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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):193-199
因生理发育尚未成熟，幼龄畜禽消化能力弱，
消化吸收饲料中营养成分能力低，从而影响生长［1］。
饲料中添加外源酶可有效解决该问题。水解酶是催
化水解反应酶的总称，是提高饲料消化率和利用率
的重要酶之一［2］。如饲料中添加脂肪酶可促进脂肪
的消化，释放出更多中链脂肪酸，还可促进脂溶性
维生素等的吸收，提高饲料转化率［3］。除脂肪酶外，
蛋白水解酶也可用作饲料添加剂，可催化多肽或蛋
白质的水解，释放氨基酸，提高饲料中蛋白的消化
吸收率，促进畜禽生长［4］。羧肽酶（Carboxypeptid-
ases，CPs）是蛋白水解酶类，能从肽链的 C 端逐个
降解、释放游离氨基酸［5］。将其添加在饲料中，能
提高牲畜消化能力。但因 CPs 在动物胃中的酸性环
境及内源消化酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）环境中存
留时间较长，其稳定性受到较大影响［6，7］。虽可使
用适当的稳定剂降低这种影响，但有时因加工时间
过长、温度过高仍会严重破坏其催化活性［8］。
为了满足 CPs 不断发展的应用需求，对于 CPs
特性提出更高的要求，尤其是耐酸性、抗蛋白酶特
性。此特性可使 CPs 在无稳定剂保护下顺利通过胃
收到日期 ：2014-12-17
基金项目 ：国家“863”计划项目（2013AA102803）
作者简介 ：冯士元，硕士研究生，研究方向 ：微生物与生化药学 ；E-mail ：tianjinfsy123@163.com
通讯作者 ：路福平，教授，博士生导师，研究方向 ：微生物与分子生物学 ；E-mail ：lfp@tust.edu.cn
猪胰脏羧肽酶转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性研究
冯士元  孙同韦  牟慧艳  张会图  路福平
（天津市工业微生物重点实验室 工业发酵微生物教育部重点实验室 天津科技大学生物工程学院，天津 300457）
摘 要 ： 羧肽酶（carboxypeptidase）是一类可水解肽链 C 末端氨基酸残基的蛋白酶，可用作饲料添加剂，促进畜禽生长。
猪胰脏中含有一种羧肽酶 A1（CPA1），该酶除能水解蛋白质外，还能分解油脂。CPA1 在以酪蛋白和橄榄油为底物时，比活力分
别为 53.14 U/mg 和 22.4 U/mg ；经过 pH2.0 酸性环境和胰蛋白酶处理后，其酶活残留率分别为 95.65% 和 78.14%。结果表明，CPA1
具有转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性。
关键词 ： 羧肽酶 A1 ；转酯功能 ；耐酸抗蛋白酶
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.028
A Study on Transesterification and Acid-resistant Antiprotease of
Carboxypeptidase in Porcine Pancreas
Feng Shiyuan Sun Tongwei Mou Huiyan Zhang Huitu Lu Fuping
（Tianjinn Key Laboratory of Industrial Microbiology，Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology Ministry of Education，College of
Biotechnology，Tianjin University of Science ＆ Technology，Tianjin 300457）
Abstract ： Carboxypeptidase is a kind of protease that cleaves the peptide bond of an amino acid residue at the C-terminal end. It can be
used in feed additives, and promotes the growth of livestock and poultry. A carboxypeptidase A1（CPA1）was obtained from porcine pancreas,
and it can hydrolyze proteins and decompose oils. It showed the specific activity as 53.14 U/mg and 22.4 U/mg when casein and olive oil used as
substrate, respectively. The CPA1’s relative activity reached 95.65% and 78.14% respectively after the treatment of pH2.0 acidic and trypsin.
The results indicate that the CPA1 has the function of transesterification and the feature of distinct acid-resistant antiprotease.
