全 文 ：盆物杖术通报
· 研究报告 · 年增刊
麦芽根中 ’·磷酸二醋酶和 ‘一磷酸单醋酶的提取
张群 丁庆豹 欧伶 夏林根
华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 , 上海
摘 要 建立一种高效快速的从麦芽根中提取 ’一磷酸二醋酶和磷酸单醋酶的方法 。 通过将麦芽根粉碎后 ,
取一定粒度的麦芽根加一定量的去离子水浸泡 , 过滤后得粗酶液 。 用紫外分光光度法测定 ’一磷酸二醋酶和 ‘一磷
酸单醋酶的酶活 , 研究粉碎粒度 、料液比 、抽提温度 、抽提时间等因素对麦芽根中 ‘一磷酸二醋酶和 ‘一磷酸单醋酶提
取的影响 。 将原料粉碎至 目 , 以去离子水为提取剂 , 于 ℃提取 , 料液质量比为 , ‘一磷酸二醋酶的酶活
力可达 。 该 法简单 、快速 、准确 、适应性强 , 为 ’一磷酸二醋酶的提取与检测提供 了有效的工具 。
关键词 麦芽根 气磷酸二醋酶 气磷酸单醋酶 提取 检测
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2 0 ℃ fo r 20 hou rs , t h e w e i g h t ra t e o f s o l u t i o n t o s o l i d l : 1 0 . T h e e n z y m e a e t i v i t y o b t a i n e d w a s 1 6 0
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自从上世纪 60 年代 日本将桔青霉产生的核酸
酶 Pl 应用于工业化酶解 R N A 来生产呈味核昔酸 ,
国内外都是用桔青霉发酵法生产核酸酶 Pl 工业化
生产 5’一核昔酸的[’〕。 但桔青霉发酵制备的酶液中
含有 5 ‘一磷酸单醋酶 、 3 ’一磷酸单醋酶等杂酶 , 且生产
过程复杂 , 环境污染大 , 成本较高。 麦芽根是啤酒工
业生产过程中的副产物 , 其数量约占大麦总投量的
3% , 在这些麦芽根中含有丰富的 5 ’一磷酸二醋酶 , 因
此 , 可以从麦芽根中提取 5 ‘一磷酸二醋酶 , 该方法简
单易行 , 且能增加麦芽根的附加值 , 提高经济效益 ;
同时 , 也可以减少桔青霉发酵废液排放 , 对于环境保
护和降低生产成本都是很有意义的[’一 8〕。 本文主要
研究了各种因素对麦芽根中5 ’一磷酸二醋酶和 5 ‘一磷
酸单酉旨酶提取的影响 。
1 材料与方法
1.1 材料 、试剂及仪器
麦芽根 , 啤酒厂废料 。
醋酸钠 、醋酸 、 铝酸铁 、高氯酸 、硫酸锌 , 均为国
产 A R 级 。 对硝基酚磷酸二钠(p 一N P P ) , 进 口分装 。
超级恒温器 , 上海实验仪器厂 ;紫外可见光分光光度
计 , 上海分析仪器总厂 。
作者简介:张群(19 83 一 ) , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 :酶工程 ,核酸药物等
通讯作者:丁庆豹 , 手机 :138 170704 95 , E 一m ai l : q b d i n g @ e e u s t . e d u . e n
年增刊 张群等:麦芽根中5’一磷酸二醋酶和 5 ’一磷酸单醋酶的提取 3 79
1.2 方法
1.2 .1 麦芽根抽提液制备[’] 称取新鲜 、干燥的
麦芽根 109 ,加入 ro oml 去离子水 , 搅拌均匀置 4℃
冰箱约20 h , 粉碎机粉碎后 , 用滤布挤出浸汁 , 滤液
置于4℃冰箱中保存作为试验用酶液 。
1
.
2
.
