全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-22
基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向项目(KZCX3-SW-434);湖南省杰出青年基金(03JJY1004)
作者简介:杜洪伟(1980-),男,汉族,在读硕士研究生,从事作物耐逆境分子育种研究
通讯作者:肖国樱,博士,研究员,E-mail:xiaoguoying@isa.ac.cn,Tel:0731-4619770
干旱、高盐和低温是影响严重植物生长发育的非生物胁迫。这些胁迫因子会引起植物细胞脱水,从而
诱导植物体内许多基因的表达。植物的耐旱性是一个复杂的多基因控制系统[1],转单个功能基因作用单一。
干旱响应转录因子可以调控一系列耐旱相关基因的表达,证明是一种更加有效的提高耐旱性的途径 [2]。
DREB(Dehydrationresponsiveelementbindingprotein)转录因子属于 AP2/EREBP(APETALA2/ethylene-respons
iveelementbindingprotein)家族,这一家族包括 DREB1A、DREB1B、DREB1C、DREB1D、DREB2A和 DREB2B,
它在干旱、高盐以及低温胁迫的信号传递中起重要作用,目前研究结果显示转录因子 DREB1A可以调控
40多个与干旱、高盐和低温胁迫有关的功能基因的表达[3~5],因此利用该转录因子来提高植物抗逆性比单
基因的遗传转化更有优势。荠菜是我国广泛分布的一种野生植物,适应性强,其 DREB1A基因是否与拟南
芥一样具有利用价值还未见研究报道。本文报道了拟南芥和荠菜 DREB1A基因的克隆和表达载体构建,期
拟南芥、荠菜DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建
杜洪伟 1,2 陈芬 1 肖国樱 1
(1中国科学院亚热带农业生态研究所,长沙 410125;2中国科学院研究生院,北京 100049)
摘 要: 用PCR方法从拟南芥和荠菜中分别克隆了DREB1A基因。序列分析发现从拟南芥中克隆的AtDREB1A
基因与已发表的 AtDREB1A基因序列(DQ372533)的同源性为 99.69%,首次从荠菜中克隆的 CbDREB1A基因序列
(EF156749)与 DQ372533的同源性为 99.54%。利用这两个基因分别构建了两个诱导表达载体(prd29A/AtDREB1A,
prd29A/CbDREB1A)和两个组成型表达载体(pCaMV35S/AtDREB1A,pCaMV35S/CbDREB1A),以便进一步开展植物抗
旱基因工程研究。
关键词: DREB1A基因 拟南芥 荠菜 基因克隆 表达载体构建
CloningofDREB1AGenefrom ArabidopsisthalianaandCapsela
bursa-pastorisandConstructionofPlant
ExpressionVector
DuHongwei1,2 ChenFen1 XiaoGuoying1
(1InstituteofSubtropicalAgriculture,ChineseAcademyofSciences,Changsha410125;2GraduateUniversityofChinese
AcademyofSciences,Beijing100049)
Abstract: TheAtDREB1A andCbDREB1A geneswereisolatedfrom ArabidopsisthalianaandCapselabursa-
pastorisrespectivelybythemethodofPCR.SequencinganalysisofAtDREB1A indicatedthattheclonedfragment
showed99.69% identitytothepublishedsequence(DQ372533).ThesequenceoffirstlyclonedCbDREB1A gene
(EF156749)shared99.54%identitywiththatofDQ372533.ByusingofAtDREB1AandCbDREB1Agenes,twoinduced
expresionvectors(prd29A/AtDREB1A,prd29A/CbDREB1A)andtwoconstitutiveexpresionvectors(pCaMV35S/AtDREB1
A,pCaMV35S/CbDREB1A)inplantwereconstructed.Theobtainedexpresionvectorscanbeappliedonplantsgenetic
engineeringfordrought-toleranceimprovement.