Key words ： carboxypeptidase A1 ；function of transesterification ；acid-resistant antiprotease
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8194
部酸性环境，避免因加工对其活性的破坏。因此，
获得具有耐酸、抗蛋白酶特性的 CPs 是目前的研究
热点之一。CPs 主要来源于微生物、植物和哺乳动
物［9］。哺乳动物来源 CPs 由胰腺分泌至消化道后，
经酸性食糜浸泡和内源消化酶降解后仍可帮助消化
食物，具有催化活性［10］，所以推测其具有耐酸、抗
蛋白酶特性。有关耐酸抗蛋白酶特性检测的报道较
多，如可利用模拟胃肠道模型［11］，筛选具备耐酸、
抗蛋白酶特性的木聚糖产生菌 ；采用人体胃肠道模
型检测微生态菌株 Lactobacillus acidophilus 对胃酸和
蛋白酶的抗逆能力［12］。哺乳幼崽消化器官不发达，
消化机能不完善，如仔猪出生时胃内仅有凝乳酶，
胃蛋白酶很少，且因胃底腺部缺乏游离盐酸，胃蛋
白酶基本没有活性，而肠腺和胰腺发育较完善，胰
蛋白酶活性较高［1］。哺乳动物胰脏中富含 CPs，且
有关来源于猪胰腺中 CPs 的报道较多。如赵莹［14］
从猪胰脏中获得羧肽酶 A，并将其基因在毕赤酵母
中进行了外源表达 ；王福清等［15］报道了猪胰羧肽
酶 B 的提取工艺和该酶的稳定性。
有报道称，羧肽酶 A1（CPA1）具备耐酸抗蛋
白酶特性。此外，该酶除能够水解蛋白质外，还能
水解油脂，具备转酯功能。在以橄榄油为底物时，
CPA1 能催化油脂分解成游离脂肪酸。此功能使其催
化底物范围明显大于只有单一催化活性的 CPs。作
为一种高效生物催化剂，酶具有专一性，不同的底
物需要不同的酶催化分解。因饲料中含有多种营养
成分，使用单一酶制剂难以达到理想的效果［16］。解
决该问题方法较多，其中一种是获得具有多功能催
化特性的酶制剂。在酸性环境下，丝氨酸羧肽酶
具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性［19］。
CPA1 属于金属羧肽酶家族，CPA1 具有多功能催化
活性，且还具有耐酸抗蛋白酶特性，添加在饲料中
能加快营养物质的消化、吸收利用，降低饲养成本。
并有报道称猪 CPA1 基因已能在毕赤酵母表达，这为
猪 CPA1 的大规模生产奠定了基础［14］。针对此特点，
结合模拟胃肠道模型的方法，本实验采用 pH2.0 缓
冲液模拟畜禽胃酸环境，40 U/mL 胰蛋白酶模拟肠道
内源消化酶环境［13］，分别检测 CPs 的耐酸、抗蛋白
酶特性。并对该酶水解蛋白特性和转酯功能特性进
行较为细致的研究，对其耐酸抗蛋白酶特性进行研
究，以期为今后该酶进一步研究和使用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 羧肽酶粗酶液的制备 取成年家猪新鲜胰
脏 500 g， 搅 肉 机 搅 碎， 与 2-3 倍 体 积 pH7.0、50
mmol/L 磷酸盐缓冲液混合，高速组织捣碎机中打碎，
离心去残渣，取上清粗酶液 4℃保存。
1.1.2 试剂与仪器 实验中所用 p-Nitrophenyl acet-
ate、p-Nitrophenyl butyrate、p-Nitrophenyl decanoate、
p-Nitrophenyl myristate、p-Nitrophenyl palmitate 购
自 Sigma-Aldrich。 猪 胰 蛋 白 酶 购 自 生 物 工 程（ 上
海）股份有限公司。其余试剂均为国产或进口分析
纯。AKTA purifier 购自通用电气医疗集团。HiTrap
Q HP，5Í5 mL 购自 GE Healthcare Life Sciences。
1.1.3 溶 液 0.2 mol/L Na2HPO4（ 甲 液 ）：称 取
Na2HPO4 28.4 g，用蒸馏水溶解并定容至 1 000 mL。
0.2 mol/L NaH2PO4（乙液）：称取 NaH2PO4 24 g，
