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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
人源 H5N1禽流感病毒血凝素分子遗传变异特征分析
张继荣
(宁夏医科大学基础学院 ,银川 750004)
　　摘 　要 : 　从 GenBank获取已公布的人及相应国家禽感染的 H5N1禽流感病毒 HA核酸和蛋白序列 ,用生物软件 Clust2
alX1. 83和 MEGA4. 0对 HA基因序列和蛋白分析 ,构建 HA核苷酸遗传进化树。结果表明 , HA蛋白上再次出现既能与人又能
与禽受体特异性结合的 QNG;东南亚和东亚人感染毒株亲缘关系密切 ,西亚、南亚和非洲人感染毒株遗传距离近 ;进化树组成
和 HA蛋白关键位点氨基酸的变异 ,揭示多数国家的人感染的毒株与当地禽感染毒株高度同源 ,具有地域性特征 ,部分国家之
间存在着病毒扩散现象。
关键词 : 　禽流感 H5N1病毒 　血凝素 HA　遗传 　变异
Analysis the Heredity and Variation of
Hemagglutin in Gene from Human H5N1 Virus
Zhang J irong
(N ingxia M edical University B asic M edical Science School, Yinchuan 750004)
　　Abs trac t: 　By retrieving published H5N1 avian influenza virus HA nucleotides and p roteins of human and avian of corresponding
countries, HA gene sequences and p roteins were analyzed and HA nucleotide heritage phylogenetic tree was constructed. The results re2
vealed QNG was capable of specific binding with both human and bird appears again on HA p roteins. V irus strains infected humans in
Southeast A sia and in East A sia respectively have close genetic relationship, and virus strains infected humans in W est A sia, South A sia
and Africa are not distant genetically. Besides, the composition of phylogenetic tree and HA p rotein key sites am ino acids mutations il2
lustrate high level of homology between virus strains infecting humans and local avian in the majority of all countries and regionality,
while virus diffuse between some countries.
Key wo rds: 　Avian influenza virus H5N1 Hemagglutinin (HA) Heredity Variation
收稿日期 : 2009206209
基金项目 :国家科技部“十一五”平台课题 (2006BAD06A01) ,美国 N IH、USDA以及加拿大 IDRC项目部分资助 ;中国科学院三期创新领域前沿
项目 ( KSCX22YW 2N2063)
作者简介 : 张继荣 (19642) ,女 ,副教授 ,研究方向 :人类健康与动物疫病 ; E2mail: zhangjr982@163. com　　禽流感病毒属 A 型流感病毒 (A IV ) ,其中 ,H5N1亚型具高致病性 ,对禽类具很高的致死率 ,现已引起多人感染并死亡事件。H5N1亚型禽流感病毒基因组包括 8个不同片段 ,其中编码血凝素 ( he2magglutinin, HA )的 HA 基因变异率最大 ,可直接改变宿主的特异性 [ 1 ] , HA 蛋白在决定病毒浸染宿主范围、受体结合特性、致病力强弱等方面起着关键作用。通过对 GenBank中已注册的全球范围内人源H5N1禽流感病毒的 HA基因核苷酸和 HA蛋白分子遗传特征进行研究 ,分析人源禽流感病毒 HA基因和蛋白序列变异的特点 ,了解该亚型病毒的分子特征 , 为病毒疫苗制备及人禽流感防控工作提供参考。1 材料与方法登陆美国国立生物技术信息中心 (NCB I) ,查询自 1997年首例人感染 H5N1禽流感病毒事件至今 ,NCB I上已登录的人感染 H5N1禽流感病毒 H5N1病毒 HA 基因序列 ,进行 BLAST在线比对。根据HA核酸相似性选出代表样本 ,包括中国、越南、泰国、老挝、柬埔寨、阿塞拜疆、埃及、土耳其、伊拉克、尼日利亚、印度尼西亚和吉布提人样本 ,并选取相应国家和地区中禽源 HA序列 ,共 45条 HA核苷酸序列。各样本及其登录号如表 1所示。
