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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
黑暗链霉菌 DNA同源重组系统的构建
朱碧银1 洪文荣1 严绍德1 朱宝泉2 林玉双3 封成军3
(1福州大学生物科学与工程学院，福州 350108;2上海医药工业研究院，上海 200040;
3常州方圆制药有限公司，常州 213022)
摘 要: 以黑暗链霉菌 Tt-49 基因组为模板，利用 PCR方法，扩增安普霉素生物合成关键基因 aprF-G 的上、下游序列，
作为同源交换臂，并将红霉素抗性基因筛选标记及其启动子插入两交换臂之间，以温敏型质粒 pKC1139 为基础，构建用于阻
断黑暗链霉菌 Tt-49 安普霉素生物合成的重组质粒 pFD8。该质粒通过 E． coli ET12567 /pUZ8002 去甲基化修饰后，经接合转移
进入黑暗链霉菌 Tt-49，利用红霉素抗性筛选得到 3 株阳性转化子，分别命名为 Tt-49 AG1、Tt-49 AG2 和 Tt-49 AG3。通过 PCR
鉴定，证明 pFD8 已插入黑暗链霉菌 Tt-49 基因组的目标位点。以亲株作对照，对 3 株工程菌进行红霉素抗性能力考察，发现 3
株工程菌的抗红霉素能力均高达 1 000 μg /mL以上。
关键词: 黑暗链霉菌 抗生素基因组学 同源重组 安普霉素
Construction of DNA Homologous Recombination System in
Streptomyces tenebrarius
Zhu Biyin1 Hong Wenrong1 Yan Shaode1 Zhu Baoquan2 Lin Yushuang3 Feng Chengjun3
(1College of Biological Science and Technology，Fuzhou University，Fuzhou 350108;
2Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 200040;
3Changzhou Fangyuan Pharmaceutical Co． Ltd．，Changzhou 213022)
Abstract: Two fragments(JHB1 and JHB2)in length of 2 165 bp and 1 853 bp，which are respectively located upstream and
downstream of aprF-G，were amplified by PCR from S． tenebrarius Tt-49 genomic DNA and used as exchange arms． Erythromycin resist-
ance gene(ermE，used as screening mark)and its promoter were inserted into the arms，and the recombinant plasmid pFD8，containing
arms and ermE，for homologous recombination was constructed from thermal sensitive plasmid pKC1139． The plasmid pFD8，after dem-
ethylated by E． coli ET12567 /pUZ8002，was transformed into S． tenebrarius Tt-49 by conjugation． Three positive transformants were se-
lected on MS plate containing 25 μg /mL erythromycin，which are named Tt-49 AG1，Tt-49 AG2 and Tt-49 AG3，respectively． It was
verified by PCR that the plasmid pFD8 has been inserted into the genomic DNA target site of S． tenebrarius Tt-49． The resistant ability
of the three mutants strains to erythromycin are more than 1 000 μg /mL，control with parent strain S． tenebrarius Tt-49．
Key words: Streptomyces tenebrarius Antibiotic genomics Homologous recombination Apramycin
收稿日期:2010-11-04
基金项目:国家自然科学基金项目(31070093 /30801449) ，福建省教育厅科研项目(2007F5070) ，国家综合性新药研究开发技术大平台项目