2 分析方法
1.2.2.1 5 ‘一磷酸二醋酶酶活力测定采用紫外分光
光度法【’〕;
1 . 2 . 2 . 2 5 ‘一磷酸单醋酶活力测定方法 : 以对硝
基酚磷酸二钠为底物 , 根据水解磷酸醋键所产生的
对硝基酚量测定酶活力 。 对硝基酚在强碱条件下呈
现醒式结构而呈现亮黄色 , 在 405 nm 处有强烈吸收
峰 , 而底物没有这种特征 。 具体测定步骤如下 。
取 0.6m l0.02 m 0F L 的对硝基酚磷酸二钠(p-
N PP ) , 1 . s m l , P H 1 0 . 0 、 0 . l m o F L N a Z C O 3 一N a H C 0 3
的底物缓冲液 , 混匀 , 在水浴 37 ℃预热 sm in , 加人
0.3耐 酶液 , 立即混匀后 , 37 ℃保温反应 20 m in 。 立
即加人 l.4m l o.sm oF L N aO H 溶液 , 停止酶反应 。
然后于 405 nm 处测定吸收值。 空白对照加人 N aO H
后再加酶液 。
计算酶活力单位条件下酶活力定义 :在 37 ℃ 、
p H ro
.
0 条件下 , 每分钟转化产生 1林m 0F L 的对硝
基酚的酶量为 1个酶活力单位。 已知对硝基酚的摩
尔消化系数 E :E。。 1。二 二 1 5 . 5 x 1 0 ,
麦芽根为抽提的原料 。
表 1 粉碎粒度对酶提取的影响
粉碎粒度 酶活力/(
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一 ’) 活力比5’一磷酸二醋酶 5 ’一磷酸单醋酶
6o90l6
未粉碎
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.
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.
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2 5
.
4
注:加水比 , 麦芽根 (w ) :水(w ) 二 l : 10 , p H = 5 . 5 ,抽提温度4℃ 。
活力比为5 ’一磷酸二醋酶比 5 ‘一磷酸单醋酶
酶活力 (单位 / 毫升) △0
.D x a x 3. 8 x 106
￡ x 0 3 x 2 0
△0 . D x a x 33.688 ( l )
a—酶液测定活力前预先稀释倍数 。 本实验中a= 3 。
2 结果与分析
2.1 麦芽根粉碎拉度对酶提取的影响
分别取不同粒度的麦芽根粉末按 1 :ro (w/ w )
加水浸取 20 h , 过滤后 , 测酶活 , 测定结果如表 1。
从表 1 可以看出:麦芽根粉碎粒度越细 , 酶活越
高 。 这主要是因为 :(l) 粉碎能破坏麦芽根的组织
结构 , 从而大大增加了麦芽根的比表面积 ,使麦芽根
与抽体液充分接触 , 有利于 麦芽根的物质溶出 。
( 2 ) 粉碎能部分破坏麦芽根细胞壁 和细胞膜的结
构 , 在麦芽根被抽体液抽提时细胞中物质溶出更加
容易。 在以后的实验中均采用粉碎程度为 10 目的
2.2 料液比对酶提取的影响
取 100 目的麦芽根 59 , 分别加人 35m l、 4 o ln 、
4 5 m l
、
5 0 Inl
、
5 5 ITil
、
6 0 Inl
、
6 5 ml 去离子水 , 浸取 ZOh , 过
滤后 , 测酶活 , 测定结果如图 1 。
结果如图 1 一 2 :随着加水比的增大 , 抽提酶液
中5 ‘一磷酸二醋酶的活力和 5 ’一磷酸二醋酶的总活力
都逐渐增加 , 加水体积达到 50 间 时 , 抽提酶液中5 ‘-
磷酸二醋酶的酶活和总酶活达到最高 。 加水量再增
大 , 酶活随之降低;而 5 ’一磷酸单醋酶的活力和 5 ’一磷
酸单醋酶的总活力都逐渐降低。
抽提液用量小时 ,抽提液不能完全浸没麦芽根 ,
’导致抽提不彻底 , 酶活 (单位酶活和总酶活 )也就
低;抽体液用量较大时 , 抽提所得的酶液中5 ‘一磷酸
二醋酶被大量稀释 , 单位酶活也就降低 , 这样虽然可
以获得较高的总酶活(即收率有所提高) , 但同时杂
质被抽提出来的也多 , 不仅不利于酶的稳定 、存放和
浓缩 。 所以 , 综合考虑各种因素(总酶活和酶的收
率) , 本实验选用的加水体积为 50 ml 。
2
.