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
表 1　H5N1亚型禽流感病毒株登录号
登录号 物种 /地点 /时间 登录号 物种 /地点 /时间 登录号 物种 /地点 /时间
NC_007362 A /Gs/Guangdong/1 /96 CY034222 A /duck /V ietnam /367 /05 DQ666146 A /D jibouti/56912/06
AF036356 A /HK/156 /97 DQ497724 A /V ietnam /CL36 /04 EF631186 A / turkey/N igeria /V2/06
EF541401 A /HK/213 /03 DQ497727 A /V ietnam /CL115 /05 EU146920 A /N igeria /6e /07
DQ371928 A /Anhui/1 /05 EU124166 A /duck /V ietnam /T/06 EU146681 A / Indonesia /283H /06
DQ371930 A /Guangxi/1 /05 FJ842481 A /ck /V ietnam /NCVD203 /08 EU146624 A / Indonesia /6 /05
DQ835313 A /China /GD /01 /06 CY029687 A /duck /V ietnam /43 /07 CY019400 A / Indonesia /CD2/07
EU434686 A /J iangsu /1 /07 EU496389 A /Ck /Egyp t/072022NLQP /07 EU124053 A /Ck / Indonesia /W 2/05
CY036197 A / little egret/HK/8550 /07 EU183322 A / turkey/Egyp t/ F2 /06 EU124197 A /Ck / Indonesia /S2/06
CY036269 A /PF /HK/2142 /08 EF535825 A /Egyp t /26202NAMRU3 /07 DQ435201 A /DG/ Iraq /812 /06
DQ885612 A /Thailand /NKNP /05 EU095023 A /Egyp t /29912NAMRU3 /06 DQ435202 A /human / Iraq /2072/06
FJ265577 A /Ck /Thailand /S’/N2/05 FJ226057 A /Egyp t /22892NAMRU3 /08 EU401795 A /Gs/L2PKST/N’/06
EF541410 A /Thailand /SP83 /04 EU496399 A /Ck /Egyp t/088S2NLQP /08 EF456805 A /Cambodia /JP52a /05
EU497921 A /Ck /Thailand / I2/07 EU124185 A /Ck /Laos/Xaythiani232 /06 EF473075 A /Gs/Cambodia /022b /05
EU676307 A /duck / Thailand / IC2/08 AB435522 A /Ck /Laos/1 /08 EU146872 A /Azerbaijan /0082208 /06
EF619982 A /Turkey/12 /06 EU499372 A /Laos/Nong Khai 1 /07 CY034704 A /duck /Laos/P0106 /07
Ck = Chicken; Gs = Goose; CD2= CDC1032T; DG = domestic goose; I2= ICRC2213; IC2= ICRC2V629; L2PKST = Lahore2Pakistan; N2= N IAH6232
0013; N′= NARC23321 /4; PF = peregrine falcon; S’ = Sukhothai; S2= Siak163122; T2= Tien Giang2409; V2= VRD345; W 2= W ates126; 56912=