用蒸馏水溶解并定容至 1 000 mL。
50 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.0）：吸取甲液
81 mL，乙液 19 mL，即成为 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液。
使用时用 ddH2O 稀释 4 倍，即成为 50 mmol/L 磷酸
盐缓冲液，校正 pH 值为 7.0。
20 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.0）：吸取甲液
81 mL，乙液 19 mL，即成为 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液。
使用时用 ddH2O 稀释 10 倍，即成为 20 mmol/L 磷酸
盐缓冲液，校正 pH 值为 7.0。
1 mol/L NaCl 溶液 ：称取 58.5 g NaCl，加水 800
mL，至全部溶解，定容至 1 000 mL。
底物 pNPB 溶液 ：取 pNPB 溶解于 10 mL 异丙醇
中，配置成 3 mg/mL 底物溶液。4℃保存。
2% 聚乙烯醇溶液 ：称取 20 g 聚乙烯醇，加水
900 mL，沸水中加热搅拌，直至全部溶解，冷却后
定容至 1 000 mL。
橄榄油乳化液 ：取橄榄油与 2% 聚乙烯醇溶液
以 1∶3 的比例混合，高速组织匀浆机 10 000 r/min
乳化 6 min，分 3 次进行。
1.2 方法
1.2.1 羧肽酶活性的测定
1.2.1.1 Folin 显 色 法 取 1 mL 适 当 稀 释 的 酶 液，
2015,31(8) 195冯士元等：猪胰脏羧肽酶转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性研究
37℃水浴预热 1 min，加入 1 mL 1% 酪蛋白溶液，
37℃水浴保温 10 min，迅速加入 2 mL 0.4 mol/L 三氯
乙酸终止反应，室温静置 15 min，10 000 r/min 离心
10 min，取上清 1 mL，置于试管中，加入 5 mL 0.4
mol/L Na2CO3 溶液及 1 mL 福林酚工作液，测定 680
nm 吸光度。对照在加入酪蛋白溶液前先加入三氯乙
酸，其余条件相同。将每分钟水解酪蛋白释放 1 μg
酪氨酸的酶量定义为一个蛋白酶活力单位［17］。
1.2.1.2 橄榄油滴定法 取 4 mL 橄榄油乳化液加入
到 5 mL 50 mmol/L 的磷酸盐缓冲液中（pH7.0），并
加入 1 mL 适当稀释的酶液，在 37℃，100 r/min 震
荡条件下反应 15 min，加入 10 mL 95% 乙醇终止反
应。 用 0.05 mol/L NaOH 滴 定 样 品 生 成 的 脂 肪 酸，
计算消耗 NaOH 的量。酶活单位的定义 ：在 37℃，
pH7.0 的条件下，样品水解油脂每分钟释放 1 μmol
游离脂肪酸所需的酶量为一个活力单位（U）。
1.2.1.3 分光光度法 将 pNPB 溶液与 50 mmol/L 磷
酸盐缓冲液（pH7.0）以 1∶9 混合，吸取 2.7 mL 上
述混合液，加入 300 μL 适当稀释过的酶液，37℃反
应 15 min，用 3 mL 95% 乙醇终止反应，在 410 nm
波长处测定样品溶液的吸光值。酶活单位的定义 ：
在 37℃，pH7.0 的条件下，样品水解 4- 硝基苯丁酸
酯（pNPB）每分钟释放 1 μmol 对硝基苯酚（pNP）
所需的酶量为一个酶活力单位（U）。
1.2.2 蛋 白 浓 度 测 定 蛋 白 质 浓 度 的 测 定 采 用
Bradford 法［18］，以牛血清白蛋白为标准蛋白。
1.2.3 离子交换层析 使用 20 mmol/L 磷酸盐缓冲
液（pH7.0）平衡 HiTrap Q 柱，排除气泡，在恒定
低温操作下，适当稀释的粗酶液以恒定流速通过蠕
动泵流过层析柱，后利用 1 mol/L 的 NaCl 溶液进行