3 抽提温度对酶提取的影响
取 10 目的麦芽根 59 , 加 50 耐 去离子水 , 分别
于 4℃ , 1 5 ℃ , 3 0 ℃ , 4 0 ℃ , 5 0 ℃ , 6 0 ℃ , 7 0 ℃ 浸取 20h ,
过滤 , 测定酶活 。
由图 3 可见 , 浸取时温度升高对酶的提取有利 ,
但温度过高 , 酶活反而下降 , 可能长时间的高温对酶
有所破坏 , 在 40℃ 时 5 ‘一磷酸二醋酶酶活最高;而 5 ’-
磷酸单醋酶酶活随着温度升高 , 活力逐渐降低 。
生物杖术通报 B 勿te chn 口勿舒 B “le 而 2008 年增刊
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加水体积(m L)
图 1 料液比对酶提取的影响
▲一 ’一磷酸二醋酶酶活;. 一 护一磷酸二醋酶总酶活
三姐窿拍、建业即恶鲁攀l、
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加水体积(m L )
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图2 料液比对酶提取的影响
▲一 ’一磷酸单醋酶酶活;. 一 ‘一磷酸单醋酶总酶活
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抽提温度(℃)
图 3 温度对酶提取的影响
▲一 ’一磷酸二醋酶酶活;. 石 ‘一磷酸单醋酶酶活
2 .4 抽提时间对酶提取的影响
2 .4 . 1 4℃最佳抽提时间 在 4℃条件下 , 1 0 目的
麦芽根浸泡不同时间 , 过滤后测定酶活 , 结果如图
4 。
由图 4 可以看出 , 在 4℃ 抽提时存在一个最佳
抽提时间 , 4 ℃的最佳抽提时间为 16 一 20 h 。
2
.
4
.
2 40 ℃最佳抽提时间 在 40 ℃ 条件下 , 1 0 目的
麦芽根浸泡不同时间 , 过滤后测定酶活 ,结果如图 3 。
年增刊 张群等:麦芽根中5’一磷酸二醋酶和5 ’一磷酸单醋酶的提取 3 8 1
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抽提时间(h )
图4 4℃ 时抽提曲线
▲ 一’ 一磷酸二醋酶酶活 ;. 一 ’一磷酸单醋酶酶活
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抽提时问(m in)
图5 40 ℃时抽提曲线
▲一 ’一磷酸二醋酶酶活;. 一 ‘一磷酸单醋酶酶活
由图 5 可以看出 , 4 0 ℃ 的最佳抽提时间为 2 -
3h 。
抽提温度越高 ,其最佳抽提时间越短 , 这在生产
上可以缩短生产时间 , 赢得较高的经济利益 。 然而 ,
抽提温度提高以后 , 抽提过程中会产生酸性物质 , 酶
液有明显的酸味 、 p H 偏低;同时抽提温度提高 , 更适
合微生物生长 , 酶液容易被微生物污染而影响酶液
的质量 ;抽提温度提高以后 , 酶液中产生的杂质含量
也较多 , 会降低产品的纯度 , 而低温抽提不会产生这
些不足 。 综合考虑各种因素 , 采用低温 (4℃ )条件
下浸泡 ZOh 抽提 5 ‘一磷酸二醋酶 。
2
.