5691NAMRU3
　　用 ClustalX1183将所选代表样本 HA核酸序列
比对、整理 ,均转换为 FASTA格式。MEGA410对所
选样本 HA核酸和氨基酸序列比对 ,找出序列变异位
点 ,包括碱基的变异和氨基酸的替代。对 HA核酸和
HA蛋白分子关键位点和不同来源序列的变异特点
分析 ,做出所选样本的遗传进化树。使用 Neighbor2
Joining方法 , Bootstrap验证树的可靠性 , rep licates =
1000, model: Kimura 22parameter ( Tamura2Nei) ,并分
析序列的遗传进化关系。
2 结果分析
211　HA受体位点氨基酸特点
宿主细胞 HA受体与禽流感病毒 HA上受体结
合位点的结构是决定流感病毒宿主特异性的关键。
人流感病毒 HA特异性结合宿主细胞受体的唾液酸
α22, 6半乳糖 ( SAa22, 6Gal) ,而禽流感病毒特异性
结合于宿主细胞受体的唾液酸α22, 3半乳糖 ( SAa2
2, 3Gal)。当 HA蛋白上第 226位是谷氨酰胺 ( Gln)
时 ,病毒识别 SAa22, 3Gal,而 226位是亮氨酸 (Leu)
时识别 SAa22, 6Gal。人流感病毒特异性受体结合位
点氨基酸为 LSS,禽流感病毒特异性受体结合位点
氨基酸为 QSG[ 2 ]。在受体特异性结合位点 ,本试验
样本 HK/213 /03和 Turkey/12 /2006为 QNG, Egyp t/
22892/08为 Q IG,其余均为 QGS。
212　影响病毒毒力特征位点氨基酸变化
禽流感病毒 HA蛋白必须裂解为 HA1和 HA2
两部分才具有感染宿主的能力。裂解位点碱性氨基
酸的数量决定宿主细胞内蛋白酶对 HA蛋白裂解的
难易 ,进而影响病毒致病力的强弱 ,高致病性禽流感
病毒 HA裂解位点处有多个碱性氨基酸 [ 3 4 ]。本试
验样本裂解位点附近均有多个碱性氨基酸 ,大多数
为 RRRKKR,但各样本并非一致。我国 2005～2007
年人样本和 Ck /Laos/1 /08、Laos/Nong Khai 1 /07、
Ck /Laos/X2/06、 duck /Laos/P0106 /07、 duck /V iet2
nam /43 /07、 Ck /V ietnam /NCVD203 /08、 PF /HK/
2142 /08和 little egret/HK/8550 /07为 RRRKR;印尼
样本中 Indonesia /283H /2006、Indonesia /CDC1032T/
07和 Ck / Indonesia /S2/06为 SRRKKR ( S为极性氨
基酸 ) , Cambodia /R2/07 和 duck /V ietnam /T2/06 为
GRRKKR ( G为非极性氨基酸 ) ,后 4组较大多数样
本少了一个碱性氨基酸。
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2009年第 11期 张继荣 :人源 H5N1禽流感病毒血凝素分子遗传变异特征分析
HA上潜在的糖基化位点是影响 A IV毒力的可
能因素之一。A IV 分别在 HA 的 27、39、181、209、
302、499和 559位有 7个潜在糖基化位点。本试验
样本中 , HK/156 /97、HK/213 /03、阿塞拜疆、土耳
其、伊拉克、埃及、吉布提和尼日利亚人样本均有此
7 个 位 点 ; Ck /Egyp t/088S2NLQP /08、Ck /Egyp t/
072022/07 和 PF /HK/2142 /08、Ck /V ietnam /NCVD2
03 /08分别缺失 NNT和 NPT; 2005年以后印尼样本
均在 170～172位增加一个糖基化位点 , Indonesia /
283H /06和 Indonesia /CDC1046 /07同时还在 100～
102位增加一个糖基化位点 ; 除 HK/156 /97、Gs/
GD /1 /96、HK /213 /03、Ck /Egyp t/072022/07和 PF /
HK /2142 /08外 ,中国、香港、越南、泰国、老挝和柬
埔寨所有样本也均在 170～172位增加一个糖基
化位点。
213　HA基因遗传进化和同源性分析
使用 MEGA410将 45条样本序列比对 ,并做出
全部序列的系统进化树 ,树形结构如图 1。
图 1　H5N1禽流感病 HA核苷酸遗传进化树
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
　　进化树上显示出东南亚的越南 (2004～2006样
本 )、柬埔寨和泰国样本相聚于同一个亚分支内。
其中 ,越南和柬埔寨人样本核苷酸相似性和氨基酸
