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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-09-26
基金项目 : 广东省自然科学基金资助项目（10152800001000007）
作者简介 : 张浩吉 , 男 , 博士 , 研究方向 : 动物寄生虫病 ; E-mail: zhanghaoji@yahoo.com.cn
猪鞭虫和斯氏鞭虫线粒体 pnad4和 pcox1
基因的扩增与序列分析
张浩吉1 梁祥解1， 2 白挨泉1 李高强1， 2 李金平1， 2
郭建超1， 2 张更利1 蒲文 1 李国清2
（1 佛山科学技术学院动物医学系，佛山 528231 ；2 华南农业大学兽医学院，广州 510642）
摘 要： 以采自广东不同地区的猪鞭虫（Trichuris suis）和斯氏鞭虫（Trichuris skrjabini）为研究对象，扩增线粒体基因组的 pnad4
和 pcox1基因，将扩增产物纯化后克隆至 pMD18-T载体，对阳性菌落进行测序和序列分析。结果表明，来源于不同地区的鞭虫上
述两个基因种内相对保守，差异性不大，但种间差异较大。猪鞭虫和斯氏鞭虫的 pnad4长度均为 468 bp，相互间有 162个种间遗
传标记位点；猪鞭虫和斯氏鞭虫的 pcox1长度分别为 600 bp与 438 bp，相互间有 156个种间遗传标记位点。两种鞭虫之间的 pnad4
基因差异率为 45.1%-45.9%，pcox1基因差异率为 44.1%-45.4%。上述线粒体两个基因均可作为区分两种线虫的种间遗传标记。
关键词： 猪鞭虫 斯氏鞭虫 pnad4基因 pcox1基因 序列分析
Amplification and Sequences Analysis of Mitochondrial pnad4 and
pcox1 Gene in Trichuris suis and Trichuris skrjabini
Zhang Haoji1 Liang Xiangjie1, 2 Bai Aiquan1 Li Gaoqiang1, 2 Li Jinping1, 2 Guo Jianchao1, 2
Zhang Gengli1 Pu Wenjun1 Li Guoqing2
（1Department of Veterinary Medicine, Foshan University, Foshan 528231；2College of Veterinary Medicine,
South China Agricultural University, Guangzhou 510642）
Abstract: The mitochondria NADH dehydrogenase subunit gene IV （pnad4） and cytochrome coxidase subunit Ⅰ（pcox1） of Trichuris
suis and Trichuris skrjabini that collected from different areas of Guangdong province were amplificated, cloned and sequenced. The results
showed that the lengths of pnad4 genes sequences both Trichuris suis and Trichuris skrjabini were 468 bp. The lengths of Trichuris suis and
Trichuris skrjabini pcox1 genes sequences were 600 bp and 438 bp, respectively. There were 162 interspecies genetic marker sites of the two
species of Trichuris in the fragment of pnad4, and 156 in the fragment of pcox1 based on the sequence analysis. The difference of the two species
of Trichuris in the fragment of pnad4 gene was 45.1%-45.9%, and the difference in the fragment of pcox1 gene was 44.1%-45.4%. The two
fragments of the mtDNA can be used as genetic markers to distinguish the Trichuris suis and Trichuris skrjabini.
Key words: Trichuris suis Trichuris skrjabini pnad4 gene pcox1 gene Sequence analysis
鞭虫为鞭尾目（Trichurata）、鞭虫科（Trichuri-
dae）、鞭虫属（Trichuris），是寄生于动物和人体肠道
常见的线虫。动物鞭虫以猪、绵羊和山羊的感染最
