全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
毛竹抗逆锌指蛋白基因 cDNA克隆与序列分析
刘志伟 张智俊 杨丽
(浙江省现代森林培育技术重点实验室,临安 311300 )
摘 要: 根据水稻抗逆相关锌指蛋白基因的保守区序列设计引物, 以毛竹基因组 DNA和 cDNA为模板, 采用 PCR方
法, 成功扩增出 1个含有完整阅读框架的 cDNA序列,长度为 495 bp,序列无内含子, 共编码 164个氨基酸, 将其命名为 PeZFP
基因 ( GenBank登录号: F J472953)。氨基酸序列 ( GenBank登录号: ACL01101)的分析结果表明, PeZFP与其他锌指结构蛋白有
较高的同源性, 同水稻锌指结构抗逆蛋白 OSIAP1序列相似性高达 877% , 且其序列 C端具有典型的 AN1类型的锌指结构
Cx24Cx912Cx2Cx4Cx2Hx5H xC,在 N端具有典型的 A20类型锌指蛋白结构, 推测此 PeZFP为植物抗逆 OsIAP1类似基因,在功
能上与毛竹抗逆性相关。
关键词: 毛竹 锌指蛋白 克隆
cDNA Cloning and Sequence Analysis of a Zincfinger Protein Gene
Involved in Stresstolerance in Phyllostachys edulis
L iu Zhiw ei Zhang Zhijun Yang L i
(T he Key Laboratory forM odern Silvicultural T echnology of Zhej iang P rovince, Zhejiang F orestry Co llege, L inan 311300)
Abstrac:t A zincfinger prote in gene from phy llos tachy s edulis, nam ed as PeZFP ( GenBank accession number: FJ472953), w as
cloned through PCR using prim ers des igned according to the zincfinger pro te in genes conserved reg ion of other p lantThe coding reg ion
o f the genom ic clone o f PeZFP is continuous w ithout intronThe cDNA o f PeZFP gene conta ins an open read ing fram e of 495 bp and
codes fo r a prote in of 164 aa ( GenB ank accession number ACL01101) The database search using the am ino ac id sequence as query
show ed high hom o logy to severa l zincfinge r pro te ins, espec ia lly the PeZFP sequence show ed them ax imum hom o logy( 877% identity)
to OS ISAP1 gene ( O ryza sativa subspecies indica stressassociated p rotein g ene ), and it has a typ ically conserved sequence Cx24Cx9
12Cx2Cx4Cx2Hx5HxC (X rep resents any am ino acids ) at the Cterm inal AN 1typ e z inc finger and the Nterm inal A 20 type z inc
f ing erTherefore, it pred icted that the P eZFP could be an importan t determ inan t of s tr ess resp onse in bam boo
Key words: P hy llostachy s edulis Z incfinger pro tein C lon ing