相似性分别为 9714% ～9913%和 9816% ～9918% ;
泰国样本与前两者核苷酸和氨基酸相似性为
9812% ～9916%和 9812% ～9915%。而 2007 和
2008年越南样本距离上述样本均很远 ,核苷酸相似
性分别为 9416% ～9612%和 9116% ～9312% ,氨基
酸相似性为 95% ～9613%和 8611% ～9112% ,说明
这两个样本不是上述国内以前的流行毒株。2008
年越南样本与其它国家人和禽样本的核苷酸和氨基
酸相似性也很低 ,为 9116% ～9314%和 8919% ～
9115%。中国人样本和老挝人、家禽样本同处一个
较小的亚分支内 , 核苷酸相似性为 9818% ～
9912% ,氨基酸相似性为 9818% ～9915% ;这两者
与同在该分支的 2007年越南样本核苷酸和氨基酸
相似性为 9719% ～9818%和 97% ～9911% ,揭示
2007年越南样本应来源于中国或者老挝。该分支
中国组样本和香港地区 2007、2008年样本核苷酸和
氨基酸相似性为 9417% ～9618% ,亲缘关系较远。 印尼全部样本处于一个较小的亚分支内 ,各样本 HA基因核苷酸和氨基酸高度相似 ,说明印尼国内流行的毒株类型与其它国家的来源不同。在一个较大分支中包括了西亚的阿塞拜疆、土耳其和伊拉克 ,及南亚的巴基斯坦和非洲的尼日利亚、埃及和吉布提。其中 , 2006～2008年间的埃及和吉布提样本组成一个独立的分支 ,其核苷酸和氨基酸高度相似 ;尼日利亚和埃及、吉布提人样本核苷酸和氨基酸相似性为 9716% ～100%和 9816% ～9918%。非洲与东南亚和东亚国家样本核苷酸和氨基酸相似性低 ,分别为 9112% ～9615%和 9211% ～9518%。土耳其和伊拉克样本同处一个小分支内 ,核苷酸和氨基酸相似性为 9915%和 9913%;阿塞拜疆和巴基斯坦样本同处一个小分支内 ,核苷酸和氨基酸相似性为 9915%和 9911%。西亚、南亚与东南亚和东亚样本核苷酸和氨基酸相似性较低 ,分别为9316%～9618%和 9312% ～9614%。A /Gs/GD /1 /96和 A /HK/156 /97距离各国样本遗传距离均较远。人样本 HA 核苷酸和氨基酸相似性百分比如表 2。
表 2 部分人样本 HA的核苷酸、氨基酸相似性百分数 ( %)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
1 9518 98 9818 9617 9517 9818 99 9612 96 9512 9516 9615 9517 9517 9519 9512 9612 9517 9813 9814
2 9518 9511 9517 9719 9518 9611 96 9819 9518 9512 9811 9818 9519 9517 9518 9511 9612 9811 9512 9511
3 9812 9513 9912 96 9415 9812 9812 9514 9511 9413 9417 9516 9416 9419 9418 9411 95 9419 9717 9912
4 9817 96 9911 9614 9512 99 99 96 9519 9511 9513 9612 9513 9517 9516 9418 9518 9514 9815 9918
5 9619 9715 9619 9711 6917 9618 9619 9812 9615 9517 9717 9815 97 9711 9613 9518 9618 9712 9611 96
6 9517 9514 9417 9516 9518 9514 9516 9612 9512 9415 9515 9614 9819 9512 9513 914 9516 9519 9416 9416
7 9819 96 9814 9913 9711 9516 9915 9614 96 9511 9517 9615 9515 9518 9517 9512 9612 9518 9815 9817
8 9911 9612 9815 9913 9718 96 9613 9613 9611 9514 9517 9616 9517 96 9519 9512 9612 9518 9816 9816
9 96 9819 9512 96 9715 9516 9613 9617 9613 9514 9813 9911 9612 96 96 9517 9615 9813 9516 9516
10 9516 95189 94197 95185 96137 94155 96122 9612 9611 9419 9513 9614 9514 9912 9719 97 9812 9516 9515 9513