梯度洗脱，收集洗脱样品，测定酶活和蛋白质浓度。
1.2.4 羧肽酶水解蛋白特性的检测
1.2.4.1 最适反应 pH 使用 pH6.0-12.0 50 mmol/L
的 缓 冲 液（pH6.0-8.0 NaH2PO4/Na2HPO4 缓 冲 液、
pH9.0-12.0 硼酸 - 硼酸钠缓冲液）配置 1% 酪蛋白
溶液，按照 Folin 显色法测定 CPA1 的残余活力。以
残余酶活最大值 pH 下的酶活力为 100%，计算其他
pH 条件下的相对活力。
1.2.4.2 pH 稳 定 性 利 用 pH2.0-8.0 的 缓 冲 液
（pH2.0-3.0 甘氨酸 -HCl 缓冲液、pH4.0-5.0 乙酸 -
乙 酸 钠 缓 冲 液、pH6.0-8.0 NaH2PO4/Na2HPO4 缓 冲
液）0℃下处理酶液 1 h，在最适温度和 pH 下，按
照 Folin 显色法测定酶活，以残余酶活最大值 pH 下
的酶活力为 100%，计算其他 pH 值下的相对活力。
1.2.4.3 最适反应温度 将 CPA1 酶液在最适 pH、
不同温度下（10℃-70℃）反应，采用 Folin 显色法
测定其最适反应温度。将酶活最高值温度下的酶活
力为 100%，计算其他温度下酶的相对活力。
1.2.4.4 热稳定性 将 CPA1 酶液分别在 30℃-80℃
保温 1 h，在最适温度和 pH 条件下，Folin 显色法测
定残余酶活力以分析其温度稳定性。以 0℃保温的
CPA1 酶活力为 100%，计算不同温度下的相对活力。
1.2.5 羧肽酶转酯功能特性的检测
1.2.5.1 底物特异性的测定 分别将不同碳链的脂
肪酸酯（p-Nitrophenyl acetate、p-Nitrophenyl butyrate、
p-Nitrophenyl decanoate、p-Nitrophenyl myristate、
p-Nitrophenyl palmitate）溶解于异丙醇，均配制成 3
mg/mL 底物溶液。在 37℃，pH7.0，50 mmol/L 磷酸
盐缓冲液中分别测定 CPA1 在这 5 种底物下的活性。
以测定活性最大值底物下的酶活力为 100%，计算其
他底物下酶的相对活力。
1.2.5.2 最适反应 pH 在 pH2.0-8.0 50 mmol/L 的缓
冲液（配置同“1.2.4.2”）中，利用分光光度法测定
CPA1 的残余活力。以残余酶活最大值 pH 下的酶活
力为 100%，计算其他 pH 条件下的相对活力。
1.2.5.3 pH 稳定性 利用 pH2.0-8.0 的缓冲液 0℃
处理酶液 1 h，在最适温度和 pH 下，利用分光光度
法测定酶活，以残余酶活最大值 pH 下的酶活力为
100%，计算其他 pH 值下的相对活力。
1.2.5.4 最适反应温度 将 CPA1 酶液在最适 pH、
不同温度下（10℃-70℃）反应，采用分光光度法测
定其最适反应温度。将酶活最高值温度下的酶活力
为 100%，计算其他温度下酶的相对活力。
1.2.5.5 热稳定性 将 CPA1 酶液分别在 30℃-80℃
保温 1 h，最适温度和 pH 条件下用分光光度法测定
残余酶活力分析其温度稳定性。以 0℃保温的 CPA1
酶活力为 100%，计算不同温度处理后的相对活力。
1.2.5.6 动力学参数测定 用不同浓度的 p-Nitrophe-
nyl butyrate（0.5-8 mmol/L）为底物，采用分光光度
法 测 酶 活 性， 根 据 米 氏 方 程 V=Vmax×［S］/（Km+
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8196
［S］），用双倒数法作图。即以酶促反应的倒数 1/V
对底物浓度的倒数 1/［S］做一直线，根据其斜率及
截距计算 Km、Vmax 和 Vcat。
1.2.6 羧肽酶耐酸抗蛋白酶特性检测
1.2.6.1 耐酸性检测 将适当稀释的 CPA1 酶液在
pH2.0 甘氨酸 - 盐酸缓冲液中，37℃保温 1 h，以
1∶4 的比例将混合液与 pH7.0 的磷酸盐缓冲液混合，
