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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2009年第 4期
生防木霉菌产几丁质酶特性研究
李世贵
顾金刚
姜瑞波
牛永春
(中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 中国农业微生物菌种保藏管理中心,北京 100081)


摘
要:
通过采取还原糖法对生防木霉菌真菌 2号和真菌 4号菌株在不同发酵时间产几丁质酶活性进行测定, 并对几
丁质酶特性进行初步研究。试验结果表明,同一菌株在不同发酵时间几丁质酶活性大小变化的趋势大致相同 ,真菌 4号在培
养 145 h几丁质酶活性达到最大,真菌 2号在培养 170 h几丁质酶活性达到最大。在相同发酵时间,真菌 4号菌株的几丁质酶
活性比真菌 2号菌株的几丁质酶活性要高。
关键词:
几丁质酶
还原糖法
木霉菌
生物防治
The Research on B iocontrolTrichoderma spp

Strains Producing Chintinase
L iSh igui
Gu Jingang
JiangRuibo
N iu Yongchun
( Institute of Agricultural Resources and R egional Planning , Chinese A cademy of A gricultural Sciences , Beijing 100081)


Abstrac:t
By adopting the direct
v iew ing and accurate me thod o f reve rting sugar, chin tinase activ ity determ ina tion o f the b iocon

trol strains of T r ichoderm a spp
NO
2 and NO
4 stra ins at var ious fermentation tim e was ca rr ied out
The result indicated that the chan

g ing tendency o f ch intinase activ ity o f the identical strain w as approx im a tely same a t the d ifferent ferm entation tim e
The ch intinase ac

tiv ity of fungal stra in NO
4 w as highest after 145 hours. The ch intinase ac tiv ity of fungal stra in NO
2 was highest a fter 170 hours
At
sam e ferm enta tion tim e, the chin tinase activ ity o f the stra in NO
2 w as h igher than that o f the stra in NO
4

Key words:
Ch intinase
M ethod o f reverting suga r
T richoderma spp
stra ins
B iocontro l
收稿日期: 2008
09
10
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 ( 2007年度 ) ,国家科技基础条件平台建设项目 ( 2005DKA21201 )
作者简介:李世贵 ( 1978
) ,男,汉族,湖南省湘阴人,理学硕士,博士研究生,助理研究员,研究方向:微生物分子生物学


真菌寄生是木霉主要拮抗机制之一 [ 1, 2]。在包
括趋向生长、识别、接触、缠绕和穿透等步骤的真菌
寄生过程中,木霉分泌产生的一系列细胞壁降解酶,
如葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等起着重
要的作用,其中以几丁质酶尤为重要 [ 3]。拟对防治
效果较好的两株生防木霉菌真菌 2号和真菌 4号菌
株在不同发酵时间产几丁质酶活性进行测定, 并对
几丁质酶特性进行初步研究,进一步明确几丁质酶
在生防过程中的作用。
1
材料与方法
1
1
胶态几丁质制备
称取几丁质 1 g放入研钵中, 加丙酮 10 m l研磨
10 m in;边研磨边缓缓加入冷浓盐酸 20 m ,l充分研
磨,使呈糊状。于 4
放置 24 h, 之后用玻璃棉过
滤, 将滤液缓缓加入到盛有 5倍体积的 50%乙醇的
烧杯中,边加边剧烈搅拌, 然后静置, 待胶态几丁质
析出后去除清液离心 7 000 r /m in, 15m in,收集胶态
几丁质;用蒸馏水冲洗胶态几丁质至 pH7,以蒸馏水
定容至 100 m ,l冷藏备用。
1
2
DNS溶液的配制
称取酒石酸钾钠 182 g,加入到 500 m l蒸馏水
中, 加热但不超过 50
, 在热溶液中依次加入 3, 5

二硝基水杨酸 ( DNS) 6
3 g, NaOH 21 g, 苯酚 5 g,
NaSO 3 5 g, 搅拌至完全溶解, 冷却后用蒸馏水定容
至 1 000m ,l贮于棕色瓶中室温保存。
1
3
培养基制备
1
3
1
马铃薯葡萄糖琼脂培养基 ( PDA )
马铃薯
200 g; 葡萄糖 20 g;琼脂 20 g;蒸馏水 1 000 m ,l制备
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 4期
成 PDA固体培养基,高压蒸气灭菌后备用。
1
3
2
发酵种子活化液体培养基 ( PDA液体培养
基 )
马铃薯 200 g;葡萄糖 20 g;蒸馏水 1 000m ,l定
容后分装于 250m l三角瓶中高压蒸气灭菌后备用。
1
3
3
发酵用液体培养基
几丁质 0
5 g, M gSO4