收稿日期: 20090928
基金项目:国家 863!计划项目 ( 2007AA021403) ,浙江省自然科学基金资助项目 ( Y307469 ),浙江省现代森林培育技术重点实验室开放基金
作者简介:刘志伟,男,硕士,研究方向:植物生物技术; Em a i:l lzw 8428@ yahoo com cn
通讯作者:张智俊,男,博士,副教授; Em ai:l csfuzz@j yah oo com cn
毛竹 (Phy llostachy s edulis)属禾本科竹亚科刚竹
属,耐瘠薄, 较抗寒, 是我国竹类植物中分布范围最
广、栽培面积最大、蓄积量最多、经济价值最高的一
个材用和笋用竹种, 在我国林业生产中占有非常重
要的地位。在植物的生长发育过程中, 非生物性胁
迫,如高盐, 高低温等环境胁迫严重影响其正常的生
理代谢,酶、离子通道以及调渗蛋白等 [ 1]来调节自
身代谢来适应环境的影响。锌指蛋白就是其中一个
重要的家族。锌指 ( zinc finger, ZFs)是识别核酸的
一种普遍性蛋白结构元件, 它通过一对半胱氨酸和
一对组氨酸与 Zn2+络合, 自我折叠成一种手指状的
蛋白结构。典型的锌指结构为 C2H2型锌指,此外还
发现有 C2HC, C2C2, C2HCC2C2, C3HC, C2C2C2C2等
结构,包含有该序列的蛋白质通常属于核转录因子
家族 [ 2 ]。研究表明,锌指蛋白在逆境条件下,可通
过与 DNA、RNA结合或与 DNA和 RNA双向结合
来促进或抑制转录, 使植物对非生物胁迫作出
响应。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
现阶段在分子水平上对于毛竹抗逆性的相关研
究还未见文献发表,本研究以毛竹为材料, 获得了 1
个与水稻抗逆锌指蛋白 OSISAP1[ 3]同源的锌指蛋白
基因全长克隆, 命名为 PeZFP ( GenB ank登录号:
FJ472953),并对其序列进行了分析, 以期在分子水
平上开展竹子抗逆性的相关研究工作。
1 材料与方法
11 材料
以毛竹一年生实生苗为材料, 经过瞬时干旱处
理 4 h,取叶片 5 g,采用改良的十六烷基三甲基溴化
铵 ( CTAB )法,提取并纯化基因组 DNA; 选用北京鼎
国的 RNA快速提取试剂盒提取毛竹 RNA。Marker,
Taq plus DNA聚合酶, dNTPs均购自上海生工, 感受
态细胞 DH 5为实验室自备,载体 pMD18T、逆转录
试剂盒 ( TaK aRa AMV V er 30)购自大连宝生物公
司。其他试剂均为国产分析纯。
12 方法
121 PCR扩增 在比较植物锌指蛋白基因序列
保守区的基础上, 设计两对长度均为 20 bp的通用
性引物,并递交上海生物工程技术有限公司合成,其
中嵌套引物为验证序列测序的准确性。
上游引物 P1: 5∀AGCGCGACAAGAAGGATCAG
3∀,下游引物 P2: 5∀TAGTCGTAGCTGCAGCCGTG3∀;
嵌套引物上游引物 NP1: 5∀CCCGGCCACGCAG
AACCTGT3∀, 下游引物 NP2: 5∀ACAGCTCGCCGCAC
CGGCAC3∀。
提取的毛竹 RNA经过逆转录合成毛竹 cDNA
序列, 经过 PCR克隆目的片段。反应体系 ( 25 L)
为 10 # PCR buffer 25 L, M gC l2 ( 25 M ) 20 L,
dNTP( 10 M ) 05 L, 引物 ( 10 M ) 05 L, T aq
plus DNA聚合酶 ( 834 # 105 kat /L ) 03 L, 模板
DNA20 L( 100 ng ) , ddH 2O 167 L。反应程序:
94∃ 预变 5m in, 94∃ 变性 30 s, 55∃ 退火 30 s, 72∃
延伸 30 s, 30个循环, 4∃ 保温。嵌套引物采用相同
的反应体系,退火温度为 60∃ 。
122 目的片段的回收和重组 把 PCR扩增产物
经 1%琼脂糖电泳检测后, 利用 Q IAGEN公司的离
心柱型琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒从琼脂糖凝胶
上回收目的片段;纯化产物与 pMD18T载体 16∃ 连
接过夜, 并转化感受态细胞 DH5, 挑取白色单菌
