 呈圆形（图 1），在倒置显
微镜下观察，折光性比较强，4-6 h 贴壁，贴壁后的
细胞大多数形态为三角形，梭形以及多边形。当观
1.2.5.4 特异性引物设计 从 NCBI 网站上获取相关
基因信息，利用 Primer Premier 5.0 软件进行特异性
引物的设计（表 2）。引物由赛百盛生物工程有限公
司合成。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期142
察大量细胞贴壁时换液。随培养时间延长，细胞密
度增加，细胞开始有规律的排列，培养至 3 d 左右。
细胞即可达到 70%-80% 汇合，呈现旋涡状，此时
可以进行细胞传代。
2.4 北京油鸡PMSCs免疫荧光检测
本实验选用小鼠抗鸡 CD29、CD44 和 CD34 多
克隆抗体对 P3 代北京油鸡 PMSCs 细胞进行了表面
抗原标记的免疫荧光检测，结果如图 4 所示。 由图
4 可知，分离培养的 P3 代 PMSCs 普遍表达间充质
干细胞表面标记物 CD29 和 CD44，而对于内皮细胞
特异性标记物 CD34 的表达呈阴性。其中 D1、D2 和
D3 为细胞的相差图片 ； B1、B2 和 B3 为 PI 染色图
片 ；A1、A2 和 A3 为荧光图片 ；C1、C2 和 C3 为 PI
与荧光叠加图片。
图 1 原代 PMSCs 形态
2.2 北京油鸡PMSCs培养体系的优化
通过 3 种培养体系的对比观察，绘制生长曲线
（图 2）。3 种培养体系中，体系Ⅲ培养的细胞贴壁形
态清晰，立体感强，细胞空泡化少，细胞增殖速度快。
所以，体系Ⅲ DMEM/F-12 基础培养基 +10% FBS+
2 mmol/L L- 谷氨酰胺 +100 IU/mL 青霉素 +100 μg/mL
链霉素 +10 ng/mL bFGF 最有利于北京油鸡肺间充质
干细胞的生长增殖。
图 2 三种培养体系培养的细胞生长曲线的比较
2.3 北京油鸡PMSCs的传代、冻存与复苏
采用优化后的培养体系对北京油鸡 PMSCs 进
行传代培养。传代后的细胞刚接种时成圆形，2 h 左
右即可贴壁，6 h 完全贴壁并伸展为长梭形，进行换
液。传代后细胞形态主要为成长梭状。传代后细胞
增殖速度较快，约 2-3 d 即可达到 80% 的汇合。随
传代次数增加，细胞逐步被纯化。但传代至 P15 代
时，增殖能力减慢。随培养时间延长，细胞生长速
度越来越慢。传代后细胞形态见图 3。采用台盼蓝
染色测定冻存前和复苏后的北京油鸡骨骼肌卫星细
胞的活率，细胞冻存前和复苏后活率分别为 97.8%
和 94.6%。冻存前后细胞生长速度、形态无明显差异。
A.P3 代 PMSCs 形态 ; B.P19 代 PMSCs 形态 ; C.P25 代 PMSCs 形态
图 3 PMSCs 细胞形态观察（40x）
A1-D1. CD44+ ；A2-D2. CD29+ ；A3-D3. CD34-
图 4 北京油鸡 PMSCs 免疫荧光检测（40x）
2.5　北京油鸡PMSCsRT-PCR检测
参考目前文献报道的间充质干细胞普遍表达的
基因，从 NCBI 收录的信息中查询到了购买两种已
提交的鸡的基因序列 CD29 和 CD44。利用这两条基
因序列设计了两对特异性引物进行 RT-PCR 扩增。
试验结果（图 5）表明分离培养的 PMSCs 对上述两
种基因均有表达。
3 讨论
在试验过程中发现，培养的肺间充质干细胞中
最主要的杂细胞为上皮细胞，呈鹅卵石状排列。试
验分别取了 9-14 日龄的鸡胚做过多次试验对比，总
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结规律 ：选取鸡胚日龄越小，杂细胞越少。本试验
最终确定选取 10 日龄鸡胚为试验材料，尽量避免杂
细胞干扰。但同时 10 日龄以下的鸡胚，肺脏太小，
细胞提取操作难度较大，对试验操作的准确性和熟
练性，提出了更高的要求和挑战。