普遍，危害也最严重，尤其是对幼畜，严重感染时
可引起仔猪、羔羊死亡［1, 2］。鞭虫具有特殊的外形，
形态学方面很容易鉴定到属。种的鉴定是以虫体的
大小、食道部占虫体全长的比例、雄虫交合刺的长
度、交合刺鞘、虫卵等形态特征为主要鉴别依据［3］。
但不同种鞭虫之间形态差异较小，加之雄虫往往尾
部卷曲，给交合刺长度测量和交合刺鞘的形态观察
带来了困难，妨碍了虫体种类的准确鉴定。近年
来，PCR 技术在寄生虫的分子分类学、种株鉴定等
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期84
方面得到了广泛的应用。线虫的线粒体 DNA（简称
mtDNA）作为胞核外遗传物质，具有分子量小、结
构简单、进化速度快、母性遗传、无组织特异性等
特点，是目前研究寄生虫分子分类、群体遗传、系
统进化的一种较好的分子标记［4，5］。其中，mtDNA
的细胞色素 c 氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase
subunit I， 简称 cox1）和烟酰胺脱氢酶亚基Ⅳ （NADH
dehydrogenase subunit Ⅳ，简称 nad4）等基因作为虫
种的遗传标记，已广泛应用于多种寄生蠕虫的群体
遗传和分类研究［6-8］，但未见对鞭虫线粒体上述相
关基因的研究。本研究以猪鞭虫（Trichuris suis）和
斯氏鞭虫（T. skrjabini）为研究对象，扩增其线粒体
基因组的 pnad4 和 pcox1 基因并进行系统进化分析，
为两种虫体间的分子鉴定和系统发生关系提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 虫体样品 广东不同地区采集的猪鞭虫 3 个
样品，分别为编号 TsKP（来源于开平），TsSH（来
源于四会），TsHZ（来源于惠州）。采集自羊的斯氏
鞭虫 3 个样品，分别编号为 TSsZC（来源于增城）、
TSsHZ（来源于惠州）、TSsNH（来源于南海）。
1.1.2 酶和载体 Ex Taq DNA 聚合酶、EcoR Ⅰ限
制性内切酶、T4 DNA 连接酶和 pMD18-T Easy 载体
均为 TaKaRa 公司产品，蛋白酶 K 为 Merk 公司产品。
1.1.3 试剂和试剂盒 Genonic DNA min kit Protocol
Tissue 和 WizardTM PCR Preps DNA Purification System
为 Promega 公司产品，UNIQ-10 柱式 PCR 产物纯
化试剂盒为上海生工产品。Buffer、MgCl2、dNTPs、
DNA 分子量标准 DL2000 为大连 TaKaRa 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 虫体总 DNA 的提取 从 70% 的酒精保存液
中取出单个的成虫，用双蒸水反复吹打冲洗 2 次
后，再用超纯水反复冲洗 2-3 次，置于一新的 1.5
mL 的 Eppendorf 管中。洗净后的虫体悬液用 Genonic
DNA min kit Protocol Tissue 提取虫体总 DNA。提出
的 DNA 样品置于 -20℃冰箱保存备用。
1.2.2 PCR 扩增 采用 Bowles 等［8］报道的引物进
行鞭虫线粒体基因组 cox1 基因的扩增，引物序列
为 JB3 ：5-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3，
JB4.5 ：5-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3。
用 于 扩 增 虫 体 pnad4 的 引 物 序 列 为 ：nad4up ：
5-TAAGGCTCATGTWGAAGCTCCYG-3；nad4dn ：
5-ACCAAWGCAACAGAMGGAGGWGWAC-3。PCR
扩 增 体 系 均 为 25 μL ：10×PCR Buffer（Mg2+ free）
2.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL、dNTPs（2.0 mmol/L
each）2 μL、上游引物（20 pmol/μL）0.5 μL、双蒸
水 15.85 μL、Ex Taq 酶（5 U/μL）0.15 μL、 模 板 2
μL。PCR 扩增程序均为 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，
55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个循环 ；72℃ 10 min。以
蒸馏水为阴性对照。扩增产物用 1% 的琼脂糖凝胶
进行电泳，紫外透射仪观察结果，并拍照记录。
1.2.3 PCR 产物的克隆 PCR 产物的纯化及与质粒
pGEM-T Easy 的连接分别参照试剂盒的说明进行。
连接产物的转化、阳性克隆的筛选按《分子克隆实
验指南》上的方法进行。
1.2.4 重组菌的鉴定 用灭菌牙签挑取单个阳性
转化子菌落接种于 5 mL LB 液体培养基中，并加入
5 μL Amp，于恒温摇床中 37℃，150 r/min 培养 4-6 h。