Keywords: DREB1Agene Arabidopsisthaliana Capselabursa-pastoris Genecloning Expresionvector
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
望比较在 CaMV35S和 rd29A两种类型启动子调控下不同植物 DREB1A基因的作用。
1 材料与方法
1.1 酶和试剂
T4连接酶、各种限制性内切酶、PyrobestTMDNA聚合酶和 DNA凝胶回收试剂盒购自 TaKaRa公司,
pGEM-Teasy载体购自 Promaga公司,加 A反应液购自 TIANGEN公司。
1.2 材料
拟南芥 (Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.,Columbia生态型)由湖南农业大学肖浪涛教授提供,荠菜
(Capselabursa-pastoris(L.)Medic.)采自中国科学院亚热带农业生态所(长沙)玉米地,pCAMBIA3301质粒
由澳大利亚国际农业分子生物学应用中心(CAMBIA)提供,pMD18-T-rd29A质粒由中国林业科学院亚热带
林业科学研究所卓仁英博士提供。
1.3 DREB1A基因及 rd29A启动子 PCR扩增
用 SDS法[6]提取拟南芥、荠菜总 DNA,根据拟南芥 AtDREB1A基因序列(genebankID:DQ372533)设计
PCR引物如下。
F:CCCATGGCAATGAACTCATTTTCTGCTTT(下划线部分为 NcoⅠ酶切位点);R:CGGTCACCTTAATAACT
CCATAACGATA(下划线部分为 BstEⅡ酶切位点)。
PCR反应体积为 50μl,包括 10×bufer5μl,PyrobestTMDNA聚合酶 0.25μl(5U/μl),20mmol/L上游引物
1μl,20mmol/L下游引物 1μl,2.5mmol/LdNTP4μl,模板 DNA1.5μl(约 500ng),ddH2O37.25μl。
PCR反应程序为:96℃ 预变性 5min后,95℃ 1min,53℃ 1min、72℃ 1.5min,35个循环后 72℃延伸
10min。拟南芥 AtDREB1A基因、荠菜 CbDREB1A基因扩增所用的引物、反应体系和反应程序相同。
扩增 rd29A启动子所用引物如下。
F:GGGGAATTCCTGCAAGAATCTCAAACACG(下划线部分为 EcoRⅠ酶切位点);R:GGGCCATGGTCCAA
TAGAAGTAATCAAACC(下划线部分为 NcoⅠ酶切位点)。
PCR反应体系同上,仅模板 DNA使用量降为约 50ng,PCR反应程序为:95℃预变性 3min后,94℃30s、
69.3℃1.5min、72℃1min,30个循环后 72℃延伸 10min。
1.4 AtDREB1A基因、CbDREB1A基因及 rd29A启动子的克隆
从拟南芥、荠菜、pMD18-T-rd29A中扩增出的 DNA片段经 1%的琼脂糖凝胶电泳分离后,用 DNA凝胶
回收试剂盒回收纯化目的条带。回收得到的 3个 DNA片段加 A反应后连接到 pGEM-Teasy载体分别得到
pGEM-Teasy/AtDREB1A、pGEM-Teasy/CbDREB1A和 pGEM-Teasy/rd29A。操作程序见各试剂盒说明书。分别
选择上述 3个质粒载体中 PCR检测呈阳性的克隆送交上海生工生物技术服务有限公司测序。
质粒的提取、酶切,电泳、大肠杆菌感受态的制备、转化参照“分子克隆实验指南”(第 3版)[7]。连接反
应参照 T4连接酶说明书。
2 结果与分析
2.1 rd29A启动子、AtDREB1A基因、CbDREB1A基因的克隆
分别以质粒 pMD18-T-rd29A、拟
南芥基因组 DNA,荠菜基因组 DNA
为模板,用各自特异引物扩增,1%琼
脂糖凝胶电泳分离。结果表明用
PyrobestTMDNA聚合酶扩增的产物跟
预 期 大 小 一 致 , 分 别 为 900bp、
650bp、650bp左右(图 1)。 图 1 rd29A启动子及 AtDREB1A基因、
CbDREB1A基因的 PCR扩增
注 :M::100bp分 子 量 标
记;1:Rd29A启动子目的
条带;2:AtDREB1A基因;
3:CbDREB1A基因
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2.2 PCR扩增片段的序列分析