37℃保温 20 min，采用分光光度法测定其活性。对
照以 pH7.0 的磷酸盐缓冲液代替 pH2.0 甘氨酸 - 盐
酸缓冲液，其他条件相同，设定对照活性为 100%，
计算样品相对活性。
1.2.6.2 抗蛋白酶特性检测 将适当稀释 CPA1 酶液
在 pH7.0 的磷酸盐缓冲液中，37℃保温 1 h，以 1∶4
的比例将混合液与含胰蛋白酶 40 U/mL，pH7.0 的磷
酸盐缓冲液混合，37℃保温 20 min，采用分光光度
法测定其活性。对照未经胰蛋白酶处理，其他条件
相同，设定对照活性为 100%，计算样品相对活性。
同时另取适当稀释的 CPA1 酶液分别在含有 0、10、
20、30、40、50、60、70 和 80 U/mL 的胰蛋白酶的
pH7.0 磷酸盐缓冲液中，37℃热处理 60 min，将混
合液进行 SDS-PAGE 蛋白电泳分析，观察条带的变
化，以未经胰蛋白酶处理的 CPA1 酶样作为对照。
2 结果
2.1 猪胰腺羧肽酶A1的分离纯化
经过离子交换层析条件优化，结合橄榄油滴定
法确定 30% 盐（1 mol/L NaCl 溶液）梯度洗脱样品
具有活性（Peak2），直接经过磷酸盐缓冲液冲洗下
来的蛋白杂峰（Peak1）和 60% 及 100% 高盐梯度
洗脱下来的蛋白杂峰（Peak3 和 Peak4）均不含活性
（图 1）。收集 Hitrap Q 阴离子交换柱纯化有活性样品，
经 SDS-PAGE 分析，结果为单一蛋白条带，其表观
分子量为（34±1）kD（图 2）。综合其活性及蛋白
浓度测定结果得知其比活力为 22.4 U/mg。对其进行
质谱分析，并与 NCBI 蛋白数据库进行比对，结果（图
3）显示其与猪胰腺 CPA1 相似性最高。
2.2 CPA1催化特性
2.2.1 CPA1 双功能催化活性 CPA1 除能够水解酪
蛋白外，还能水解橄榄油中的油脂。CPA1 在以酪蛋
白和橄榄油为底物时，比活力分别为 53.14 U/mg 和
22.4 U/mg。说明 CPA1 除具有蛋白酶活性外，还具
有转酯功能。但橄榄油成分复杂，含有多种碳链脂
肪酸甘油酯。脂肪酶和酯酶均可催化转酯反应。酯
酶催化水解短碳链的酯类（C<10）；脂肪酶能够水
解长碳链的酯类（C>10）［19］。为探究 CPA1 转酯活
性底物特异性，本研究以含不同碳链脂肪酸酯为底
物对其鉴定。结果（图 4）显示，CPA1 对碳链长
度小于 10 的脂肪酸酯的催化活性高于碳链长度大
于 10 的，且在以 4-硝基苯丁酸酯（C4）为底物的
1500
UV Cond% ConcmAU
mL
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
400
500
300
200
100
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
Peak 4
Peak 3
Peak 2
Peak 1
图 1 离子交换层析
100
kD
M 1 2
70
55
40
35
25
15
M ：蛋白 Marker ；1 ：CPA1 粗酶液 ；2 ：30% 盐梯度洗脱样品
图 2 粗酶液和纯化后酶液的 SDS-PAGE 分析
红色加粗部分为与猪胰腺 CPA1 匹配的氨基酸序列
图 3 质谱分析比对结果
1
41
81
121
161
201
241
281
321
361
401
2015,31(8) 197冯士元等：猪胰脏羧肽酶转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性研究
情况下，CPA1 的活性明显高于其他碳链作为底物时
CPA1 的活性，表明 CPA1 转酯活性催化底物种类
与酯酶相近。测定了 CPA1 以 p-Nitrophenyl butyrate
为 底 物 时 的 动 力 学 参 数， 结 果 表 明，Km=5.075
μmol/mL，Vmax=0.0134 μmol/mL·min，Kcat=8.25
μmol/mg·min。
120
100
80
60
40⴨ሩ䞦⍫%
20
0
C2 C4 C10ᓅ⢙⻣䬮䮯ᓖ C14 C16