落, 37∃ 摇菌过夜; 以微量菌液为模板进行 PCR是
否为阳性克隆的验证。
123 目的片段的测序及生物信息学分析 将含
有目的片段的重组质粒寄上海生物工程技术有限公
司进行测序。测定的序列用 BLAST进行同源序列
比对;蛋白的亲疏水性使用 DNAMAN软件分析; 分
子进化树的构建使用软件 MEGA41软件中 NJ法
完成。用 Protparam ( http: / /auexpasy org / too l/pro t
params)分析 PeZFP编码蛋白的氨基酸序列组成、
相对分子质量、等电点等理化性质; 利用 PB IL LY
ON GERLAND ( http: / /npsapb il ibcp fr /cg ib in /
npsa_automatplpage= /NPSA /npsa_hnnhtm l)信息
库对蛋白质序列进行二级结构预测; 利用 TMHMN
( http: / /genom e cbsdtuDk / seRv ices/TMHMM /)
软件进行蛋白质跨膜区预测;利用 Signal P ( http: / /
genomeCbsD tuDk /serves/signal / )程序分析 N末
端信号肽序列; 利用 ProtFun ( http: / /www cbsD t
udk /serv ices /Pro tFun / )分析预测 PeZFP蛋白的功
能。运用 scratch prote in ( http: / /www icsuc iEdu /
baldig /scratch / indexhtm l)对蛋白质的二硫键做出
分析; SW ISSMODEL在线进行 PeZFP同源建模。
2 结果与分析
21 PeZFP基因克隆
以毛竹 cDNA为模板, 通过设定的两对特异性
引物进行 PCR扩增, 得到长度为 500 bp(图 1a)左
右的条带,目的片段进行测序后获得长度为 495 bp
的序列。由于目的片段测序结果与水稻同源基因
OSISAP1在中间区域 (长度 100 bp左右 )差别较大,
设计一对嵌套引物来验证测序的准确性, 经 PCR扩
增出一条 300 bp左右的条带,测序后确定该序列长
度为 285 bp(图 1b)。
另外, 为获悉 PeZFP在基因组水平的结构, 当
以毛竹基因组 DNA为模板,通过设定的一对对外显
子特异性引物 P1 \P2进行 PCR扩增发现, 所得目的
片段的测序结果与以 cDNA为模板克隆出的序列一
致, 表明毛竹基因组中 PeZFP基因编码区无内含子
存在。
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2010年第 1期 刘志伟等:毛竹抗逆锌指蛋白基因 cDNA克隆与序列分析
aM: DNA分子量标记; 1P1 /P2从 cDNA中扩增出的
PeZFP基因产物; 2P1 /P2从 DNA中扩增的 PeZFP基因
产物
bM: DNA 分子量标记; 1NP1 /NP2从 cDNA中扩增出
的 PeZFP基因产物; 2NP1 /NP2从 DNA中扩增的 Pe
ZFP基因嵌套产物
图 1 PCR克隆结果
22 生物信息学分析
221 毛竹 PeZFP锌指结构类型 毛竹 PeZFP基
因长 495 bp,编码 164个氨基酸, 在 16- 50氨基酸
位点之间含有锌指 ZFA20功能域,在 102- 145氨
基酸位点间含有锌指 ZFAN1功能域。利用 BLAST
比对,显示其与以下几种锌指蛋白序列类似,包括粳
稻锌指蛋白 ( AF140722)、籼稻锌指蛋白 ( A2Z2J6)、
拟南芥 锌指 蛋白 ( Q9LH J8 )、玉 米锌 指蛋 白
( NP001100266)、人锌指蛋白 PRE1、小鼠锌指蛋白
( AWP1) ,鲐鱼锌指蛋白 ( NP998204)等。在 PeZFP
蛋白序列的 N端 (图 2a) ,发现具有 4个保守的半
胱氨酸残基,这种结构与抑制细胞凋亡的锌指蛋白
A20类似;在蛋白 C端具有 AN1类型的典型锌指结
构域 [ 3] : Cx24Cx912Cx2Cx4Cx2Hx5HxC, x代表任
意的氨基酸,其中保守的半胱氨酸和组氨酸残基可
参与形成锌指结构 (图 2b)。
aN端的 A20型锌指结构; bC端的 AN1型锌指结构
图 2 PeZFP和其它植物 AN1型锌指结构域的氨基酸序列比较
222 PeZFP锌指蛋白的结构特点和理化性质