测序结果表明,rd29A启动子克隆片段与已发表的 rd29A启动子(AY577523)同源性为 99.32%。对启动
子核心元件分析表明,DRE、ABRE、TATAbox、CAATbox和转录起始位点等元件齐全,所以这些差异不会
对启动子的特性造成影响。
克隆的 AtDREB1A基因与已发表的 AtDREB1A基因序列(DQ372533)同源性为 99.69%,仅有 2个碱基
的差异,第 383位的 A变成 G,第 435位的 T变成 C,与李晶等[8]得到的结果一样,说明该生态型跟网上发
表的确有不同。第一次克隆的荠菜 CbDREB1A基因(注册号 EF156749)与已发表的拟南芥 AtDREB1A基因
序列(DQ372533)有 3个碱基的差异,同源性为 99.54%,第 123位碱基是 T而不是 G,第 437位碱基是 G而
不是 A,第 489位碱基是 C而不是 T。
对个基因编码的氨基酸序列比对结果(图 2)表明,从克隆的 AtDREB1A基因推测的氨基酸序列第 145
位由中性氨基酸酪氨酸(Y)变成碱性氨
基酸组氨酸(H);由荠菜 CbDREB1A基
因推测的氨基酸序列第 24位为中性氨
基酸酪氨酸(Y)而不是酸性氨基酸天冬
氨酸(D),第 145位为碱性氨基酸组氨
酸(H)而不是中性氨基酸酪氨酸(Y)。
DREB转录因子的 N末端都含有一段
核定位信号(Nuclearlocalizationsignal),
克隆的 AtDREB1A和 CbDREB1A的第
34~42位的氨基酸序列富含碱性氨基
酸,推测是 DREB1A基因的核定位信号
序列。DREB转录因子 C末端都有一段
酸性氨基酸组成的转录激活域(Acidic
activationregion);中间还有一段 DNA结
合结构域,这段区域非常保守,被称为
AP2/EREBP结构域,处在氨基酸序列的第 50~109位 [9]。分析表明,克隆到的 AtDREB1A基因和 CbDREB1A
基因中碱基的变化没有造成转录激活域和 DNA结合结构域中关键氨基酸的变化,因此不会对蛋白质特性
产生影响。
2.3 中间载体 pCAMBIA3301/rd29A的构建
用 EcoRⅠ和 NcoⅠ双酶切 pGEM-Teasy/rd29A载体,DNA凝胶回收试剂盒回收纯化 900bp左右的小片
段,将此小片段连入用 EcoRⅠ和 NcoⅠ切去 CaMV35S启动子的 pCAMBIA3301载体大片断中,构建成中间
载体 pCAMBIA3301/rd29A(图 3)。
2.4 表达载体的构建
用 NcoⅠ和 BstEⅡ双酶切质粒 pGEM-Teasy/AtDREB1A和 pGEM-Teasy/CbDREB1A后琼脂糖凝胶电泳
分离,回收 650bp左右的小片段,得到小片段替换中间载体 pCAMBIA3301/rd29A和 pCAMBIA3301中的
GUS基因,得到 AtDREB1A基因的诱导型和组成型表达载体 prd29A/AtDREB1A和 pCaMV35S/AtDREB1A
(图 4)。用同样的方法得到 CbDREB1A基因的诱导型和组成型表达载体 prd29A/CbDREB1A和 pCaMV35S/
CbDREB1A(图 5)。各重组质粒经酶切鉴定,大小符合(图 6)。
图 2 从拟南芥和荠菜 DNA序列推测的氨基酸序列 Atpro和 jicaipro
与已发表的 AtDREB1A氨基酸序列(ABD14412)比较
注:矩形框中为差异氨基酸
杜洪伟等:拟南芥、荠菜DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建 101
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
3 讨论
rd29A启动子受干旱、低温、高盐胁迫诱导,在植物细胞缺水时能够大量表达,但 rd29A在细胞不缺水
时并不表达[10],它的启动子区域含有 DRE(dehydrationresponsiveelement,脱水响应元件)和 ABRE(abscisic
acidresponsiveelement,脱落酸响应元件)顺式作用元件。DREB转录因子与 rd29A启动子 DRE核心序列结
合也可以诱导 DREB1A基因的表达。Dubouzet等[11]利用水稻原生质体研究证明 OsDREB1A基因可以结合
到 DRE元件上从而诱导 GUS基因的表达。当水稻受到干旱或低温胁迫时体内会有 DREB1s、DREB2s、bZIP