5 抽提 pH 对酶提取的影响
取 10 目的麦芽根 59 , 加 lo ml 去离子水 , 在不
同 pH 条件下 (磷酸氢二钠 一 柠檬酸缓冲液 )浸取
20h , 过滤后测酶活 , 测定结果如图 6 。
由图 6 可见 , 在 pH S 一 p H 6 之间 , 5 ’ 一 磷酸二
醋酶酶活相对较高 。 而在提取过程中不加人缓冲
液 , 仅使用去离子水作为提取溶剂 , 所得的酶液的
pH 在 5.5 左右 。 所以 , 在以后实验中不需要添加缓
冲液调节 pH 。
2
.
6 无机盐类对酶抽提的影响
离子浓度会影响酶的溶出 , 在 10 目的麦芽根
抽提液中添加一定浓度的 NaCI、 N a Z S O 4 、 M g C I : 、 M g -
5 0
4 ,
4 ℃条件下浸泡 20h , 过滤后测酶活 , 结果如图 7
一 8 。
生物杖 术通银 B to te ch n ole盯 2008 年增刊
180
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图6 抽提 pH 对酶提取的影响
▲ 一5 ‘一磷酸二醋酶酶活 ;. 石 ’一磷酸单醋酶酶活
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图7 离子浓度对酶提取的影响
一MgCI:(5‘一磷酸二醋酶);一Mgso4(5’一磷酸二醋酶);
▲ 一 M 邪l:(5 ’一磷酸单醋酶);x 一 M g s o 4 (5 ‘一磷酸单醋酶)
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7 0 书
图 8 离子浓度对酶提取的影响
一Nac l( 5’一磷酸二醋酶);一N处 5 0 4 ( 5 ’一磷酸二醋酶);
▲ 一 N a CI ( 5 ’一磷酸单醋酶); x 一 N a Z S o4 ( 5 ‘一磷酸单醋酶)
如图 7 一 8 所示 , 随着离子浓度的提高 , 提取液 的酶活力逐渐升高 , M g S 0 4 的效果最为 明显 , 以
年增刊 张群等:麦芽根中5 ‘一磷酸二醋酶和 5 ’一磷酸单醋酶的提取 383
0.Z m oF L 浓度为最佳 , 但随着离子浓度的进一步提
高 , 酶的活力都有不同程度的降低 。
分析酶液活力值表现较高的原因可能是 :(l)
M g, + 一方面增加了酶分子的溶解度 , 另一方面 ,
M g
, ‘有激活磷酸单醋酶的作用 。 ( 2) 而 Na ‘ 的加人
后 , 酶活力没有太大的提高。 而且盐的加人对设备
要求比较高(有腐蚀性) , 不利于酶的工业化生产和
应用 。
2
.
7 缓冲液对酶提取的影响
在 100 目的麦芽根抽提液中添加一定浓度的柠
檬酸 、柠檬酸一磷酸二氢钠 、醋酸缓冲液〔’〕, 4 ℃条件
下浸泡 20h , 过滤后测酶活 , 结果如图9 、图 10 。
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图 9 缓冲液对 5‘一磷酸二醋酶提取的影响
▲ 一醋酸缓冲液;一柠檬酸缓冲液;一柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液
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图 10 缓冲液对 5’一磷酸单醋酶提取的影响
▲ 一醋酸缓冲液;一柠檬酸缓冲液;一柠檬酸~磷酸氢二钠缓冲液
如图 9 、图 10 所示 , 各种不同种类的缓冲液对
抽提液中5 ’一磷酸二醋酶酶活性的影响有一定的差
异 , 含有柠檬酸盐的缓冲液对 5 ’一磷酸二醋酶的提取
有促进作用 , 而醋酸盐缓冲液对 5 ’一磷酸二醋酶的提
取没有明显增强作用 。
3 讨论
本研究结果表明 , 以麦芽根为原料提取 5 ’一磷酸
二醋酶和 5 ’一磷酸单醋酶 , 其最优方案为:以去离子
水为提取溶剂 , 麦芽根粉碎粒度为 10 0 目或者更细 ,
在 4℃ 下提取 20h , 料液比为 l :10 (w/ w ) , 得到的 5 ‘-
磷酸二醋酶酶活为 16 0U/ml , 5 ‘一磷酸单醋酶酶活
52U/Inl 。
在研究中在测定 5 ’一磷酸二醋酶酶活同时也测
定了5 ‘一磷酸单醋酶酶活 , 但是通过实验发现 , 各种
抽提条件的变化 , 并不能引起 5 ’一磷酸单醋酶酶活有
明显的变化 。 但是生产 5 ’一核昔酸只需要 5 ‘一磷酸二
醋酶 , 所以需要对麦芽根中提取的粗酶液进一步纯
化和处理 , 使其它酶活性降至最低 , 从而提高 RN A
制备 5 ‘一核昔酸的产量 。
参 考 文 献
张树正主编.酶制剂工业【M 〕.北京:科学出版社 , 1 9 8 4 .