取 2 μL 菌液作模板按 1.2.2 的方法进行 PCR 鉴定，
将鉴定为阳性转化的菌液作好标记，4℃保存备用。
1.2.5 序列测定与分析 取经重组菌液 PCR 鉴定为
阳性克隆的重组菌液 300 μL，送上海博尚生物工程
技术服务有限公司进行核苷酸序列测定，将测定序
列与 GenBank 中已知的各种物序列进行相似性搜索，
寻找相似性最高的核苷酸序列。使用 Clustalx 1.81，
将试验测得的序列与 GenBank 中相似程度最高的序
列进行比对分析。比较其核苷酸序列差异性和相似
性，并在此基础上构建系统进化树，研究遗传关系。
2 结果
2.1 鞭虫线粒体部分基因的PCR扩增结果
2.1.1 pnad4 基因的 PCR 扩增 以 nad4up 和 nad4dn
为引物，对 6 个样品线粒体 pnad4 基因进行 PCR 扩
增（图 1），结果均扩增出大小约 470 bp 的片段，与
预期目的片段长度相符，且无非特异性条带。
2.1.2 pcox1 基因的 PCR 扩增 以 JB3 和 JB4.5 为引
物，对 6 个样品线粒体 pcox1 基因进行 PCR 扩增（图
2），结果以猪鞭虫基因组 DNA 为模板的 3 个样品
均扩增出约 600 bp 的片段。以斯氏鞭虫基因组 DNA
2012年第6期 85张浩吉等 ：猪鞭虫和斯氏鞭虫线粒体 pnad4 和 pcox1 基因的扩增与序列分析
为模板的 3 个样品均扩增出约 450 bp 的片段。与预
期目的片段长度相符，且无非特异性条带。
M. DL2000 DNA Marker ；1-3. 猪鞭虫 ；4-6. 斯氏鞭虫 ；7. 空白对照
图 1 鞭虫 pnad4基因 PCR扩增结果
M. DL2000 DNA Marker ；1-3. 猪鞭虫 ；4-6. 斯氏鞭虫 ；7. 空白对照
图 2 鞭虫 pcox1基因的 PCR扩增结果
2.2 重组菌的PCR鉴定结果
2.2.1 pnad4 重组菌的 PCR 鉴定 6 个样品的线粒
体 pnad4 基因的 PCR 产物纯化后经连接、转化。每
个样品取阳性菌落作菌液 PCR 扩增，6 个阳性菌株
均成功扩增出约 470 bp 的 pnad4 基因片段（图 3），
与预期目的片段长度相符，且无非特异性条带。
M. DL2000 DNA Marker ；1-3. 猪鞭虫 ；4-6. 斯氏鞭虫 ；7. 空白对照
图 3 鞭虫 pnad4基因片段菌液 PCR扩增结果
M. DL2000 DNA Marker ；1-3. 猪鞭虫 ；4-6. 斯氏鞭虫 ；7. 空白对照
图 4 鞭虫 pcox1基因片段菌液 PCR扩增结果
基因的长度不同，分别为 600 bp 与 438 bp。试验所
获上述序列已被 GenBank 收录，猪鞭虫 3 个样品线
粒体 nad4 和 cox1 基因的序列号分别为 TsKP：HQ20-
4215、HQ204209 ；TsSH ：HQ204216、HQ204210 ；
TsHZ ：HQ204214、HQ204208。斯氏鞭虫 3 个样品
线粒体 nad4 和 cox1 基因的序列号分别为 TSsZC ：
HQ204219、HQ204213 ；TSsHZ ：HQ204217、
HQ204211；TSsNH：HQ204218、HQ204212。将上述
序列用 Bioedit（V 4.0）进行序列分析，其种内和种
间差异性比较结果如表 1 所示。
2.4 线粒体部分基因的系统进化分析
从 GenBank 数据库下载 Trichinella spiralis的 pn-
ad4、pcox1 基因片段作为外群（登录号 AF293969），
根据试验所得序列，采用 Dnastar（version 3.67）、Dn-
asp（version 4.0）、Mega（version 4.1）相邻连接方法
（NJ）、最小进化方法（ME）、最大简约方法（MP）、
UPGMA 法构建进化树，再利用 Treeview 查看结果，
如图 5、图 6。结果显示，两种鞭虫线粒体 DNA 的
两个基因片段种间的差异是明显的。
3 讨论
与细胞核 DNA 相比，线粒体 DNA 作为生物体
种系发生的“分子钟”，具有突变率高、母性遗传等
特点，但因在同一基因组内各基因间突变率不同，
使得这些基因成为寄生蠕虫分子分类学和群体遗传
学研究的有用遗传标记［5］。刘自逵等［9］研究猬迭宫
绦虫湖南分离株线粒体 cox1 和 nad1 的遗传变异情
况显示，猬迭宫绦虫 pcox1 和 pnad1 基因序列种内
相对保守，种间差异较大，故均可作为种间遗传变
异研究标记。刘伟等［10］对日本血吸虫线粒体 nad4
基因的研究也获得类似结果。上述主要是吸虫和绦
虫的研究结果，本研究对广东不同地区的猪鞭虫和
斯氏鞭虫 mtDNA 的 pnad4、pcox1 基因进行 PCR 扩
增和序列分析表明，猪鞭虫和斯氏鞭虫的 pnad4 长
2.2.2 pcox1 重组菌的 PCR 鉴定 6 个样品的线粒
体 pcox1 基因的 PCR 产物纯化后经连接、转化。对
每一个样品取阳性菌落作菌液 PCR 扩增，其中 3 个
阳性菌株成功地扩增出约 600 bp 猪鞭虫 pcox1，另
外 3 个阳性菌株亦成功扩增出约 450 bp 的斯氏鞭虫
pcox1 基因片段，与预期目的片段长度相符，且无非
特异性条带（图 4）。
2.3 序列测定与比对分析结果
猪鞭虫和斯氏鞭虫线粒体 pnad4 基因的长度相