用 Pro tparam预测 PeZFP锌指蛋白的理化性质,推测
该蛋白相对分子质量为 17 6982, 等电点为 914;
理论推导半衰期大于 10 h,不稳定参数为 5629,属
于稳定蛋白 ( 40以下为不稳定蛋白 )。PeZFP的二
级结构,在整个区域主要存在 5个螺旋区 ( he lix)和
3个折叠区域 ( sheet), 其余部位均为无规则卷曲
( co il) , 分别占其二级结构的 2805%、732%、
6463%。二级结构中预计可形成二硫键 4个, 分别
在第 121- 137、105- 119、22- 38、108- 126,参与维持
蛋白质构象的稳定。 PeZFP疏水性 /亲水性分析结
果表明 (图 3) ,第 42位亮氨酸 ( Leu)的疏水性最强,
第 6位赖氨酸 ( Lys)亲水性最强。总体来看, PeZFP
属于亲水性蛋白, 这与水稻 OSIAP1等蛋白亲疏水
性性质一致 [ 3]。
毛竹锌指蛋白 PeZFP中有 8个 Ser, 2个 Tyr, 这
些位点可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。另外, 毛
竹锌指蛋白 PeZFP存在 O型糖基化修饰位点有 21
处 ( 12、20、25、34、46、49、50、51、53、54、56、57、87、
91、99、100、106、115、132、138、143) ,但没有发现 N
型糖基化修饰位点。推测 PeZFP经磷酸化和糖基
化修饰后参与逆境胁迫条件下的细胞内信号传导。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
图 3 P eZFP锌指蛋白氨基酸序列的亲水性分析
利用 S igna lP程序分析 PeZFP锌指蛋白 N末端序
列,发现该蛋白没有跨膜区,也不存在信号肽剪切位
点。但通过蛋白质亚细胞定位软件 PSORT预测发
现 PeZFP,在 N端和 C段分别存在一个内质网膜定
位信号的功能域: AQRD和 K IVR。推测该蛋白合成
后进入内质网完成诸如磷酸化等后续加工, 然后以
囊泡形式进行蛋白质运输参与胁迫调控。通过进一
步 ProtFun预测毛竹锌指蛋白 PeZFP的主要功能,
发现此蛋白有调节器官反应的功能以及调节信使核
苷酸合成的作用。结合上述分析初步推断 PeZFP
与植物抗逆胁迫响应蛋白具有类似的功能。
223 毛竹锌指蛋白 PeZFP的同源性比较和进化
树 为了进一步分析 PeZFP和其它植物抗逆锌指
蛋白之间的进化亲缘关系,选取水稻、玉米等多个物
种的锌指蛋白序列进行氨基酸同源性比较发现: 毛
竹 PeZFP与其他植物锌指蛋白同源性在 503%-
877%之间,其中同源性最高的是水稻 (Oryza sativa
japon icG roup) ,同源性高达 877%。在此基础上构
建的系统进化树 (图 4)结果表明,毛竹 PeZFP锌指蛋
白 (ACL01101)与水稻的锌指蛋白 (NP001063521),
属于同一类抗逆功能蛋白; 其次与玉米胁迫响应锌
指蛋白 (ACG38807)、拟南芥 AN1like锌指蛋白、玉
米 AN15蛋白等都存在较近亲缘关系。而与果腐病
菌锌指蛋白、葡萄锌指蛋白、毛果杨锌指蛋白、柑橘
锌指蛋白亲缘关系较远。
图 4 毛竹 PeZFP与其他已知逆境胁迫相关锌指蛋白的系统发生分析
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2010年第 1期 刘志伟等:毛竹抗逆锌指蛋白基因 cDNA克隆与序列分析
224 毛竹锌指蛋白 PeZFP三级结构同源建模
为分析 PeZFP空间结构特点, 通过 SW ISSMODEL
进行其三维结构同源建模,建模结果表明,本研究克
隆的毛竹锌指蛋白 PeZFP中锌指结构域与已知晶
体结构的拟南芥锌指蛋白结构类似 (图 5A)。其中
AN1区有两个反向平行的 折叠 ( strand)和一个
螺旋 ( he lix)。半胱氨酸和组氨酸残基氨基酸残基
分别位于 折叠和 螺旋中, 并通过氢键结合一个
Zn原子,形成锌指结构。另外, 在 PeZFP的 C端也
发现了一个类似 A 20型锌指结构 (图 5B) ,推测 Pe
ZFP可能通过上述两个锌指结构与染色体 DNA结
合, 在转录水平上调控基因的表达。
A1w f l中 AN1型锌指结构; BPeZFP中 AN1和 A20锌指结构