(2009ZX09301-007)
作者简介:朱碧银，女，硕士研究生，研究方向:生物制药技术;E-mail:zby20051224@ yahoo． com． cn
通讯作者:洪文荣，男，博士，教授，研究方向:微生物制药;E-mail:hongwr56@ 163． com
黑暗链霉菌是重要的抗生素产生菌，有多个次
级代谢产物生物合成基因簇，能合成几十个具有生
物活性的代谢产物，发酵代谢组分复杂［14］，严重影
响了该药用生产菌的品质。黑暗链霉菌的主要组分
是安普霉素、氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素
B［1 － 4］。它们结构相近，但功能不一，且都非常昂
贵，又是医、科学研究和人类健康所必须的重要药
物。但在工业化生产中，要从发酵液中对这些结构
相近的组分进行逐一分离，具体操作极为困难，从而
造成了提取精制难度大、生产成本高和环境污染严
重等不良后果。因此，这些困难一直是科研工作者
的主要攻关难题。若能从菌株品质改良入手，解决
2011 年第 4 期 朱碧银等:黑暗链霉菌 DNA同源重组系统的构建
多组分问题，则提取分离、层析精制等难题均可迎刃
而解，工业化污染将大大降低。
为了实现高产、优质、环保和低耗的目标，需要
逐一阻断出发菌株中的不同生物合成代谢信息流，
从而获得单组分的优质菌株;要达到这一优化目的，
需要构建 DNA同源重组系统，以阻断某一组分的合
成，而构建该系统的关键在于寻找合适的载体，并在
载体上安装能在药用微生物中表达的筛选标记。国
内外学者在抗生素工业化生产菌的改良研究中，投
入了大量的工作，使其成为当前学科研究的热点，但
在黑暗链霉菌工业化菌株改良以实现产业化方面，
收效甚微。为此，针对产业化生产菌品质优化，构建
黑暗链霉菌次级代谢生物合成信息流操作体系，就
变得既重要，又适用。本研究正是围绕这一主题进
行系统性探索，借助现代基因工程技术，对黑暗链霉
菌品质改良进行探索，构建黑暗链霉菌 DNA同源重组
系统，为后续分别阻断安普霉素和(或)妥布霉素等生
物合成途径奠定基础，期望实现已有工业化高产菌的
品质优化。该探索性研究取得了较好的预期效果。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 质粒与菌株 克隆载体 pMD19-T 购自
TaKaRa 公司。E． coli DH5α、ET12567 /pUZ8002、
pUC19、pQBI63(含有完整的 GFP 序列)和链霉菌 －
大肠杆菌穿梭质粒 pKC1139(含安普霉素抗性基因
和接合转移起点 oriT，温度敏感型质粒)为本实验室
保存。质粒 pAGe 与 pBS-VII-41F 分别含有红霉素
抗性基因(ermE)与红霉素抗性基因启动子基因
(ermE* ) ，由上海医药工业研究院邵雷博士惠赠。
黑暗链霉菌 Tt-49 为实验室选育和保藏。
1． 1． 2 抗生素与培养基 E． coli 培养基为 LB，根
据特性添加抗生素，相应培养基中使用的氨苄青霉
素终浓度为 100 μg /mL，卡那霉素和安普霉素的终
浓度均为 50 μg /mL，红霉素与氯霉素终浓度均为
25 μg /mL;黑暗链霉菌斜面培养基(HSB)、种子和
发酵培养基见参考文献［5］，培养基中使用的红霉
素抗性和萘啶酸的终浓度为 25 μg /mL;接合转移使
用 MS培养基［6］。
1． 1． 3 主要试剂 限制性内切酶、Taq 酶、T4 DNA
连接酶和 DNA marker 购自 TaKaRa 公司。DNA 回
收试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司。
1． 2 引物设计
以 GenBank中公布的安普霉素生物合成基因簇
序列(AJ629123)为模板，设计扩增交换臂的正、反向
引物，并引入后续克隆所需要的酶切位点。上游交换
臂(JHB1)扩增引物:JH7:5-GAATTC GGATCCTTC-
CAGCGGCGGGCCCAGATCTTTT-3(方框部分为 EcoR
I酶切位点，下划线部分为 BamH I 酶切位点) ;JH8:
5-GGTACC ACTAGTTGGACGGATATCGGCTCAAC-3
(方框部分为 Kpn I酶切位点，下划线部分为 Spe I 酶
切位点)。下游交换臂(JHB2)扩增引物:JH9:5-
AGATCT CTCGAGTGGTGGAGACCGAGTCGCAGCGCC-3
(方框部分为 Bgl II 酶切位点，下划线部分为 Xho I
酶切位点) ;JH10:5-AAGCTT AGGTCGGCCGAG-
GCCATCAG-3(方框部分为 Hind III酶切位点)。验
证筛选标记插入基因组的 PCR 引物为:GFP1:5-
GATCCTCAGTTGTACAGTTC-3; GFP2: 5-GCTAG-
CAAAGGAGAAGAACTCTTC-3;Py1:5-GAAGAAGTGC-
CC-CGAGTGGT-3，Py2:5-CCACACTGGACATGGCGA-
TC-3;Py5:5-GGAGAGGGTGAAGGTGATGC-3，Py6:5-