同，均为 468 bp、猪鞭虫和斯氏鞭虫线粒体 pcox1
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度均为 468 bp，同种鞭虫的 pnad4 基因种内相对保
守，但种间有 162 个种间遗传标记位点，种间变异
率为 45.1%-45.9% ；猪鞭虫和斯氏鞭虫的 pcox1 基
因长度分别为 600 bp 和 438 bp，同种鞭虫 pcox1 基
因种内相对保守，但种间有 156 个种间遗传标记位
点，种间变异率为 44.1%-45.4% ；上述鞭虫线粒体
的 pnad4 和 pcox1 基因都可作为区分两种线虫的种
间遗传标记。基于猪鞭虫与斯氏鞭虫的 mtDNA 的
pnad4、pcox1 基因所得到的进化树具有相似性，进
一步证实两种虫体种间分群较明显，种内不同来源
的虫株间无明显差别。
4 结论
猪鞭虫和斯氏鞭虫线粒体的pnad4和 pcox1基因
种内保守，差异性不大，但种间差异较大。猪鞭虫
和斯氏鞭虫线粒体的 pnad4 基因大小，均为 468 bp，
pcox1 基因长度，分别为 600 bp 与 438 bp。pnad4 和
pcox1 基因均可作为鉴别鞭虫的种间遗传标记。
参 考 文 献
［1］ Weng YB, Hu YJ, Li Y, et al. Survey of intestinal parasites in pigs
from intensive farms Guangdong province, People’s Republic of
China. Vet Parasitol, 2005, 127: 333-336.
［2］ 张国华 , 杨柳 , 宁长修 , 等 . 猪毛首线虫（猪鞭虫）感染人体调
查 . 中国人兽共患病杂志 , 2000, 16（6）:78.
［3］ 卢俊杰 , 靳家声 . 人和动物寄生线虫图谱［M］. 北京 : 中国农
业科学技术出版社 , 2002: 578-587.
［4］ Feagin JE. Mitochondrial genome diversity in parasites. International
Journal for Parasitology, 2000, 30（4）: 371-390.
［5］ Tsang WY, Lemire BD. The role of mitochondria in the life of the
nematode, Caenorhabditis elegans. Biochimica Biophysica Acta,
2003, 1638（2）: 91-105.
［6］ Blouin MS. Mitochondrial DNA diversity in nematodes. Journal of
Helminthology, 1998, 72（4）: 285-289.
［7］ Sandra I, Soto U, Lehmann T, et al. Porter speciation and population
structure in the morphospecies Lutzomyia longipalpis （Lutz &
Neiva） as derived from the mitochondrial nad4 Gene. Mol Phylogen
Evol, 2001, 18（1）: 84-93.
［8］ Gasser RB, Zhu XQ, Mcmanus DP. NADH dehydrogenase subunit 1
and cytochrome coxidase subunit I sequences compared for members
of the genus Taenia （Cestoda）. Int J Parasitol, 1999, 29（12）:
1965-1970.
［9］ 刘自逵 , 刘国华 , 戴荣四 , 等 . 湖南省猬迭宫绦虫的线粒体
cox1 和 nad1 基因的序列测定及种系发育分析 . 畜牧兽医学报 ,
2010, 41（4）: 463-468.
［10］ 刘伟 , 刘毅 , 林瑞庆 , 等 . 日本血吸虫线粒体 nad4 基因部分
序列的多态性研究 . 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 , 2008, 26
（2）: 152-153.
（责任编辑 马鑫）
基因区域
种内差异（%）
种间差异（%）
AT 含量（%） 种内变异碱基个数（个） 种间变异碱基
个数（个）T. suis T. skr T. suis T. skr T. suis T. skr
pnad4 0.2-0.9 0.2-0.4 45.1-45.9 72.6 67.5 4 2 162
pcox1 0.5-1.0 0.7-1.2 44.1-45.4 65.5 61.9 7 5 156
表 1 鞭虫线粒体 pnad4和 pcox1基因片段核苷酸种内和种间差异性比较
节点处数据由左到右依次为 NJ、ME、MP 的 Bootstrap 值（%）
图 5 基于 pnad4基因序列的系统进化分析
图 6 基于 pcox1基因序列的系统进化分析
节点处数据由左到右依次为 NJ、ME、MP 的 Bootstrap 值（%）