图 4 CPA1 的底物特异性
2.2.2 最 适 反 应 pH CPA1 转 酯 活 性 在 pH2.0-6.0
之间较低，处于缓慢上升趋势，至 pH6.0 时，其活
性仅为最大活性的 20%。CPA1 转酯活性最适反应
pH 为 7.4，而其蛋白酶活性最适反应 pH 为 7.6。但
pH 为 6.0 时，CPA1 蛋白酶活性维持在 70%，结果
高于其转酯活性。pH 继续上升，CPA1 的蛋白酶活
性和转酯活性均下降。但其蛋白酶活性下降缓慢，
至 pH10.0 时，仍有 60% 的活性，而其转酯活性在
pH8.0 时已降至 50%（图 5）。结果表明，CPA1 的蛋
白酶活性和转酯活性最适 pH 大致相同。
2.2.3 pH 稳定性 CPA1 经不同 pH 缓冲液预处理
1 h，结果（图 6）表明，在 pH3.0-7.0 范围内稳定，
酶活力均保持在 90% 以上。pH2.0 的条件下处理 1 h，
CPA1 的酶活力仍大于 75% ；pH8.0 的碱性条件下处
理 1 h，CPA1 的转酯活性和蛋白酶活性均下降，但
其转酯活性下降较快，活性降至 75.7%。结果表明，
CPA1 的 pH 稳定性宽泛，在酸性条件下可稳定存在。
2.2.4 最适反应温度 CPA1 的蛋白酶和转酯活性
的最适反应温度均为 35℃，且二者 10℃-40℃均具
有较高活力（>50%）。温度高于 50℃时，CPA1 蛋
白酶活性下降缓慢，至 70℃时维持在 60% 以上 ；
CPA1 转酯活性开始迅速下降，50℃时降至 14.23%，
至 70℃时仅有 5%。结果（图 7）表明，CPA1 的蛋
120
100
80
60
40⴨ሩ䞦⍫%
20
0
2 43 65
pH
87 10 11 12 139
ԕ䞚㳻ⲭѪᓅ⢙ԕpNPBѪᓅ⢙
图 5 CPA1 最适反应 pH
120
100
80
60
40⴨ሩ䞦⍫%
20
0
2 3 4
pH
5 6 7 8 9
ԕ䞚㳻ⲭѪᓅ⢙ԕpNPBѪᓅ⢙
图 6 CPA1 经不同 pH 缓冲液处理 1 h 后的稳定性
白酶活性和转酯活性最适反应温度相同。相比于蛋
白酶活性，CPA1 转酯活性受温度影响较大。
120
100
80
60
40⴨ሩ䞦⍫%
20
0
10 20 30 ⑙ᓖć
ԕ䞚㳻ⲭѪᓅ⢙ԕpNPBѪᓅ⢙
40 50 60 70 80
图 7 CPA1 最适反应温度
2.2.5 热稳定性 CPA1 经不同温度处理 1 h 后，其
蛋白酶活性稳定，即使是在 80℃下温浴 1 h，其活
性仍保持在 80% 以上。CPA1 转酯活性在 30℃-50℃
之间维持在 80% 以上，但当温度升至 80℃时，酶活
力降至 64.4%。结果（图 8）表明，CPA1 蛋白酶活
性和转酯活性均具有较高的热稳定性，但相比于蛋
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8198 ԕ䞚㳻ⲭѪᓅ⢙ԕpNPBѪᓅ⢙120
100
80
60
40⴨ሩ䞦⍫%
20
0
30 40 50⑙ᓖć60 70 80
图 8 CPA1 在不同温度下保温 1 h 后的热稳定性
白酶活性，CPA1 转酯活性热稳定性较差。
2.3 CPA1耐酸抗蛋白酶特性
模拟食糜在胃肠道消化，CPA1 经 pH2.0 酸性环
境处理 1 h（不添加胰蛋白酶），活性残留 95.65% ；
用 pH7.0 磷酸盐缓冲液模拟肠道中性环境，添加
胰 蛋 白 酶 40 U/mL 处 理 20 min，CPA1 活 性 降 至
78.14%。结果表明，CPA1 的耐酸性较强，对胰蛋
白酶存在抵抗能力。为检验 CPA1 的稳定性，采用
不同活性胰蛋白酶（0、10、20、30、40、50、60、
70 和 80 U/mL），并对其进行 1 h 处理。将处理后的
样品进行 SDS-PAGE 分析，在（34±1）kD 处均检
测到蛋白条带，且条带亮度基本一致（图 9），表明
CPA1 可抵抗较宽范围活性的胰蛋白酶。此特性为
CPA1 在肠道内发挥作用提供了保障。
100
kD
M 1 02345678
75
63
48
35
25
135