TAGACGGGGACCTGGTTGTC-3。所有引物均由上海
生物工程技术服务有限公司合成。
1． 3 转化方法
大肠杆菌感受态制备和转化使用 CaCl2法
［7］;
重组质粒导入黑暗链霉菌采用接合转移法［8］。
1． 4 DNA的提取
黑暗链霉菌 Tt-49 染色体 DNA 的提取见参考
文献［8］;质粒 DNA提取采用碱裂解法［7］。
2 结果
2． 1 同源重组臂的扩增与克隆
根据已经公布的安普霉素生物合成基因簇序列，
通过软件在线比对分析及功能推测，锁定安普霉素生
物合成的关键基因 aprG、aprF作为靶序列，并对靶序
列的上、下游片段进行克隆，作为同源交换臂。上、下
游同源重组臂(JHB1、JHB2)的长度分别为 2 165 bp
和 1 853 bp，其扩增序列电泳检测结果见图 1，将扩增
产物分别克隆至 pMD19-T 上，得重组质粒 pFD1 和
pFD2，两重组质粒酶切鉴定结果见图 2。
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1，2． JHB1;3． DL5000 Marker;4，5． JHB2
图 1 JHB1 和 JHB2 PCR产物电泳检测图
1． pFD1 /EcoR I;2． pFD1 /Kpn I;3． pFD1 /EcoR I /Kpn I;
4． DL5 000 Marker;5． pFD2 /Bgl II /Hind III;6． pFD2 /
Hind III;7． pFD2 /Bgl II
图 2 质粒 pFD1 和 pFD2 酶切电泳检测图
2． 2 同源重组质粒的构建
重组质粒 pFD5 的构建:利用克隆载体 pUC19
上的多克隆位点 Hind III、BamH I、EcoR I 和 Kpn I，
pQBI63 和 pFD2 经 Hind Ⅲ /Bgl II 双酶切后回收
GFP片段(1 124 bp)和 JHB2 片段(1 853 bp) ;pFD1
经 EcoR I /Kpn I 双酶切后回收 JHB1 片段(2 165
bp) ;按试验设计的流程，经酶连、转化和筛选等操
作，得到目标重组质粒 pFD5。
pFD6 的构建:用 Kpn I 分别单酶切质粒 pFD5
和 pBS-VII-41F，回收 pFD5 酶切后的片段(7 478
bp)和含有 ermE* 基因的片段(469 bp) ，酶连构建
重组质粒 pFD6，其阳性克隆子经酶切鉴定，结果见
图 3。若 ermE* 基因正向连接，经 Hind III /Sac I 双
酶切后产生两条大小分别为 5 261 和 2 686 bp 的
带;若 ermE* 基因反向连接，用 Hind III /Sac I 双酶
切后则产生两条大小分别为 4 798 和 3 149 bp 的
带。由图 3 可知，预测结果与实际酶切结果相符，筛
选得到了正向连接的目标质粒 pFD6-9。
1． DL5000 Marker;2． pFD6-3 /Hind III /Sac I;
3． pFD6-9 /Hind III /Sac I
图 3 pFD6 酶切验证示意图
pFD8 的构建:再用 EcoR I /Hind III 分别酶切
pKC1139 和 pFD6-9，回收目标条带(6 419 和 5 312
bp) ，酶连构建重组质粒 pFD7。最后利用 pFD7 上
单一的酶切位点 Xba I，将 ermE 基因以 Xba I /Spe I
(Xba I 与 Spe I 为同尾酶)插入，构建穿梭质粒
pFD8，其酶切电泳图见图 4。若 ermE基因是正向插
入，EcoR I /Xba I 双酶切后产生两条大小分别为 10
837 与 2 703 bp的目标条带;若 ermE基因是反向插
入，用 EcoR I /Xba I 双酶切后则产生两条大小分别
为 9 028与4 512 bp的目标条带。图4与预测结果相
符，pFD8-1为反向插入，pFD8-2为正向插入(图 5)。
2． 3 同源重组质粒 pFD8 抗性能力的考察
为了进一步考察正、反向插入是否影响穿梭质
粒 pFD8 抗红霉素的能力，分别将含有 pFD8-1、
pFD8-2 的 E． coli DH5α 接种于含有不同浓度红霉
素的 LB培养基中培养，浓度梯度分别是 0、30、50
和 80 μg /mL。以 E． coli DH5α /pKC1139 作对照，结
果显示，pFD8-1 抗红霉素能力约为 30 μg /mL，
pFD8-2 抗红霉素能力为 50 μg /mL，因此，满足抗性
筛选要求，结果见表 1。
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1，9． pFD7 /Xba I;2． pFD8-1 /Xba I;3． pFD8-1 /EcoR I;
4 ． pFD8-1 /EcoR I /XbaI;5 ． marker(λ-EcoT14) ;
6． pFD8-2 /EcoR I /Xba I;7． pFD8-2 /EcoR I;8． pFD8-2 /Xba I
图 4 pFD8-1 /2 酶切验证示意图