7H2O 0
06 g, FeSO4
7H2O 0
01 g, NH 4NO3 0
3 g,
KH 2PO4 0
2 g;用蒸馏水定容至 100 m ,l装入 250m l
三角瓶中高压蒸气灭菌后备用。
1
4
供试菌种
生防木霉菌真菌 2号、真菌 4号菌株。
1
5
缓冲液
0
1M pH5的醋酸 bu ffer。
1
6
几丁质酶活性测定原理
用还原糖法测定几丁质酶活性: 几丁质在几丁
质酶系作用下分解成几丁质单糖

N
乙酰氨基葡
萄糖 (NAG )。加入 DNS溶液后有产生棕红色物质
生成,该棕红色物质在 540 nm处有最大吸收峰,用
紫外 /可见分光光度计测定其在 540 nm处的吸光光
度值。由于颜色的深浅与溶液中起始 NAG的量成
正比, 所以根据反应前后吸光光度值的差异就可以
推测该酶液几丁质酶活性的大小 [ 4]。
1
7
N
乙酰氨基葡萄糖 (NAG )标准曲线的制作
配 3
m ol/m lN
乙酰氨基葡萄糖溶液, 然后取
11支试管, 每支试管中加入 3
mo l/m lN
乙酰氨
基葡萄糖溶液 0、0
2、0
4、0
6、0
8、1
0、1
2、1
4、
1
6、1
8、2
0 m ,l然后补蒸馏水至 2
0 m ,l加入
2
0 m l DNS试剂混合后沸水浴中加热 10 m in, 迅
速用冷水冷却,每管中加入 6 m l蒸馏水, 混合后以
蒸馏水为空白对照, 于 540 nm波长处读取吸光光
度值。将每种浓度做 3个平行组, 结果取平均值,
记作 OD 540nm。以 N
乙酰氨基葡萄糖量 (
mo l)为
横坐标, 以不同浓度 N
乙酰氨基葡萄糖溶液的
OD540nm值为纵坐标作标准曲线, 并由该曲线的趋
势线获得标准曲线函数。
1
8
几丁质酶活性的测定
定义一个酶活力单位 (U )为每分钟产生相当于
1
molN
乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。
酶活性的测定采用 DNS法: 发酵液于 4 000 r/
m in离心 15 m in, 取上清液作为酶液按图 1方法检
测其在 540 nm处的吸光光度值。每个样品作 3个
重复取平均值,记为 OD540nm;与其对照进行比较, 差
值记作
A540nm。根据 N
乙酰氨基葡萄糖标准曲线,
将两组 OD540nm差值折算成还原糖量, 再根据酶活力
单位的定义,可得出几丁质酶的活力。
图 1
几丁质酶活性的测定
1
9
生防木霉菌不同发酵时间几丁质酶活性的
测定
将供试生防木霉菌真菌 2号和真菌 4号分别接
种到 PDA液体培养基中培养 3 d (摇床 190 r/m in,
28
) ,进行活化,然后转接到发酵用液体培养基中
继续培养, 摇床 190 r/m in, 28
, 定期取样, 检测发
酵上清液的几丁质酶活力。
2
结果
2
1
N
乙酰氨基葡萄糖 ( NAG)标准曲线的制作
根据 N
乙酰氨基葡萄糖量标准曲线的制作方
法, 测得每管溶液的 OD540nm值见表 1。
以 N
乙酰氨基葡萄糖量 (
mo l)为横坐标,以不
同浓度 N
乙酰氨基葡萄糖溶液的 OD540nm值为纵坐
标作标准曲线,并由该曲线的趋势线获得标准曲线
函数 (图 2)。
由 N
乙酰氨基葡萄糖 ( NAG)标准曲线可知, N