M ：蛋白 Marker ；0-8 ：胰蛋白酶活性依次为 0、10、20、30、40、50、60、
70 和 80 U/mL
图 9 CPA1 经不同活性胰蛋白酶处理后的 SDS-PAGE 分析
和内源消化酶敏感，而 CPs 发挥作用的前提是必须
有一定活力的酶能够达到其在消化道中的作用部位，
在胃中强酸环境下保持活力且不被蛋白酶所破坏。
因此 CPs 在酸性和内源性消化酶环境中的稳定性一
直是影响其实际应用的限制因素。哺乳动物消化道
内 CPs 经过酸性环境浸泡和消化酶降解，仍可帮助
消化食物，具有催化活性［10］，是很好的耐酸抗蛋白
酶 CPs 来源。研究表明，酶催化活性与其结构和构
象相关，蛋白质从无规则卷曲折叠成特定的功能型
三维结构［20］，获得其催化活性。本实验从猪胰脏中
分离得到了一种 CPA1，耐酸特性检测结果显示，经
pH2.0 酸性环境处理后，活性残留 95.65% ；CPA1 转
酯活性 pH 稳定性结果显示，CPA1 经 pH2.0 缓冲液
处理 1 h，酶活为 78.7%。CPA1 转酯活性在 30℃-
40℃具有较高的热稳定性，酶活维持在 95% 以上，
同时以未经热处理的 CPA1 的活性为 100%（0℃保
存），所以 CPA1 经 0℃和 35℃处理后，其活性差别
较小，可忽略。因此，CPA1 经强酸环境处理后结果
的不同与中性环境保温处理有关，CPA1 活性经强酸
处理后造成的损失可在中性环境中重新获得。因此
推测 pH 的变化导致 CPA1 结构和构象的变化，进而
导致其催化活性的变化。同时 CPA1 最适反应 pH 结
果显示，其在 pH2.0-6.0 的酸性环境中基本无活性，
直至 pH7.0 时，CPA1 活性迅速由 pH2.0 的 18.6% 上
升至 93.73%。因此可进一步推测 CPA1 经酸性环境
处理时，其三级结构解体，导致该酶基本失去活性。
该酶被转移至中性环境后，CPA1 迅速从无规则卷曲
折叠转换成原本功能性立体结构，因此重新获得其
催化活性。要确定推测是否正确，下一步需对 CPA1
采用不同 pH 缓冲液处理，并借助荧光光谱法等技
术检测 CPA1 蛋白结构和构象［21］，验证此推断是否
正确。
该酶除具有耐酸抗蛋白酶特性外，还具备双功
能催化特性。CPA1 除能够水解蛋白质外还能够水
解油脂，具备转酯功能。CPA1 属于金属羧肽酶家
族，CPA1 的催化需要 Zn2+ 的参与。Zn2+ 被包围在
His69、His196、Glu72 和水分子组成的四面体结构中，
形成 CPA1 催化活性中心。CPA 水解肽键时，水分
子被 Zn2+ 极化，在与 Glu270 的共同作用下攻击多肽
链上易切开的碳原子［22］。因 CPA1 同时具备蛋白酶
3 讨论
CPs 能分解蛋白质，释放游离氨基酸，因此在
饲料中得到广泛应用，获得性能优良的 CPs 具有重
要的经济和社会效益。目前，多数 CPs 对酸性环境
2015,31(8) 199冯士元等：猪胰脏羧肽酶转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性研究
活性和转酯功能，所以推测该酶催化活性中心也可
作用于酯键，催化酯类物质的水解。下一步实验应
验证 CPA1 转酯能力催化原理推测结果。研究方法
较多，如使用二胺四乙酸（EDTA）、苯甲基磺酰氟
（PMSF）、β-巯基乙醇等蛋白酶抑制剂对 CPA1 进行
处理，观察其转酯活性的变化，从而判断 CPA1 催
化转酯反应的活性中心结构。
本实验从家猪胰脏中获得 CPA1，该酶既具有
多功能催化特性，还具有较强的耐酸抗蛋白酶特性。
猪在中国分布较为广泛，品种也多种多样，如民猪、
陆川猪和宁乡猪等［23］。对动物源 CPs 的研究，除猪
外，还有牛和鼠等［9］。因哺乳动物消化食物过程较
为相似，推测其他来源 CPs 同样具备耐酸抗蛋白酶
等优良特性，需进一步研究。
4 结论
CPA1 既能水解蛋白质，也可水解油脂 ；具有
较高的耐酸抗蛋白酶特性和较高的热稳定性。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）