通过查阅文献，一般试验在细胞传代后 24 h 进
行换液。但是通过试验发现，细胞传代后 4-6 h 细
胞贴壁情况最为理想，若不及时换液，按照 24 h 换
液标准操作，贴壁的细胞反而会减少 ；如果超过
24 h 不进行换液，细胞则全部脱壁死亡。为获得最
佳试验效果，本试验确定选择 4-6 h 后进行换液，
试验结果证明此操作对传代细胞生长产生了更好的
生长效果。
按 照 Thirumala 等 [14] 对 不 同 冻 存 液 配 方 对 人
P1 代 MSCs 的活力和凋亡率的影响研究结论 ：用不
添加的 DMSO 冻存液保存细胞并复苏后，细胞出现
明显的凋亡和坏死现象，并且含 2% DMSO 的无血
清 DMEM 的冻存液与含 10% DMSO 以及 80% 血清
的冻存液对人 MSCs 活率的影响差异不显著。本试
验尝试选用了 50% DMEM 培养液 + 40% FBS + 10%
DMSO 进行试验。发现冻存前后细胞的活率有所差
异，但是复苏后的细胞的生长增殖能力没有明显差
异。因此，说明在进行冻存与复苏的过程，可能是
冻存液中 DMSO 毒性以及操作过程中的外力作用对
细胞造成了一定程度的损伤。
由于在体外常规培养过程中 MSCs 的扩增倍数
有限，且随着培养时间的延长和传代次数的增加不
断丧失其干细胞特性，表现为增殖能力下降和多向
分化潜能的丢失 [15-18]。因此，体外培养环境对 MSCs
的扩增与多向分化潜能的维持起着重要的作用 [19]。
先前研究中对于 PMSCs 的培养体系主要是采用两种
基础培养基 α-MEM 和 DMEM/F-12。所以在本试验
过程中设计了 3 种培养基的培养体系进行对比选择，
发现 α-MEM 培养体系培养的细胞空泡化现象严重。
在增殖能力方面，设计了两种体系，加入 bFGF 和
不加入 bFGF，发现 bFGF 可以提高细胞增殖能力，
促进 PMSCs 生长。
CD34（细胞表面的唾液黏蛋白）是一种属于Ⅰ
型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白，是造血干细胞的重要表
面标志 [20]。Strem 等 [21] 报道的人 MSCs 表达 CD29、
CD44、CD90 和 CD105 等 标 记， 不 表 达 CD31、
CD34、CD45、CD104 和 CD106 等。所以本试验中
选取抗体 CD34、CD29 和 CD44，利用免疫荧光标记
和 RT-PCR 两种方法共同检测北京油鸡 PMSCs。试
验结果表明，我们所分离培养的 PMSCs 表达 CD29、
CD44，而不表达内皮细胞特异性标记物 CD34。所
以证明了试验分离出的细胞是肺间充质干细胞。
4 结论
本试验借鉴先前相关试验成功经验，并合理调
整试验操作和科学选取培养基，成功地分离出了北
京油鸡肺间充质干细胞并对完成鉴定，同时尝试探
索了以肺间充质干细胞形式进行遗传资源保存与利
用，建立了适于北京油鸡肺间充质干细胞体外分离
增殖体系，为建立禽类肺间充质干细胞库奠定了基
础。保存的遗传资源可以作为细胞治疗和基因治疗
的种子细胞，为骨组织工程及呼吸系统修复提供研
究对象。
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田少囡等 ：北京油鸡肺间充质干细胞的分离培养及鉴定
A: M. marker Ⅰ ；1. GAPDH 244 bp ；2. CD44 290 bp;
B: M. marker Ⅰ ；1. GAPDH 244 bp ；2. CD29 300 bp
图 5 北京油鸡 PMSCs RT-PCR 检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期144
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（责任编辑 狄艳红）