11 9419 9513 94 9419 96 9416 9513 9513 9512 9419 9419 9516 9417 9417 9418 9413 9511 9512 9419 9419
12 92 94 9112 92 9316 9018 9212 9213 94 9113 9114 9816 9516 9511 9511 9417 9516 9718 9419 9419
13 9616 9911 9518 9615 9814 9611 9619 9619 9911 9611 96 9417 9616 9612 96 9516 9615 9817 9518 9518
14 9513 9518 9413 9513 9615 9814 9517 9517 9516 9419 9416 9119 9615 9514 9513 9415 9516 9519 9419 9415
15 9515 9516 9417 9516 9611 94176 96 96 9516 9915 9417 9111 9519 9511 9612 9517 9617 9819 9519 95
16 96 9516 9512 9612 9615 95 9615 9615 9517 9816 95135 9111 9613 95 9814 97 9812 9514 9513 9418
17 9318 9317 9312 94 9415 9214 9414 9414 9413 9613 9315 8913 9414 9218 9611 9616 9712 9511 9417 9411
18 9515 9511 9415 9514 9519 9415 9518 9518 9512 9812 9415 90. 6 95. 8 94. 9 98. 1 98. 2 95. 9 96 95. 6 95. 2
19 95. 8 98. 2 95. 3 95. 8 97. 5 95. 8 96. 2 96. 2 98 98. 2 95. 5 93. 6 98. 9 96 95. 1 95. 4 93. 5 95. 2 95. 2 95. 3
20 98. 4 95. 5 98 98. 9 96. 7 95. 3 98. 9 98. 9 95. 6 95. 8 94. 6 91. 6 96. 2 94. 9 95. 6 96. 2 94 96. 5 95. 5 98. 4
21 98. 6 95. 4 99. 1 100 96. 6 95 99. 5 99. 3 95. 7 95 94. 6 90. 4 96. 1 94. 7 95 95 92. 4 94. 7 95. 4 99. 3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
　上三角为氨基酸相似性 ,下三角为核苷酸相似性
　1. Azerbaijan /0082208 /06; 2. Cambodia /JP52a /05; 3. Egyp t/22892NAMRU3 /08; 4. Egyp t/29912NAMRU3 /06; 5. HK/213 /03; 6. HK/156 /97;
7. human / Iraq /2072NAMRU3 /06; 8. Turkey /12 /06; 9. V ietnam /CL115 /05; 10. chicken /Laos/1 /08; 11. Indonesia /CD2/07; 12. Thailand /NKNP /
05; 13. Thailand /SP83 /04; 14. goose /Guangdong/1 /96; 15. J iangsu /1 /07; 16. duck /V ietnam /43 /07; 17. PF /HK/2142 /08; 18. Laos/Nong Khai 1 /
07; 19. duck /Thailand / IC2/08; 20. N igeria /6e /07; 21. D jibouti/5691NAMRU3 /06; Ck. Chicken; Gs. Goose; DG. domestic goose; I. ICRC2213; L2
PKST. Lahore2Pakistan
841
2009年第 11期 张继荣 :人源 H5N1禽流感病毒血凝素分子遗传变异特征分析
3 讨论
有研究发现受体特异性位点突变为 QNG后 ,既
能与 α22, 3半乳糖结合 ,也能与 α22, 6半乳糖结
合 [ 5 ] ,本研究样本中 , A /HK/213 /03 和 A /Turkey/
12 /06受体特异性位点均为 QNG,说明此位点氨基
酸并非保守不变 ,病毒受体结合位点特异性的改变
如果继续发生 ,并达到一定数量时 ,禽源 H5N1将可
能直接引起人禽流感的大爆发。
本研究中 ,我国 2005～2007年人样本和大多数
2007和 2008 年样本裂解位点碱性氨基酸为