图 5 穿梭质粒 pFD8-2 的图谱
表 1 pFD8-1 /-2 抗红霉素能力
质粒
红霉素浓度(μg /mL)
0 30 50 80
对照组 + + + - - -
pFD8-1 + + + + - -
pFD8-2 + + + + + + -
“ + + +”表示生长，且菌株浓度高;“ + +”表示生长，且菌株
浓度一般;“ +”表示生长，且菌株浓度低;“-”表示不生长
2． 4 同源重组菌株的筛选与验证
将上述穿梭质粒 pFD8-1、pFD8-2 分别转化 E．
coli ET12567 /pUZ8002，再通过接合转移将其导入黑
暗链霉菌 Tt-49。由于穿梭质粒 pFD8 拥有温敏型
复制启动子，当培养温度超过 34℃时，该游离质粒
在链霉菌中不能自我复制。因此，转化后直接置于
35℃下培养，在平板上培养 17 h 后，覆盖红霉素和
萘啶酸，长出的菌落可能为穿梭质粒 pFD8 插入到
染色体上的重组工程菌。为进一步验证 pFD8 是否
插入到染色体上，考虑黑暗链霉菌 Tt-49 的染色体
DNA中无绿色荧光蛋白(GFP)基因，而阳性转化子
则因从质粒 pFD8 中带入了 GFP基因，因此，以 GFP
基因序列为模板，设计引物，进行 PCR鉴定。
筛选到的阳性工程菌 Tt-49 AG1、Tt-49 AG2 和
Tt-49 AG3，在含萘啶酸和红霉素的 HSB 培养基经 3
次传代培养，彻底清除 E． coli ET12567 /pUZ8002 /pFD8，
然后提取染色体 DNA，进行进一步 PCR 验证，结果
得到了清晰的、对应于 GFP基因的 722 bp条带。
为了验证外源 DNA 是否在靶序列实现同源交
换，设计了两对引物 Py1 /Py2(覆盖 JHB1 上游染色
体 DNA到 ermE* 基因，2 703 bp)和 Py5 / Py6(覆盖
GFP基因到 JHB2 下游的染色体 DNA，2 576 bp)。
若 JHB1 发生同源单交换，将得到 2 703 bp 的目标
条带，且 Py5 和 Py6 扩增不出目标产物;若 JHB2 发
生同源单交换，将得到 2 576 bp 的目标条带，且 Py1
和 Py2 扩增不出目标产物;若发生双交换，则两对引
物均能扩增出目标产物(2 703 和 2 576 bp)。通过
PCR验证，证明 3 个突变株均为单交换菌株，且均是
发生在 JHB2 上(图 6)。
1． DL5000 Marker;2． Tt-49;3，4，5． Tt-49 AG1，2，3
图 6 PCR验证电泳检测图
2． 5 同源重组菌 Tt-49 AG抗性能力的考察
为了考察 ermE基因在单交换菌株中的表达能
力，以亲株为对照，将单交换菌株进行梯度稀释，分
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别涂布于含有不同浓度红霉素的 HSB平板上，浓度
分别为 50、100、200、500 和 1 000 μg /mL，35℃培
养 1 d后，不同浓度的红霉素抗性平板上均有大量
菌落生长。因此，认为单交换菌株 Tt-49 AG1、Tt-
49 AG2 和 Tt-49 AG3 的抗红霉素能力高达 1 000
μg /mL以上，所构建的 DNA 同源重组系统达到了
预期目标，ermE 基因抗性能力在黑暗链霉菌 Tt-49
中能实现高水平表达，但绿色荧光蛋白(GFP)基
因没有实现表达，或者说没有达到肉眼可见的表
达水平。
3 讨论
大多数链霉菌能表达一种强大的限制系统，该
限制系统能够干扰包含大量插入 DNA 的双链质粒
的导入。与原生质体转化相比，通过大肠杆菌的接
合转移来介导 DNA进入链霉菌或其他放线菌，既能
防止宿主限制问题，又能增强质粒插入或整合到染
色体上的频率［8，9］。本研究正是通过重组质粒转化
到甲基化缺陷型的 E． coli ET12567 后再进行接合转
移，将外源 DNA导入到黑暗链霉菌 Tt-49，可以绕过
宿主的限制系统，从而大大提高了转化效率。
经过 PCR 验证，证明筛选到 3 个单交换突变
株，且均是 JHB2 发生交换。此外，穿梭质粒 pFD8
中 ermE基因在 E． coli中的表达能力比较弱，而当该
质粒插入到黑暗链霉菌 Tt-49 染色体上后，ermE 基
因表达能力大大增强。这可能是 ermE* 的启动能
力受到环境的影响所致。ermE* 虽为组成型启动
子，但其来源于链霉菌，故在细菌中的启动能力远远
低于在链霉菌中的启动能力。ermE 基因的高水平
表达，说明所构建的 DNA同源重组系统可用于阻断
黑暗链霉菌 Tt-49 中安普霉素生物合成信息流，为
抗生素产生菌的品质优化和可能存在的新型代谢产
物的获得提供了切实可行的操作平台。
黑暗链霉菌 DNA同源重组系统的构建，将为该
抗生素产生菌的遗传学背景研究提供基础，并为重
要抗生素的后续开发、生产和优化提供了一种新的
思维。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)
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