等转录因子表达,DREB1s、DREB2s等结合到 DRE元件上,bZIP等转录因子结合到 ABRE元件上,这样就
可激活 rd29A诱导的 DREB1A基因,表达的 DREB1A又激活 rd17,kin1,cor6.6,cor15a等干旱及低温诱导表
达的基因,从而使水稻耐旱性增强。干旱条件下水稻 OsDREB1A转录因子对 ACCGAC识别效率不高,而对
DRE核心元件 GCCGAC有较高的识别效率。使用的 rd29A启动子中 DRE、ABRE、TATAbox、CAATbox等顺
式作用元件以及转录起始位点俱全,所以启动子特性不会发生改变。
DREB转录因子属于 AP2/EREBP家族,受干旱、高盐或低温诱导表达,其氨基酸序列 C末端是转录激
活结构域;N末端是核定位信号;中间部分是 AP2/EREBP结构域,这一部分非常保守,含有 58个氨基酸,
能形成 3个 β片层和一个 α螺旋,这两个结构都可以结合到 DRE元件的核心结构 PUCCGAC上[12]。由已发
表的拟南芥 AtDREB1A的 cDNA序列与基因组 DNA序列比较发现,AtDREB1A基因不含内含子,可以通过
DNA直接 PCR扩增 DREB1A基因。扩增得到的拟南芥 AtDREB1A基因在第 145位中性氨基酸酪氨酸 Y变
成碱性氨基酸组氨酸 H,这与李晶等[8]扩增结果一样,可以认为这一序列是这个生态型 DNA本身的序列,
而不是 PCR过程中产生的错误或测序错误。
荠菜是一种常见的野生植物,几乎分布在全国各地,和拟南芥同属于十字花科,具有广泛的适应性。利
图 4 AtDREB1A基因表达载体的构建图 3 中间载体 pCAMBIA3301/rd29A的构建
图 6 质粒载体酶切鉴定
注:M:1kbDNAmarker;1:pCAMBIA3301/rd29A(EcoRⅠ+BstE
Ⅱ );2:prd29A/AtDREB1A (EcoRⅠ +BstEⅡ );3:prd29A/Cb-
DREB1A(EcoRⅠ+BstEⅡ);4:pCaMV35S/AtDREB1A(EcoRⅠ+
BstEⅡ);5:pCaMV35S/CbDREB1A(EcoRⅠ+BstEⅡ)图 5 CbDREB1A基因表达载体的构建
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用扩增拟南芥 DREB1A基因的 PCR引物扩增荠菜 DNA,首次获得了荠菜的 DREB1A基因 (注册号
EF156749),DNA片段与已发表的拟南芥 AtDREB1A基因同源性为 99.54%,仅有 3个碱基的变化;其氨基
酸序列仅有 2个氨基酸残基的变化。这 2个氨基酸残基,一个位于核定位信号附近(即第 24位)是中性氨
基酸酪氨酸(Y)而不是酸性氨基酸天冬氨酸(D),这可能有利于生成的蛋白质往细胞核的运输,因为在
NLS区域主要是碱性氨基酸,这一变化会导致极性减弱而又利于核孔复合体的运输。另一个是第 145位,
为碱性氨基酸组氨酸(H)而不是中性氨基酸酪氨酸(Y)。但是,这两处改变都未涉及 DREB1A基因的关键
元件,因此,推测 DREB1A基因的基本功能不会改变。
CaMV35S启动子控制下的 DREB1A/CBF3基因的过度表达增强了拟南芥对干旱、高盐和低温的抗性,
但是转基因拟南芥的生长受到显著抑制[13~15]。利用胁迫诱导启动子rd29A代替组成性表达的启动子CaMV35S,
使 DREB1A过度表达而产生的对植株生长的负效应显著减小[14,16]。虽然 Ubi1启动子在水稻中的表达比
CaMV35S要强[17],但是Oh等[18]得到的 Ubi1调控的组成型表达 CBF3/DREB1A基因的水稻既没有表现出生
长受抑制,也没有各种表型的变异。由此可以推测转 DREB1A基因的植株生长不正常可能有多种原因,作
为转基因受体的水稻品种、基因的过量表达、DREB1A基因整合的位点等都可能与之有关。在本试验中共
构建了 4个表达载体,即两个诱导表达载体(prd29A/AtDREB1A、prd29A/CbDREB1A)和 2个组成型表达载
体(pCaMV35S/AtDREB1A、pCaMV35S/CbDREB1A)。通过这些载体的转化,可以进一步探讨 DREB1A基因
的表达对水稻生长的影响规律,并找到利用这些基因培育耐旱水稻的理想途径。
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