乙酰氨基葡萄糖的含量与吸光光度值的大小成
正比。
136
2009年第 4期 李世贵等:生防木霉菌产几丁质酶特性研究
表 1
每管溶液的 OD540nm值
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
3
m ol /m lNAG (m l) 0 0
2 0
4 0
6 0
8 1
0 1
2 1
4 1
6 1
8 2
0
蒸馏水 ( m l) 2
0 1
8 1
6 1
4 1
2 1
0 0
8 0
6 0
4 0
2 0
NAG量 (
m ol) 0 0
6 1
2 1
8 2
4 3
0 3
6 4
2 4
8 5
4 6
0
OD 540nm 0 0
093 0
363 0
567 0
810 1
034 1
259 1
523 1
699 1
933 2
125
图 2
N
乙酰氨基葡萄糖 (NAG)标准曲线
2
2
生防木霉菌不同发酵时间几丁质酶活性的
测定
2
2
1
不同发酵时间几丁质酶活性的测定
将生
防木霉菌真菌 2号和 4号菌株转接到发酵用液体培
养基中培养,定期取样,分别检测发酵上清液的几丁
质酶活力。结果见表 2和表 3。
2
2
2
不同发酵时间几丁质酶活性的比较
根据
表 2和表 3的
A540nm值, 以发酵时间为横坐标, 以
不同发酵时间的
A540nm值为纵坐标作出真菌 2号
和真菌 4号菌株不同发酵时间酶活力的变化曲线
(图 3)。
表 2
真菌 2号菌株不同发酵时间发酵上清液的吸光光度值
发酵时间 ( h )
试 验处 理 120 145 170 200 240
反应组 OD 540nm 0
185 0
242 0
234 0
223 0
189
空白组 ( CK ) OD540nm 0
080 0
029 0
003 0
028 0
021

A 540nm 0
105 0
213 0
231 0
195 0
168
表 3
真菌 4号菌株不同发酵时间发酵上清液的吸光光度值
发酵时间 ( h )
试 验处 理 120 145 170 200 240
反应组 OD 540nm 0
370 0
772 0
604 0
560 0
420
空白组 ( CK ) OD540nm 0
073 0
030 0
008 0
023 0
026

A 540nm 0
297 0
742 0
596 0
537 0
394
图 3
真菌 2号和 4号菌株不同发酵时间
几丁质酶活力的变化曲线
由 N
乙酰氨基葡萄糖 ( NAG)标准曲线可知, N

乙酰氨基葡萄糖的含量与吸光光度值的大小成正
比。即发酵上清液中几丁质酶活力的大小与吸光光
度值的大小成正比。由于该反应体系的体积反应时
间完全一样,据此可根据吸光光度值的变化
A 540nm
推算出发酵上清液几丁质酶活性大小的变化, 由此
根据几丁质酶活力的变化可以比较同一菌株在不同
发酵时间几丁质酶活性大小的变化及不同菌株在相
同发酵时间几丁质酶活性大小的变化。
从图 3可以看出, 生防木霉菌真菌 2号和真菌
4号菌株同一菌株在不同发酵时间几丁质酶活性大
小变化的趋势大致相同。真菌 4号菌株在培养 145
h几丁质酶活性达到最大,真菌 2号菌株在培养 170
h几丁质酶活性达到最大。在相同发酵时间,真菌 4
号菌株的几丁质酶活性比真菌 2号菌株的几丁质酶
活性要高。
3
讨论
木霉菌 (Trichoderma spp
)是因最有开发利用
潜力而倍受关注的一类植物病害生物防治微生物,
产生几丁质酶是其主要生防作用机制之一, 产几丁
质酶的特性是筛选、开发和利用木霉生防菌株的重
137
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 4期
要依据。一般采用透明圈法测定微生物产几丁质酶
特性, 以胶态几丁质作惟一碳源制作平板,以平板上
菌落周围透明圈的有无和大小确定菌株是否产几丁
质酶,以及所产几丁质酶的活性大小。木霉菌产几
丁质酶特性的测定大都沿用此法, 但是由于木霉菌
菌丝无色及胶态几丁质平板半透明, 透明圈很难分
辨,因此在应用上存在着很大的局限性 [ 5]。采取还
原糖法这一更为直观、准确的方法来测定生防木霉
菌产几丁质酶活性的大小, 力求提高筛选高产几丁
质酶生防木霉菌株的效率和准确性, 进一步明确几
丁质酶在生防过程中的作用。
参 考 文 献
1
薛宝娣,李娟,陈永萱.南京农业大学学报, 1995, 18( 1 ) : 31~ 36

2
郭润芳, 刘晓光, 高克样, 等. 中国生物防治, 2002, 18 ( 4 ): l80
~ 184

3
LoritoM . T rich oderm a and Gl ioclad ium, 1998, 2: 73~ 79

4
李合生,植物生理生化实验原理和技术.北京:高等教育出版社,
2000, 197~ 199

5
李华,刘开启, 王革.仲凯农业技术学院学报, 2003, 16 ( 1 ) : 19
~ 22

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