( 下转第388 页 )
生物杖术通推 B 勿te ch noto gy B “le 血 2008 年增刊
在 1.50 左右时 , A2 80 增长率在各自工作条件下最
高。
( 2) 正交试验结果表明最佳工作条件为:菌液
OD o 1.9 6 , 工作次数 70 次 , 工作/间歇 5/ 55 , 功率
40 W 。
( 3) 通过经胺氧化酶活性测试 , 证实了通过最
佳条件破碎菌株后 , 能够提取到经胺氧化酶 。
参 考 文 献
1 Kuenen JG , R o b e rt s o n
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o 留 Reviews , 1 9 9 4 , 1 5 :
1 0 9
~
1 1 7
.
2 张光亚 , 陈美慈 , 韩如肠 , 等.微生物学报 , 2 0 3 , 43 ( 2) : 1 56 -
1 6 1
.
3 林燕 ,孔海南 , 何义亮 , 等.环境科学 , 2 0 6 , 2 7 ( 2 ) : 3 24 一 3 28 .
4 H o p e r A B
,
V an
n e
l l i T
,
B
e 铭m an n D J , e t al . A n t o n i e v an Le e u w e n -
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,
1 9 9 7
,
7 1
:
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.
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.
F E B S 玩ters , 1 9 9 3 , 3 3 5 : 2 4 6
~
2 5 0
.
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,
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4 2 1
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o
l
o 群 ,
1 9 9 9
,
3
:
2 0 7
一 2 1 9
.
9 刘国诊.生物工程下游技术.北京:化学工业出版 , 2 (X] 3 , 65 一 73 .
10 郭淑清 , 田锋.山西医科大学学报 , 2 0( X) , 3 1 ( 4 ) : 3 82 一 3 82 .
n 汪家政 , 范明.蛋白质技术手册. 北京:科学出版社 , 2 0( 刃.
12 吴克刚 , 杨连生 , 黄通旺.郑州工程学院学报 , 2 0 1 , 2 2 ( 4 ) : 31 -
3 4
.
( 上接第383 页)
2 丁庆豹 , 邱蔚然主编.核昔酸类产品的生物合成 [M 」.上海:华东
理工大学出版社 , 2 0 6 .
3
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n
t
i
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.
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o u
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re al s
e
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,
1 9 8 7
,
(
5
)
:
1 7 5
一 1 8 7
.
4 李德莹 , 邱蔚然 , 丁庆豹.华东理工大学学报 , 2 0 2 , 28 ( 4 ) : 2 71 -
2 7 4
.
5 B
e n
ai 罗s M D , 助Pez一 S an t i n J , 5 0 1八C . E n zy m e M ie ro b .T eeh n o l , 1 9 8 9 ,
1 1 月闷4 一 4 5 1 .
M as a o F , A k i ra K , H i ro s h i Y
.
A 『 B iol C h e m , 1 9 7 4 , 3 8 ( 9 ) : 1 5 5 5 -
1 5 6 1
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张龙翔.生化实验方法及技术 [M ] .北京:高等教育 出版社 ,
1 9 8 1
.