图 5 PeZFP锌指蛋白三维结构同源建模
3 讨论
在生态环境的选择下,植物逐步形成了适应环
境的不同反应机制,尤其是对逆境的反应机制。锌
指蛋白作为抗逆反应机制中重要的一环, 广泛的存
在于生物体中。近年的研究证实, 多种类型的锌指
蛋白主要通过调控基因的转录来适应高温高盐等逆
境,从而使植物在逆境条件下得以生存 [ 3, 6, 7]。
现阶段对于毛竹抗逆性的研究主要通过生理生
化手段,而运用分子生物学手段对其进行研究的报
道还很少。截至目前,还未发现类似研究。本研究
首次从毛竹中获得 PeZFP基因,序列比对分析表明
其与水稻 OsIAP1基因同源性很高,其蛋白序列均同
时含有高度保守的锌指 A20和 AN1结构。其中 A20
结构域, 具有 4个保守的半胱氨酸残基 (氨基酸第
24, 28, 40, 43位 ), C端具有 AN锌指 1结构 ( Cx2
4Cx912Cx2Cx4Cx2Hx5HxC ); 通过进一步同源建模
分析发现,这两个区域均可形成稳定锌指结构,这与
其他植物锌指蛋白空间结构相似。因此推断, Pe
ZFP基因具有类似的植物抗逆功能。尽管 PeZFP蛋
白中仅发现两个内质网膜定位信号, 未发现核定位
结构域,可能不能简单归类为核转录因子,但同水稻
O sIAP1类似,推测其可利用锌指结构域同逆境胁迫
信号转导途径的某些蛋白发生作用, 进行逆境胁迫
的调控 [ 3]。为验证以上分析预测结果,目前正在展
开在非生物胁迫条件下, 毛竹 PeZFP基因的定量表
达试验以及转基因功能验证工作, 初步基因表达分
析结果发现其与毛竹干旱、盐胁迫的响应相关 (数
据待发表 )。总之, 成功获得锌指蛋白基因 PeZFP,
并对其做了细致的生物信息学预测分析,这对于今
后深入研究毛竹抗逆调控机理具有重要意义。
参 考 文 献
[ 1] 赵飞,周波,赵楠,等 小菊锌指蛋白基因 cDNA全长克隆及表
达分析 生物技术通讯, 2008, 19( 1) : 3942
[ 2] 王俊英,尹伟伦,夏新莉 胡杨锌指蛋白基因克隆及其结构分
析 遗传, 2005, 27( 2 ) : 245248
[ 3] Mukhopadhyay A, V ij S, Tyag iAKOverexpression of a zin cf inger
p rote in gene from rice con fers tolerance to cold ehyd ration and sa lt
stress in transgen ic tobaccoProc Nat l Acad Sci USA, 2004, 101:
63096314
[ 4] Thomp son JR, W etzel S, K lerk sMM, et alMuLt ip lex RTPCR detec
tion of four aph idborn e straw berry viruses in fragaria spp incom b ina
tion w ith a p lant m rna specific in ternal con trol J V irol M ethods,
2003, 111 ( 2) : 8593
[ 5] 田路明,黄丛林,张秀海,等 逆境相关植物锌指蛋白的研究进
展 生物技术通报, 2002 ( 6) : 1216
91
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
[ 6] 黄骥,张红生,曹雅君,等 一个新的水稻 C 2H2型锌指蛋白 cD
NA的克隆与序列分析 南京农业大学学报, 2005, 25 ( 2 ) :
110112
[ 7] 黄越敏,胡红红,武从庆.一个逆境诱导表达的水稻锌指蛋白基
因的分离和鉴定 华中农业大学学报, 2006, 6 ( 25) : 581585
[ 8] 王沛,刘瑞娟,沈裕虎,等 拟南芥 A tfin1锌指蛋白的细胞定位
安徽农业科学, 2008, 36( 19) : 80558056
[ 9] 赵楠,赵飞,李玉花 锌指蛋白结构及功能研究进展 生物技术
通讯, 2009, 20 ( 1) : 131134
[ 10] 余晓丹 锌指蛋白结构和功能研究进展 国外医学卫生学分
册, 2004, 31 ( 3) : 171175
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