RRRKR,印尼样本中多数样本为 SRRKKR, Cambo2
dia /R2/07和 duck /V ietnam /T2/06为 GRRKKR。这
些样本均减少了一个碱性氨基酸 ,这一变化主要发
生在 2007和 2008年样本中 ,这揭示在发生人感染
禽流感 H5N1病毒的国家内 ,在裂解位点减少一个
碱性氨基酸的 HA蛋白的 H5N1病毒可能成为该国
的主流毒株。HA切割位点的结构是影响其裂解难
易的主要原因 ,包括位点处插入碱性氨基酸的数量
和切割位点附近糖基化位点的丢失等 ,都能使 HA
对蛋白酶切割的敏感性增强 ,从而使得病毒的致病
力提高 [ 6, 7 ]。缺少一个碱性氨基酸是否较 RRRKKR
更易于蛋白酶作用和 HA的裂解 ,以及不在裂解位
点附近增加的糖基化位点 ,对病毒毒力的影响还有
待进一步研究。
遗传进化树上表现出位于东南亚的越南、泰国
和柬埔寨样本聚在一个较小的分支内 ,核苷酸和氨
基酸具有高度的相似性 ,说明这 3个相邻国家内发
生的人感染 H5N1病毒来源于相同的病毒祖先。中
国人样本、老挝和 2007年越南样本遗传关系非常
密切 ,且 HA 蛋白关键位点氨基酸残基的变化相
同 ,说明可能来自于同一病毒祖先 ;从时间上看 ,
也可能是中国病毒株通过某种途径传播到老挝和
越南。研究发现东南亚 H5N1病毒的 HA基因来自
Goose /Guangdong/1 /96[ 8 ]。但本研究发现 ,东南亚
各样本已距 Goose /Gongdong /1 /96遗传距离较远 ,
HA蛋白上关键位点氨基酸也有了较多的差异 ,表
明东南亚病毒有了较大的变异演化。
非洲的尼日利亚、埃及和吉布提人样本和西亚
的土耳其、伊拉克和阿塞拜疆 ,及南亚的巴基斯坦样
本具有较近的亲缘关系 ,而与东亚和东南亚样本亲
缘关系较远。西亚和南亚样本与东亚和东南亚样本
的亲缘关系也较远 ,表明非洲毒株来源可能和西亚
及南亚的相同 ,东亚和东南亚毒株与非洲和西亚及
南亚各国的来源不同。
从 HA 基因进化树上的分布看出 ,所选用的各
国人感染的 H5N1病毒分别与其国内家禽感染的
H5N1病毒遗传距离均很近 ,核苷酸和氨基酸相似
性高度一致 (数据未提供 )。而各国在 HA 蛋白上
关键位点氨基酸的变异和进化树的分布上 ,表现出
明显的地域特征 ,形成具有地方性的病毒体系 ,这与
Guan等 [ 9, 10 ]认为病毒遗传和抗原性明显不同的谱
系在亚洲不同地区已经形成 ,病毒具有地域性特点
的看法是一致的。非洲样本与西亚和南亚样本地
域性区分不明显 ,以及中国大陆分支中包括 2007
年越南样本 ,表明在病毒具有地域特点的同时 ,也
存在同一来源的病毒在相邻国家或相近区域相互
散播现象。
致谢 :本文中的工作得到了中国科学院三期创新领域前
沿项目 ( KSCX22YW 2N2063)资助 ,中国科学院动物研究所雷
富民研究员详尽的指导和大力的支持 ,在此一并表示衷心的
感谢。
参 考 文 献
1 W ebster RG, Guan Y, Peiris M, et al. Journal of V irology, 2002, 76
(1) : 118～126.
2 Nobusawa E, Aoyama T, Kato H, et al. V irology, 1991, 182 ( 2 ) :
475～485.
3 Yoshihiro K, Ann N, Dennis J, et al. V irology, 1987, 158 ( 1 ) :
218～227.
4 Jody K, Stacey S, David E, et al. Journal of V irology, 2000, 74 ( 3) :
1443～1450.
5 Stevens J, B lixt O, Jumpey TM, et al. Science, 2006, 312 ( 5772 ) :
404～410.
6 Kawaoka Y, Neave CW , W ebster RG. V irology, 1984, 139 ( 2 ) :
303～316.
7 Senne DA, Pam igraphy B, Kawaoka Y, et al. Avian D is, 1996, 40:
425～437.
8 Hatta M, Kawaoka Y. TRENDS in M icrobiology, 2002, 10 ( 7) : 340
～344.
9 Guan Y, PeirisM, Kong KF, et al. V irology, 2002, 292: 16～23.
10 L i KS, Guan Y,Wang J, et al. Nature, 2004, 430 (6996) : 209～213.
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